專利名稱：：前列腺特異性抗原診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種前列腺癌特異性檢測試劑
背景技術(shù)：
前列腺癌是中老年男性的常見多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計，在男性癌癥患者中，前列腺癌發(fā)病率最高，是除肺癌和大腸癌外的第三大死因。前列腺特異抗原PSA是分子量34KD的糖蛋白，具有高度的組織特異性，分布于正常的前列腺組織、前列腺增生組織、前列腺惡性組織和轉(zhuǎn)移癌及前列腺分泌液、精漿中。PSA目前是前列腺癌診斷中最為重要、應(yīng)用最為廣泛的前列腺癌標志物，測量血清中的前列腺特異抗原PSA可以用于篩選和早期診斷前列腺癌。前列腺特異抗原(PSA)有總前列腺特異抗原(t-PSA)、結(jié)合前列腺特異抗原(c-PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)之分，且t-PSA=C-PSA+f-PSA。通常，以血清中f-PSA或t-PSA的含量來篩選和早期診斷前列腺癌。目前用于血清PSA檢測的試劑盒主要是酶聯(lián)免疫試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，目前臨床上在利用ELISA試劑盒檢測前列腺特異性抗原PSA指標時，通常是以試劑盒中PSA標準品的濃度作為參照，來確定待測樣品中是否含有PSA或含有PSA的濃度。由于PSA指標與確定受試者是否患病直接相關(guān)，因此對于試劑盒中標準品的要求很高，標準品蛋白的純度及其與天然蛋白的接近程度對于檢測的準確度和精確性至關(guān)重要。盡管提取自體內(nèi)的天然PSA蛋白是與待檢測的樣品中PSA蛋白最接近的，其可作為一種有效標準品。然而天然PSA蛋白不僅來源少，批次之間穩(wěn)定性差(通常在批次間存在很大差異)，而且純化難度非常大(通常需要經(jīng)過離子交換層析，疏水層析，糖基化層析，高效液相色譜層析等多步純化步驟)，難以得到單一形式的PSA蛋白，純化的成本也非常高，大大限制了PSA檢測試劑盒的生產(chǎn)、推廣和應(yīng)用。因此，提供一種與天然PSA蛋白接近的重組PSA蛋白是非常有必要的。然而，本領(lǐng)域目前還難以利用基因工程技術(shù)大量表達出與天然PSA蛋白具有相同或相近活性的重組PSA蛋白，這可能是由于PSA是一種功能性蛋白，其本身的生物活性影響到重組細胞的生長狀態(tài)及表達。此外，通常制備重組蛋白所采用的系統(tǒng)是原核表達系統(tǒng)，原核系統(tǒng)表達出的蛋白往往缺乏較好的空間構(gòu)象和基本的糖基化修飾，與天然蛋白相差甚遠。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)制備方便、成本低廉的制備PSA的方法，制備出與天然蛋白具有相同或相近活性的重組PSA，從而可作為PSA檢測試劑盒中穩(wěn)定性高的標準品，用于臨床檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種包含前列腺特異性抗原PSA和G型免疫球蛋白功能區(qū)的融合蛋白，該融合蛋白具有與天然PSA蛋白接近的活性，并且能夠與抗PSA抗體良好地結(jié)合。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述融合蛋白作為標準品的前列腺癌檢測試齊u盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種融合蛋白，所述的融合蛋白包括-(a)前列腺特異性抗原PSA元件；(b)G型免疫球蛋白功能區(qū)(IgGFc)元件；以及(c)任選的位于PSA元件和G型免疫球蛋白功能區(qū)元件之間的連接肽。在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽具有i-io個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基端還包括苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白GP64信號肽。在另一優(yōu)選例中，所述的PSA元件位于氨基端，而所述的G型免疫球蛋白功能區(qū)元件位于羧基端。在另一優(yōu)選例中，所述的PSA元件位于羧基端，而所述的G型免疫球蛋白功能區(qū)元件位于氨基端。在另一優(yōu)選例中，所述的前列腺特異性抗原PSA具有SEQIDN0:2中第4〗_277位氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的G型免疫球蛋白功能區(qū)元件是人的IgGFc;更優(yōu)選的，是人的IgG2Fc。在另一優(yōu)選例中，所述的G型免疫球蛋白功能區(qū)具有SEQIDN0:2中第280-497位氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的GP64信號肽具有SEQIDNO:2中第1-38位氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種核酸分子，所述的核酸分子(i)編碼所述融合蛋白；或(ii)與(i)所述的核酸分子相互補。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的核酸分子。在本發(fā)明的第四方面，提供一種基因工程化的細胞，所述的細胞含有所述的載體；或所述的細胞基因組中整合有所述的核酸分子。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是昆蟲細胞。