專利名稱：一種Ⅱ型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)及預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是聯(lián)合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標(biāo)記，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661), KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態(tài)性位點，在經(jīng)過風(fēng)險評估模型的計算分析，可以評估和篩選受檢者的II糖尿病易感性(susceptibility)。
背景技術(shù)：
在2000年全球有糖尿病患者1.51億，而目前全球有糖尿病患者2.85億，按目前的增長速率，估計到2030年全世界糖尿病人口將增長到5億，其中發(fā)達國家將由5100萬增長到7200萬，增長率為42 %，而發(fā)展中國家將由8400萬增長到2億3000萬，增長率達到了170%。近年我國糖尿病發(fā)病率持續(xù)升高，由1980年的I %上升至2008年9.7%。目前糖尿病患者突破9800萬人，其中90%以上是II型糖尿病，所以也是最常見的糖尿病。其特點是胰島素抵抗，即體內(nèi)組織對胰島素的作用不敏感，正常量的胰島素起不到正常的降血糖作用，或胰島素分泌不足。包括中國人在內(nèi)的亞洲人種的II型糖尿病患者往往并不伴有肥胖等特征。研究表明，在未來20年里，中國糖尿病人群以高于2倍的速度增長，亞洲將會成為最嚴重的發(fā)病區(qū)域。糖尿病及其慢性并發(fā)癥嚴重威脅人類健康和生命。大量研究表明，II型糖尿病(T2DM)是一種多基因遺傳病，是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的，以胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙為特點的疾病。遺傳因素增加了機體發(fā)生II型糖尿病的危險性。其中主效基因起主要作用，次效基因起較小作用，不同基因之間還可能存在交互作用。脂聯(lián)素(A diponectin)是由脂肪細胞特異性分泌一種膠原樣細胞因子，存在于血循環(huán)中的一種激素蛋白。脂聯(lián)素由244個氨基酸組成，脂聯(lián)素在血漿中含量豐富。有研究表明，血漿脂聯(lián)素具有抗動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗、降血糖、抗炎等生物學(xué)作用。低脂聯(lián)素濃度可增加代謝綜合征及II型糖尿病的風(fēng)險。人脂聯(lián)素基因(Adiponectin gene或者APM1)是單拷貝基因，定位于染色體3q27，大小為17kb，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。全基因組掃描顯示該區(qū)域存在II型糖尿病(T2DM)和代謝綜合征的易感位點。Q)K5 (細胞周期素依賴激酶5, cyclin-dependent kinase 5)在高糖毒性的作用下可導(dǎo)致β細胞變性。Q3KAL1 (Q)K5調(diào)節(jié)亞單位相關(guān)蛋白I類似物I, cyclin-dependentkinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like I)基因編碼的蛋白質(zhì)能夠抑制CDK5的活化。若CDKALl基因發(fā)生變異，則對CDK5失去抑制作用，會導(dǎo)致β細胞功能受損，胰島素分泌減少?？梢?，⑶KALl基因位點發(fā)生變異，與人群中胰島素分泌缺乏有關(guān)。rs57754840位于⑶KALl基因的第五個內(nèi)含子，是與II型糖尿病遺傳易感性密切相關(guān)的SNP。⑶KALl基因rs7754840有G、C兩種等位基因。G為主效基因，C為次要基因，出現(xiàn)G-C變異，則CDKALl對CDK5的抑制作用減弱，會導(dǎo)致β細胞功能受損，因此C為導(dǎo)致糖尿病出現(xiàn)的高風(fēng)險等位基因。正常人群中c%的發(fā)生頻率在40%左右。TCF7L2(轉(zhuǎn)錄因子 7 類似物 2，transcription factor 7 like2)基因可能是 T2DM的主要致病基因之一。TCF7L2基因位于染色體10q25，全長217，226bp。由14個外顯子和13個內(nèi)含子組成。共編碼619個氨基酸。其表達產(chǎn)物是一組具有高度變異性的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子在維持血漿葡萄糖的穩(wěn)態(tài)中起重要作用。2006年Florez等通過3年的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)rsl2255372和rs7903146兩個位點與糖尿病病情的進展有關(guān)，它們可以增加那些糖耐量減低患者患糖尿病的風(fēng)險。Sale等發(fā)現(xiàn)位點rs7903146和rs7901695與居住在美國的非洲人的糖尿病腎病有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，rs7903146的基因變異型是與II型糖尿病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性最強的基因。TCF7L2是目前為止發(fā)現(xiàn)的與II型糖尿病的發(fā)病關(guān)系最密切的易感基因之一，并且在不同種族的人群中有很好的重復(fù)性。TCF7L2基因變異增加II型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險，可能是通過其在糖尿病患者的胰島β細胞中的過表達，fct信號通路異常以及胰島β細胞對前胰島素加工障礙等途徑最終導(dǎo)致了胰島素分泌障礙和胰島素作用下降。CDKN2A和CDKN2B定位于第9號染色體9Ρ21上，CDKN2A/CDKN2B分別編碼抑癌因子pl5INK4a和pl6INK4b。后者能抑制⑶K4活性。而⑶K4 (細胞周期素依賴激酶4)能有效調(diào)節(jié)胰腺β細胞增殖。