專利名稱：一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記、試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記、試劑盒及其檢測方法，具體地涉及MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其與卵巢癌的相關性，及檢測這些SNP的方法和試劑盒，屬于分子生物學和醫(yī)學領域。
背景技術：
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，2008年全球新發(fā)病例225500人，死亡140200人。由于起病隱匿，癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屆晚期，晚期卵巢癌患者5年生存率僅為30 45%左右，預后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高達90%，這提示我們提高卵巢癌患者預后和生存的關鍵是早診、早治，因此探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制，尋找鑒定卵巢癌易感人群的分子標記，卵巢癌患者分子分型和預后預測的分子標記，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義?，F(xiàn)有技術中，雖然已經(jīng)有超過200個候選基因和20個遺傳區(qū)域的1100個遺傳變異與卵巢癌易感性相關，但是與卵巢癌相關性很強的遺傳變異卻很少。并且沒有MTDH基因SNP與卵巢癌相關性的報道。因此，本領域急需進一步尋找卵巢癌易感基因，開發(fā)檢測卵巢癌高危人群和易感個體的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本申請的發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析，首次發(fā)現(xiàn)MTDH和卵巢癌易感性密切相關，可作為卵巢癌易感性檢測或者早期診斷的分子標記，因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示， 其與正常的MTDH基因相比，區(qū)別在于第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A，即第231位的堿基包括堿基G和堿基A兩種情形，當為堿基G時，為正常的MTDH基因，當為堿基A時，為突變的MTDH基因gctacaaatt agtaggaaaa gaatagtgcc gcccacgggc tttccaactt ttgaattctg 60gggactaaca acagagagca agagtgaatg agccaaacga cgcaaacgtg ccctcgccag 120gctggcaact ggtaggcacg cagtgtatta gttgccctgg agagaaacac cctggagaga 180aatacccaat ttgtgaacta aacctaggtc ccggaagaac agtgttcggc rtcagactcc 240231 位，r = G 或Agttgagctca ttctggaagg atccaactgg cgccaccagg gagaaaaagc gattccacct 300caataacact ccagaaaaag gcatgaagag ccctatacct gccagggcga ctttgaccta 360
gacccggtga cccggttcct agcgctgcag ccctacccgc cccccgcccg cccccgcctt 420gcacggagcc cctcctctgt actcattcgt tgcgccacgt ctcctaactc tgcgccacca 480gccaccccgc gaaggcgtcc accaattaac ccctcccagc ttctggtcta cagtaacggg 540tccccaacgc cgcgtcttaa ccaggcccga accgaccacc gccaaccttc cctgacacgc 600ctttgcccca cccgaccccg cccgccccca cgtgacgccc acgccccgcc cactggcgcc 660cacgtgaccc acggtcgtcc ccgcgcgcgg cgtggatcgc ggcccaagcc gccattgttc 720cgccgaggga ggacagcggg gcctggcgct ggcgccgaga cgccgcttag cggccgccac 780 tggagacact ccctcccgcc tcccgggtct cctggcggcg gcggagtgag gctgacagcg 840gggaacctgg gagacccctc cgccctcccc gcggtggcag cggccgatcc ccggctccgg 900cgcgagggac ggccgcgatg cgctcggcct gaggttaccc ggcccggccc ttcctcgctt 960ccctcgacta ttccactgcg tctccgcgcc ccggcgtcat cctgcgagtc cctctgacgg 1020gagggaagat ggctgcacgg agctggcagg acgagctggc ccagcaggcc gaggagggct 1080cggcccggct gcgggaaatg ctctcggtcg gcctaggctt tctgcgcacc gagctgggcc 1140tcgacctggg gctggagccg aaacggtacc 1170一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQID NO :2和SEQ ID NO :3的序列，能夠特異性的擴增MTDH基因的引物，能特異性地擴增出長度 200 2700bp。進一步地，試劑盒還包括PCR反應液，PCR反應液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer組成。PCR反應液中各組分的用量關系為常規(guī)的，對所屬領域技術人員而言是公知常識。一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，步驟如下(I)用MTDH基因特異性引物擴增樣品的MTDH基因，得到擴增產(chǎn)物；所述引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列；(2)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A;231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。一種對個體的卵巢癌易感性或患病風險進行檢測或診斷的方法，步驟如下檢測該個體的MTDH基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的MTDH基因、轉錄本和/或蛋白進行比較，存在差異就表明該個體患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差異是指是否存在單核苷酸多態(tài)性231G>A ；231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。本發(fā)明的用于檢測卵巢癌易感性的分子標記、試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，檢測簡單、準確、快速，特異性強，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1 MTDH基因突變的檢測及與卵巢癌的關聯(lián)分析1.1研究對象選取卵巢癌患者145例，2008年9月 2011年4月于山東大學齊魯醫(yī)院確診治療，臨床資料從病歷獲得。年齡匹配的對照病人254例，為齊魯醫(yī)院健康體檢中心健康查體婦女。大部分受試者均為山東省內漢族居民。取受試人員外周血1. 5ml，于-80°C冷藏保存。所有受試人員均按照山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會要求征得同意。1.2DNA 提取用常規(guī)酚氯仿法提取受試者外周血DNA，具體如下(I)取400ul血加于1. 5ml離心管中。(2)加入 800ul PBS,混勻，3500g，15min，棄上清；重復一遍。(3)加入 400ul 裂解液，37°C，lh。(4)加入蛋白酶 K 4ul,濃度 200ug/ml。(5) 55°C水浴消化過夜(4_12h)。(6)加入400ul的Tris飽和酹,混合搖動lOmin。(7) 5000g，15min，取水相。(8)加入 IOOul NaAc，800ul 無水乙醇，-20°C，20min。(9) 12000g, 5min,棄上清。(10) 600ul 70% 冰乙醇，12000g，5min，棄上清，重復一次。(11) 12000rpm離心，10分鐘。棄上清，晾干。溶于100 μ I TE。(12)測定濃度和純度，分裝，凍存于_80°C。1. 3引物、PCR擴增和測序從GenBank 下載 MTDH 基因組序列(Gene ID: 92140 ；Nucleotide AC_000140. 1G1: 157734173)，用primer premier5. 0設計引物。具體引物詳細信息見表I。表I引物序列表
權利要求
1.一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NOI所示，第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A，即第231位的堿基包括堿基G和堿基A兩種情形。
2.一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于還包括PCR反應液，PCR反應液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer組成。
4.一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟如下 (1)用MTDH基因特異性引物擴增樣品的MTDH基因，得到擴增產(chǎn)物；所述引物為一對，具有 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 的序列； (2)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A;231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A。一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列。一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，步驟如下(1)用MTDH基因特異性引物擴增樣品的MTDH基因，得到擴增產(chǎn)物；(2)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A。本發(fā)明的用于檢測卵巢癌易感性的分子標記、試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，檢測簡單、準確、快速，特異性強。
文檔編號C12N15/12GK102994512SQ20121046420
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者孔北華, 劉曉燕, 苑存忠 申請人:山東大學齊魯醫(yī)院