在本發(fā)明的第五方面，提供一種制備所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括步驟在適合表達的情況下，培養(yǎng)所述的細胞，從而產(chǎn)生所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的制備方法包括以下步驟(A)將所述的融合蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B)將(A)獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲細胞，使之表達所述的融合蛋白；和(C)分離獲得所述的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的桿粒為Bacmid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bacmid來源于大腸桿菌DHlOBac。在本發(fā)明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制備檢測前列腺特異性抗原PSA的試劑盒。在本發(fā)明的第七方面，提供一種檢測前列腺特異性抗原PSA的試劑盒，所述的試劑盒含有容器a，所述容器a中裝有所述的融合蛋白，作為標準品。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括-容器b，所述容器b中裝有特異性結(jié)合PSA的第一抗體；和/或容器c，所述容器c中裝有特異性結(jié)合PSA的第二抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同。在另一優(yōu)選例中，所述的第一抗體和第二抗體分別選自保藏號為CCTCC-C200622,CCTCC-C200621或CCTCC-C200620的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。更優(yōu)選的，所述的第一抗體選自保藏號為CCTCC-C200620，CCTCC-C200622的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體；或所述的第二抗體是保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括標記物，底物，顯色劑，洗滌液，質(zhì)控品，或終止液。在另一優(yōu)選例中，所述的第二抗體攜帶一標記物。在本發(fā)明的第八方面，提供一種制備前列腺特異性抗原PSA蛋白的方法，所述的方法包括對所述的融合蛋白進行切割，去除G型免疫球蛋白功能區(qū)元件，從而獲得PSA蛋白。另一方面，本發(fā)明還提供一種表達載體，所述的表達載體中含有一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物從5'至3'依次含有(I)苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白GP64信號肽的編碼序列；和(II)G型免疫球蛋白功能區(qū)的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，在(i)和(n)之間，還包括至少一個多克隆位點，便于插入待表達的目的基因。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了PSA基因轉(zhuǎn)錄本中轉(zhuǎn)錄本1，轉(zhuǎn)錄本3，轉(zhuǎn)錄本4，轉(zhuǎn)錄本5的核酸序列比較。圖2顯示了PSA的RNA抽提后電泳圖譜，其中，泳道l為marker;泳道2為CRL-1740的PSARNA電泳結(jié)果。圖3顯示了CRL-1740cDNA作為模板，以各對引物進行PCR擴增的結(jié)果。其中，泳道1為DNAmarker,泳道2為外部引物正義引物1與外部引物反義引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道3為外部引物正義引物2與外部引物反義引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道4為外部引物正義引物1與轉(zhuǎn)錄本3反義引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道5為外部引物正義引物2與轉(zhuǎn)錄本3反義引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖4顯示了NestPCR中，以第一次擴增引物為模板分別定義為A,B，C，D，進行第二次PCR擴增的電泳結(jié)果。其中，泳道l，4，7,10，13為marker;泳道2為以模板A為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物1為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道3為以模板A為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物2為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道5為以模板B為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物1為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道6為以模板B為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物2為