若CDKN2A /2B基因附近的rsl0811661發(fā)生變異，使得CDKN2A/2B基因產(chǎn)物過度表達，將會顯著抑制CDK4活性，進一步會影響β細胞的分泌功能，使胰島素分泌減少，導(dǎo)致II型糖尿病的發(fā)生風(fēng)險升高。有臨床研究表明，⑶ΚΝ2Α/2Β基因rsl0811661有T/T、T/C、C/C三種基因型，II型糖尿病組危險等位基因T/T純合子頻率為37.5%，危險等位基因T%為59.5%，均顯著高于正常對照組。T等位基因攜帶者患糖尿病的風(fēng)險為C等位基因攜帶者1.38倍。KCNQl基因定位于第11號染色體11ρ5，編碼676個氨基酸組成的蛋白，其生理作用是電壓依賴性鉀離子通道家族的成員之一。以Yasuda等為首的日本國際醫(yī)療中心研究小組比較II型糖尿病患者和普通人，發(fā)現(xiàn)位于KCNQl基因內(nèi)區(qū)的rs2237892的變異，使II型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險將增加1.3-1.4倍。黎懷星和林旭等人以3210名漢族居民作為研究人群，系統(tǒng)地分析了 KCNQl 基因上的 rs2074196, rs2237892, rs52237895 和 rs522375973多態(tài)性位點與II型糖尿病及其相關(guān)表現(xiàn)型的關(guān)聯(lián)關(guān)系。發(fā)現(xiàn):rs2237892、rs52237895和rs2237s973位點均與II型糖尿病的患病風(fēng)險存在著顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系,其增加患病風(fēng)險分別高達32.5%，18.8%和35.8%。這些位點均與β細胞功能受損相關(guān)聯(lián)。由這些多態(tài)性位點的危險等位基因所組成的單倍體型也與II型糖尿病患病風(fēng)險和β細胞功能指數(shù)之間存在著很強的關(guān)聯(lián)關(guān)系。研究結(jié)果提示，KCNQl基因是中國漢族人群的一個主要的II型糖尿病基因。張留偉等研究共納入7篇論文，得到7764例II型糖尿病患者和8937例對照，經(jīng)Meta分析結(jié)果顯示，KCNQl基因rs2237892位點C等位基因能夠增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(OR =1.300,95% Cl:1.234 1.366)，CC/TC基因型是II型糖尿病的危險基因型(0R =1.453,95% Cl:1.279 1.651)。人VDR基因全長約4605個堿基對，包括一段115bp非編碼的前導(dǎo)序列，一段1281bp的編碼序列以及一段3209bp的3端非編碼序列。VDR基因位于染色體第12ql3，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。維生素D通過與VDR結(jié)合發(fā)揮其生物活性作用，例如胰島β細胞表達維生素D受體和維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白(calbindinD28k，CB)，這提示維生素D可影響胰島素分泌及控制β細胞生長與分化。研究顯示，VDR基因多態(tài)性位點(FokI)與口服葡萄糖耐量后胰島素分泌增加或減少有關(guān)。VDR基因位點單核苷酸多態(tài)性可影響VDR轉(zhuǎn)錄活性的變化。因此，VDR(Fok I)基因已經(jīng)作為II型糖尿病的候選基因。SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8,鋒轉(zhuǎn)運蛋白 _8)基因核苷酸序列全長41617bp，含8個外顯子，在染色體上定位在8q24.11。SLC30A8基因編碼369個氨基酸的蛋白質(zhì)。研究表明SLC30A8編碼的是一種在胰島細胞大量表達的鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白，是一種多次跨膜蛋白，并且蛋白經(jīng)過了多種形式的修飾。其主要功能是將胞漿內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運到胰島素分泌囊泡中，參與胰島素合成、儲存和分泌的重要功能。多項GWAS研究發(fā)現(xiàn)，SLC30A8基因rsl3266634多態(tài)性位點的C等位基因是中國人II型糖尿病的風(fēng)險等位基因。

發(fā)明內(nèi)容
基于循證醫(yī)學(xué)的基本原則，采用病例-對照研究和隊列研究相結(jié)合的方法，并將回顧性研究與前瞻性研究相結(jié)合，通過文獻檢索、證據(jù)評價、信息提取、H-W遺傳平衡檢驗、同質(zhì)性檢驗、大樣本Meta分析等一系列嚴格的篩選和實驗驗證過程，綜合考慮和分析各個基因位點與II糖尿病的關(guān)聯(lián)度(0R值)、人群中基因型發(fā)生頻率、發(fā)病機理、信號通路等，最后確定七個II糖尿病相關(guān)的易感性基因多態(tài)性位點。本發(fā)明提供一種II糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，通過聯(lián)合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標(biāo)記，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661) ,KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態(tài)性位點，來評估和篩選II糖尿病的遺傳易感性。