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道8為以模板C為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物1的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道9為以模板C為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物2為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道11為以模板D為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物1為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道12為以模板D為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物2為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道14為以空白對照(蒸餾水)為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物1為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道15為空白對照(蒸餾水)為模板，以內(nèi)部引物正義引物與內(nèi)部引物反義引物2為引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖5顯示了全長PSA基因的PCR產(chǎn)物用SACI進行酶切后的電泳結(jié)果。其中，泳道l為marker;泳道2為酶切前的電泳結(jié)果；泳道3為maker;泳道4為酶切后的電泳結(jié)果。圖6顯示了信號肽基因PCR擴增后的電泳結(jié)果。其中，泳道l為marker;泳道2為陰性對照；泳道3為GP64信號肽PCR產(chǎn)物。圖7顯示了人IgG2Fc的擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，泳道l為marker;泳道2為陰性對照；泳道3為人FcPCR產(chǎn)物。圖8顯示了PSA基因轉(zhuǎn)入pFastBac-Fc-GP64質(zhì)粒后的PCR電泳驗證。其中，泳道l為marker;泳道2-5為克隆菌A,B,C，D;泳道6為陰性對照。圖9顯示了PSA基因轉(zhuǎn)入pFastBac-Fc-GP64質(zhì)粒后的PCR電泳驗證。其中，泳道l為marker;泳道2為克隆A質(zhì)粒雙酶切后電泳結(jié)果；泳道3為克隆A質(zhì)粒雙酶切前電泳結(jié)果；泳道4為克隆B質(zhì)粒雙酶切后電泳結(jié)果；泳道5為克隆B質(zhì)粒雙酶切前電泳結(jié)果；泳道6為克隆C質(zhì)粒雙酶切后電泳結(jié)果；泳道7為克隆C質(zhì)粒雙酶切前電泳結(jié)果；泳道8為克隆D質(zhì)粒雙酶切后電泳結(jié)果；泳道9為克隆D質(zhì)粒雙酶切前電泳結(jié)果；泳道IO為陰性克隆菌雙酶切后電泳結(jié)果；泳道11為陰性克隆菌雙酶切前電泳結(jié)果。圖10顯示了重組Bacmid桿粒的電泳結(jié)果。其中，泳道1為marker,泳道2為Bacmid-PSA桿粒的電泳結(jié)果。圖11顯示了克隆所得基因測序結(jié)果與GeriBank數(shù)據(jù)庫中序列比對的結(jié)果。圖12顯示了目的基因重組插入Bacraid載體的示意圖。圖13顯示了重組桿粒的PCR電泳驗證結(jié)果。其中，泳道l為marker;泳道2為空白對照電泳結(jié)果；泳道3為陰性菌克隆對照電泳結(jié)果；泳道4-10為克隆A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H電泳結(jié)果。圖14顯示了HighFive昆蟲細胞的生長曲線。圖15顯示了HighFive昆蟲細胞感染前和感染后的狀態(tài)。圖16顯示了純化后的蛋白的WesterBlot鑒定結(jié)果。其中，泳道1為marker;泳道2為未感染細胞；泳道3為感染空病毒細胞；泳道4為感染PSA-Fc桿狀病毒HighFive細胞；泳道5為純化PSA-Fc(信號肽在昆蟲細胞表達融合蛋白后在胞內(nèi)被自動切割)；泳道6為天然PSA。圖17顯示了游離PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的濃度梯度稀釋曲線。圖18顯示了游離PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的劑量效應(yīng)曲線。圖19顯示了游離PSA檢測試劑盒衡量國際標準品，PSA-Fc標準品的線性相關(guān)性。圖20顯示了總PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的濃度梯度稀釋曲線。圖21顯示了總PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的劑量效應(yīng)曲線。圖22顯示了總PSA檢測試劑盒衡量國際標準品，PSA-Fc標準品的線性相關(guān)性。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，意外地發(fā)現(xiàn)，將G型免疫球蛋白功能區(qū)(IgGFc)與前列腺特異性抗原PSA相連接并表達，可大量地表達出PSA-IgGFc融合蛋白，該融合蛋白的純化非常簡單。并且，在將PSA與IgGFc連接后，表達出來的重組融合蛋白的生物活性與天然PSA接近，也即IgGFc不會影響到PSA的構(gòu)象?？