該試劑盒的特征是上述基因位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對包括:用于檢測APMI基因上+45基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用于檢測⑶KALl基因上rsl0946398基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用于檢測TCF7L2基因上rs7903146多基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用于檢測⑶KN2A/2B基因上rsl0811661基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用于檢測KCNQl基因上rs2237892基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序弓I物對；用于檢測VDR基因上Fok I基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用于檢測SLC30A8基因上rsl3266634基因多態(tài)性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；PCR反應(yīng)試液(包括:緩沖液，MgCl2溶液，UdNTPs, dNTPs，特異性引物對，Taq DNA聚合酶，UNG酶，模板DNA，純水等)；PCR產(chǎn)物酶解液(包括:SAP酶，ExoL酶MIX，純水等);DNA測序反應(yīng)液組份(包括:EDTA，無水乙醇，70%預(yù)冷乙醇，去離子甲酰胺(H1-DiFormamide)，PCR酶解產(chǎn)物，BigDye Mix, DNA測序引物，純水等)。

本試劑盒所述的特征是APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661) ,KCNQl (rs2237892) ,VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上七個基因多態(tài)性位點同時進行聯(lián)合檢測。本試劑盒所述的特征是七個特異性擴增引物對分別針對APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)上基因多態(tài)性位點，能特異性擴增出DNA片段。本發(fā)明的七個特異性引物可用常規(guī)的合成方法進行合成，這些引物本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易地進行設(shè)計、合成和使用等。本試劑盒所述的特征是七個DNA測序引物對分別針對APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態(tài)性位點，能特異性進行DNA片段的序列檢測。本發(fā)明的七個DNA測序引物對可用常規(guī)的合成方法進行合成，這些引物本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易地進行設(shè)計、合成和使用等。本試劑盒所述的特征是所述試劑盒的組成與含量包括:(I)PCR反應(yīng)試液:單個PCR反應(yīng)體系包括:10XPCR緩沖液2.5μ l，25mM MgCl2溶液 2.5μ1，25πιΜ UdNTPs 0.2 μ l,25mM dNTPs 0.2 μ 1，20 μ M 特異性引物對中的一對引物
0.5 μ I, 5U/μ I混合酶(Taq DNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (50ng)，加純水至25 μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染體系，經(jīng)加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產(chǎn)物的污染。 (2) PCR 產(chǎn)物酶解液:2 μ I SAP 酶 +ExoL 酶 MIX。(3) DNA測序反應(yīng)液:有兩部分組成:測序反應(yīng)體系和測序產(chǎn)物純化。單個DNA測序反應(yīng)體系包括:3 μ I PCR酶解產(chǎn)物，I μ I測序試劑(25% BigDye Mix)，I μ I DNA測序引物對(只使用其中一個引物)，I μ I純水。測序產(chǎn)物純化包括:100mM EDTA 2 μ 1，16 μ I無水乙醇，70%預(yù)冷乙醇70μ 1X2,10μ I去離子甲酰胺(H1-Di Formamide)等。上述三個組份的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中未做詳細說明和具體描述的實驗條件和實驗方法，應(yīng)為常規(guī)實驗條件和方法，或按廠家提供的操作步驟和方法進行。實施例本試劑盒的使用1、樣本基因組DNA的獲取:用清水漱口一到二次，去除口腔中的食物殘渣，并注意咽盡口腔中剩余的清水。用棉簽刮取口腔粘膜脫落細胞并將其放入Eppendorf管的細胞固定液中，擰緊瓶蓋備用。2、DNA抽提及純化:用細胞裂解法提取中的DNA，懸浮于Iml生理鹽水中，2000 Xg離心IOmin ;棄上清，每管加Iml生理鹽水重復(fù)洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ;棄上清，每管加 400 μ I 細胞裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；0.1mol EDTA, PH 8.0 ；0.5%SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然后冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25: 24:1),混勻，5000Xg離心IOmin ;轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，重復(fù)抽提一次；再轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻;加入2.5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA 30分鐘；10000Xg離心15分鐘，棄上清；加Iml 70%冷乙醇清洗沉淀，10000 Xg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘干；將DNA沉淀溶于20 μ I TE緩沖液中，加20 μ g/ml胰RNA酶I μ I，37°C溫浴30分鐘，置于-20°C保存。3、采用PCR方法擴增目標(biāo)DNA片段:(I)本試劑盒的特點是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染體系，經(jīng)加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產(chǎn)物的污染。