贵w結(jié)合實驗表明，所述融合蛋白能夠良好地與抗PSA的抗體結(jié)合，結(jié)合特征與天然PSA接近，可見IgGFc與PSA的連接并不影響到PSA與抗PSA抗體的結(jié)合。因而，所述的融合蛋白可用于作為標準品來制備檢測前列腺癌的試劑盒。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中難以重組表達以及純化與天然PSA接近的重組PSA的技術(shù)缺陷，從而大大降低了PSA檢測試劑盒的制造成本。融合蛋白及其編碼序列本發(fā)明提供一種融合蛋白(簡稱PSA-Fc)，該蛋白包括前列腺特異性抗原PSA或其生物活性片段和IgGFc或其生物活性片段。該融合蛋白具有與天然PSA蛋白相同或非常接近的蛋白活性，并且還便于被高水平地表達和純化。在本發(fā)明中，前列腺特異性抗原PSA可以具有一部分保守氨基酸被替代的序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性。適當替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。因此，經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的PSA的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中，所述的PSA也具有與天然PSA接近的特性，并且能夠與抗PSA抗體特異性結(jié)合。前列腺特異性抗原PSA的生物活性片段也可以被應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，前列腺特異性抗原PSA的生物活性片段的含義是指作為一種多肽片段，其仍然能保持全長PSA的全部或大多數(shù)活性，并且能夠與抗PSA抗體特異性結(jié)合。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的前列腺特異性抗原PSA具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中第41-277位氨基酸序列。在本發(fā)明的融合蛋白中含有IgGFc，IgGFc與PSA的連接，在不影響PSA活性的情況下，還有利于融合蛋白的下游純化。IgGFc可以是一部分保守氨基酸替代序列，只要所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性。因此，經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的IgGFc的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。IgGFc的生物活性片段也可以被應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，IgGFc的生物活性片段的含義是指作為一種多肽片段，其仍然能保持全長的IgGFc的全部或大部分功能。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的IgGFc是人IgGFc;更優(yōu)選的，所述的人IgGFc是人IgG2Fc，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中第280-497位的氨基酸序列。在所述PSA與IgGFc之間，可包括或不包括連接肽序列。通常，所述的連接肽具有1-10個氨基酸，其不會影響到PSA的生物活性。為了便于蛋白的表達，本發(fā)明人在所述融合蛋白的編碼基因的5'端加上信號肽的編碼序列，由于信號肽的作用，使得所述融合蛋白被分泌到宿主細胞外，從而便于蛋白的后續(xù)收集和純化。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的信號肽是苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白GP64信號肽。更特別地，所述的GP64信號肽具有SEQIDNO:2中第l-38位氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明還提供了編碼所述的融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補鏈。作為一種優(yōu)選方式，所述的核酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。并且，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達。本發(fā)明還提供了包含所述載體的宿主細胞。優(yōu)選的，所述宿主細胞是昆蟲細胞。任何適合于表達目的蛋白的昆蟲細胞系統(tǒng)均可以用于本發(fā)明，優(yōu)選的，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞或HighFive昆蟲細胞。如是sf9昆蟲細胞或HighFive昆蟲細胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明還提供了一種利用昆蟲系統(tǒng)來表達所述融合蛋白的方法，所述方法包括將所述的融合蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；將重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲細胞，使之表達所述的融合蛋白；和分離(如純化)得所述的融合蛋白。優(yōu)選地，所述的桿粒為Bacmid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bacmid來源于大腸桿菌DH10Bac。