(2)本試劑盒的PCR反應(yīng)試劑組份由PCR反應(yīng)液體積21 μ 1、5U/ μ I混合酶(TaqDNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (約50ng)組成。PCR反應(yīng)液包括:10 X PCR緩沖液 2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5 μ I，25mM UdNTPs 0.2 μ I，25mM dNTPs 0.2 μ I。(3)PCR反應(yīng)試劑組份準(zhǔn)備:試劑開管前請完全解凍后充分混勻并短暫離心。建議在DNA提取結(jié)束后配制混合反應(yīng)液，并立即加樣。如特殊情況，可將下述分裝好的混合反應(yīng)液短期存于4°C,并在3小時內(nèi)使用。(4)PCR反應(yīng)試劑組份配制:按每個PCR反應(yīng)液體積21 μ1、混合酶I μ 1，模板DNA3μ 1，乘以所需的反應(yīng)管數(shù)，計算試劑的量，加于一個無菌離心管中，振蕩混勻。再用微量加樣器在每一 PCR反應(yīng)管內(nèi)加入25 μ I上述混勻的混合反應(yīng)液。(5) PCR反應(yīng)試劑組份加樣:在上述分裝好的裝有混合反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入模板DNA和陰性對照各3 μ I。S卩:單個PCR反應(yīng)體系組分，見表1:
表I單個PCR反應(yīng)試劑組份
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供了一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是包括以下步驟: 獲得受檢者的體液，毛發(fā)，血液或細胞組織等樣本； 提取樣本中的核酸(DNA和RNA)； 通過聯(lián)合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記的方法獲得受檢者的遺傳信息； 對相關(guān)的生物信息進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，從而評估該健康受檢者的II糖尿病易感性，并對已經(jīng)患有II型糖尿病人群的個性化治療和個性化保健也有指導(dǎo)意義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是聯(lián)合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記，包括=APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661)、KCNQl(rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記的檢測方法包括: 各種DNA測序的方法； 各種熒光定量PCR方法； 各種生物芯片檢測方法； 通過各種突光標(biāo)記與雜交技術(shù)檢測核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記的方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記包括: 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)； 拷貝數(shù)多態(tài)性(copy number polymorphism, CNP)；微衛(wèi)星 DNA (short tandem repeat, STR)； 限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)； 隨機擴增多態(tài)性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)； 特定序列位點(sequence-tagged site, STS)； 擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述七個核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記的特異性擴增引物對及DNA測序引物對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述試劑盒的組成與含量包括:(I)PCR反應(yīng)試劑組份；(2) PCR產(chǎn)物酶解試劑組份；(3) DNA測序反應(yīng)試劑組份。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述試劑盒的可應(yīng)用于健康受檢者個體肥胖的遺傳風(fēng)險評估，有利于專家和受檢者根據(jù)基因分型的結(jié)果，進行個性化的健康管理及干預(yù)指導(dǎo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是所述試劑盒的可應(yīng)用于已經(jīng)患 有II型糖尿病人群的檢測，有利于專家和受檢者根據(jù)基因分型的結(jié)果實現(xiàn)個性化治療和個性化保健。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種II型糖尿病基因易感性和預(yù)警檢測試劑盒，其特征是聯(lián)合檢測七個核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記，包括APM1(+45)、CDKAL1(rs10946398)、TCF7L2(rs7903146)、CDKN2A/2B(rs10811661)、KCNQ1(rs2237892)、VDR(FokI)、SLC30A8(rs13266634)。該試劑盒包括上述基因多態(tài)性位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對，以及PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物酶解液、DNA測序反應(yīng)液。通過本試劑盒的檢測，并對基因信息進行處理與分析，評估健康受檢者的II型糖尿病易感性，并對已患病人群的個性化治療和保健具有指導(dǎo)意義。
文檔編號C12Q1/68GK103074414SQ20121012833
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者崔春黎, 肖自力, 紀燕燕 申請人:上海金防生物科技有限公司