采用昆蟲表達系統(tǒng)來表達PSA-Fc蛋白，表達量高且穩(wěn)定，并且蛋白結(jié)構(gòu)接近天然蛋白。經(jīng)過實驗證明，PSA-Fc在昆蟲系統(tǒng)中得到了高水平的表達，在天然PSA標準品的替代實驗中表現(xiàn)良好。試劑盒本發(fā)明提供一種檢觀IJPSA的試劑盒，所述的試劑盒是基于酶聯(lián)免疫(ELISA)原理建立的。ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的檢測技術(shù)。本發(fā)明所述的試劑盒可用于前列腺癌和良性增生的鑒別診斷，特別是早期病人的篩査，也可用于前列腺癌術(shù)后化療的監(jiān)測及預(yù)后評估等。本發(fā)明所述的試劑盒中，含有所述的PSA-Fc蛋白，作為標準品。在試劑盒中，該PSA-Fc標準品可以是單一濃度的，在使用試劑盒時，由操作人員進行稀釋，形成具有不同濃度PSA-Fc的溶液，用于作為待測樣品的參照?；蛘?，可直接在試劑盒中放置多種濃度的PSA-Fc溶液，從而省卻了操作人員的稀釋步驟。通常，可利用所述的標準品來設(shè)置標準曲線，從而通過參照標準曲線來獲得待測樣品中PSA的濃度。作為一種優(yōu)選方式，標準曲線可如下設(shè)置用標準品的OD值檢測結(jié)果為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)繪制成PSA試劑盒的定量標準曲線；從而，根據(jù)待測樣品檢測獲得的OD值，利用標準曲線可計算出待測樣品中PSA的濃度。如本文所用，所述的"樣品"是指分離自人體的物質(zhì)，包括但不限于血清、血漿、尿液、或其它組織提取液。優(yōu)選的，所述的"樣品"是血清。利用ELISA原理檢測PSA可包括不同的檢測方法，較常用的是夾心酶聯(lián)免疫法。通常，在利用夾心酶聯(lián)免疫法時，常規(guī)的做法是將第一抗體固定于載體，然后第一抗體與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標記的第二抗體反應(yīng)，洗滌，最后進行化學發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。因此，所述的試劑盒中，還包括其它對于檢測PSA必要的成分，包括特異性結(jié)合PSA的第一抗體，和/或特異性結(jié)合PSA的第二抗體(該第二抗體與第一抗體不同)。如本文所用，所述的"捕獲抗體"、"包被抗體"、"第一單克隆抗體"、"第一抗體"與"一抗"可互換使用，都是指一種可特異性結(jié)合PSA的抗體。當利用ELISA方法檢測PSA抗原時，通常將所述的第一抗體被包被在固相載體上。本發(fā)明對所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與第一單克隆抗體相偶聯(lián)(連接)即可。例如，所述的固相載體是微量滴定板。如本文所用，所述的"檢測抗體"、"第二抗體"與"二抗"可互換使用，都是指一種可特異性結(jié)合PSA且對應(yīng)于所述試劑盒中相應(yīng)的第一抗體的抗體。對于抗原PSA而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時結(jié)合于所述的PSA的不同表位(抗原決定簇)。為了便于鑒定，所述的試劑盒中還可包括標記物。所述的標記物是指用于確定待檢測樣品中PSA的存在與否以及存在的量的標志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的包被抗體和/或檢測抗體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測抗體結(jié)合來進行檢測的各種標記物。本發(fā)明對所采用的標記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結(jié)合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣品中PSA蛋白的存在與否以及存在量的標記物均是可用的。所述的標記物可直接被設(shè)置于第二抗體上；或者，所述的標記物也可被設(shè)置于特異性抗第二抗體的抗抗體上，本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標記物。例如，所述的標記物可以選自辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶?？贵w標記的方法在本領(lǐng)域是公知的，例如用簡易過碘酸鈉法或者戊二醛二步法進行HRP標記抗體。當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。如本文所用，所述的"與標記物相對應(yīng)的底物"是指可被標記物所催化顯色，用于顯示第二抗體與RBP4發(fā)生結(jié)合的識別信號。所述的底物例如用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP);等等。本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的標記物的種類和特性，選擇適宜的底物。此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是ELISA方法中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于)顯色劑、洗滌液、質(zhì)控品、抗抗體或終止液。這些對于檢測PSA有用的成分及其制備是本領(lǐng)域人員己知的。此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。本發(fā)明還提供一種利用所述試劑盒體外檢測PSA的方法，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的PSA與固相載體上的第一抗體結(jié)合，形成帶有"PSA-第一抗體"二元復合物的固相載體；(b)將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-PSA-第一抗體"三元復合物的固相載體，且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；(c)檢測三元復合物中的標記物，從而確定待檢測樣品中PSA的存在與否以及存在的量。重組載體本發(fā)明還提供了一種重組載體，所述的重組載體中含有一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物從5'至3'依次含有(I)苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白GP64信號肽的編碼序列；和(II)IgGFc的編碼序列。更優(yōu)選的，在(I)和(II)之間，還包括至少一個多克隆位點，便于插入待表達的目的基因。所述的重組載體是通過將GP64信號肽編碼序列和IgGFc的編碼序列克隆入原始載體來構(gòu)建的。優(yōu)選的，所述的原始載體是一種適用于昆蟲細胞表達的載體，例如，所述的原始載體選自(但不限于)pFASTBAC載體、pFASTBACDUAL。除了上述元件，所述的載體上還含有其它對于目的蛋白的表達有用的元件，如啟動子，抗性選擇標記，增強子或操作子等。優(yōu)選的，所述的載體被用于在昆蟲細胞中表達所需的目的蛋白。采用所述的載體，可使得目的基因在昆蟲細胞中被良好地表達，并被分泌到細胞外；同時，還有利于目的蛋白的純化。本發(fā)明對所述的目的蛋白沒有特別的限制，只要其適合于被昆蟲細胞系統(tǒng)表達。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次揭示了一種前列腺特異性抗原PSA與IgGFc的融合蛋白，該融合蛋白不僅便于被高水平地表達和純化，并且還具有與天然PSA蛋白相同或非常接近的蛋白活性。(2)提供了一種成本低廉，準確度高的PSA檢測試劑盒。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料BactoBac細胞表達系統(tǒng)pFASTBAC載體，購自Invitrogen公司；對照質(zhì)粒(pFASTBAC-Gus或pFASTBACHT-CAT，購自Invitrogen公司)；DH10BAC細胞，購自Invitrogen公司;CELLFECTIN試劑，購自Invitrogen公司;昆蟲細胞系Spodopterafrugipe油(Sf9)購自Invitrogen公司，Tricoplusiani(HighFive)購自Invitrogen公司。PBS緩沖液(20X):NaCl170g，Na2HP0411.3g,KH2P042.7g，加水定容至1L。ELISA包被液:NaHC030.738g，Na2C030.397g;調(diào)PH值為9.5左右，加水定容至250ml。ELISA稀釋液牛血清100ml,PBS899ml，Tween201ml。ELISA洗滌液:1MTris20ml，1MHC116.8ml，Tween200.5ml，調(diào)PH值為7.0左右，加水定容至1L。PB(O.1M，PH6.8):Na2HP0412H201.76g，NaH2P042H200.8g，ddH20100ml。Na2C0「NaHC03緩沖液(lM，PH9.5):1MNa2C0330ml，1MNaHC0370ml。10XSDS-PAGE電泳緩沖液:Tris30g，Glycine144g，SDS10g,H201L。2XSDS凝膠加樣緩沖液TrisCI100mraol/L，二硫蘇糖醇(DTT)200鵬ol/L，SDS4%，溴酚藍0.2%，甘油20%。IOX轉(zhuǎn)移緩沖液:Tris30g，Glycine144g，H201L，臨用前加200ml甲醇/L。TBS緩沖液:HEPEs20mM，NaCl150mM，EDTA5mM，P200.1%。s.o.c培養(yǎng)基雙蒸水900ml，蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，1mol/L氯化鉀2.5ml，lmol/L氯化鎂lOml，lmol/L葡萄糖2ml。LB液體培養(yǎng)基蛋白胨lg，酵母抽提物0.5g,NaCllg，雙蒸水lOOml。LB固體培養(yǎng)基蛋白胨lg，酵母抽提物O.5g，NaCllg,瓊脂1.5g。蛋白脫色液冰醋酸100m1,甲醇100ml，雙蒸水800ml。10XTBS:Tris24.4g，NaCl80g，雙蒸水1000ml，調(diào)pH至7.6?？捡R斯亮藍R-250染色液甲醇135ml，水135ml，冰醋酸30ml，考馬斯亮藍R-250粉末0.75g。Sf-900IISerum-FreeMedium(SFM)購自Invitrogen公司，胎牛血清(FCS)和新生小牛血清購自杭州四季青公司，Cellfection購自Invitrogen公司，青霉素鏈霉素購自西巴斯公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Merck公司。Dulbecco'sModifiedEagle，sMedium(DMEM)和RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司。10%SFM培養(yǎng)液:新生小牛血清100ml，SFM900ml。凍存液DMSO10ml,新生小牛血清20ml，SFM70ml。完全培養(yǎng)液新生小牛血清100ml,DMEM900ml。凍存液DMSOlOml，新生小牛血清20ml，函EM70ml?？筆SA單克隆抗體分別是保藏號為CCTCC-C200622，CCTCC-C200621，CCTCC-C200620的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。ProteinG純化系統(tǒng)Hi-TrapProteinG柱購自法瑪西亞Biotech#17-0404-01。20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0):NaH2P041.084g，Na異.7H203.273g，蒸餾水1000ml。0.1M甘氨酸(pH2.8〉甘氨酸3.75g，鹽酸(concentrated)1.4ml,蒸餾水1000ml。1MTris:Trisbase141.1g，蒸餾水1000ml。Pristine和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔Ig抗體、HRP酶標記的羊抗小鼠Ig抗體購自Sigma公司，ProteinG-s印harose4B親和層析柱購自AmerhamBiosciences公司。工具酶切體系購自大連寶生物。質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海博采生物工程有限公司。T載體系統(tǒng)購自上海天根公司。II.實施例實施例l.PSA的基因克隆1.CRL-1740前列腺癌細胞系的培養(yǎng)、RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄將CRL-1740前列腺癌細胞株(購自ATCC)從液氮中取出，放于37。C無菌水中，待凍存細胞溶化后加入10mlRPMI1640完全培養(yǎng)基中，吹打均勻后，1000rpm離心，重新洗滌細胞后將細胞以2X107ral培養(yǎng)于75cm2TFLASK,37。C培養(yǎng)2代。細胞培養(yǎng)得到5X106個細胞，通過常規(guī)方法進行RNA抽提，抽提時盡量保持低溫和無RNAse。RNA抽提后電泳結(jié)果如圖2所示，顯示RNA被抽提出來。反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(40ul)如下5X緩沖液8ul，0.lMDTT4ul，dNTPs(10mM)8ul，RNAse抑制劑0.5ul，S叩erscriptaselul，01igo(dT)12-16(0.5ug/ul)1ul，樣品RNA(4ug)4ug，DEPC仏0加至40ul。將01igodT與RNA，DEPC水混勻后，7(TC水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37。C水浴1.5h，95。C水浴5min(封口)，冰浴，得到CRL-1740cDNA。2.PSA的NestPCR克隆根據(jù)已有報導，PSA具有6個轉(zhuǎn)錄本，其中2號轉(zhuǎn)錄本和6號轉(zhuǎn)錄本均為全長PSA的短片段，其余的1、3-5號轉(zhuǎn)錄本如圖1所示，可見PSA轉(zhuǎn)錄本情況復雜，不同轉(zhuǎn)錄本存在不同片段的缺失，特別是3號轉(zhuǎn)錄本其末端含有與其它轉(zhuǎn)錄本沒有同源性的長片段。并且，對于CRL-1740中PSA的轉(zhuǎn)錄本情況并不清楚。因此擴增全長的PSA具有很大的難度。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明人設(shè)計了不同的外部引物(如表l)和轉(zhuǎn)錄本3特異引物，以前述從CRL-1740經(jīng)RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板，進行PCR擴增，希望從CRL-1740中擴增出PSA全長片段。外部引物PCR系統(tǒng)(30ri):IOX反應(yīng)緩沖液(對應(yīng)PFU酶)3W，模板2ul，MgCl21.8W，dNTPL5W，引物As1W、Sp1W，cDNA0.5)^1，ddH2021W,PFU0.2W。PCR反應(yīng)條件為94。C5min;94°C45s、50°C45s、72°Clniin共進行30個循環(huán)，72°C7min，外部引物PCR退火溫度50°C。將外部引物擴增產(chǎn)物進行1/100稀釋，以稀釋后產(chǎn)物為模板進行內(nèi)部引物PCR。系統(tǒng)(30W):10X反應(yīng)緩沖液(對應(yīng)PFU酶)3W，模板2ul，MgCl21.8W，dNTP1.5W，引物As1W、Sp1W，c腿O.ddH2021W，PFUO.2W。PCR反應(yīng)條件94°C5min;94°C45s、60°C45s、72°Clmin共進行30循環(huán)，72。C7min。采用外部引物的PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖3所示，采用不同的外部引物進行擴增，均無法擴增到清晰并具有目的條帶大小的核酸片段。為了克服無法獲得全長PSA的問題，本發(fā)明人經(jīng)過反復實驗，以第一次PCR擴增獲得的各產(chǎn)物為模板分別定義為A(對應(yīng)于Spl和As的擴增產(chǎn)物)，B(對應(yīng)于Sp2和As的擴增產(chǎn)物)，C(對應(yīng)于Spl和As3的擴增產(chǎn)物)，D(對應(yīng)于Spl和As3的擴增產(chǎn)物)。分別以設(shè)計的各內(nèi)部引物(見表l)為引物，進行第二次PCR擴增，電泳結(jié)果見圖4。實驗結(jié)果顯示，模板A為引物可以在900bp左右位置擴增出條帶，而此處大小正好與PSA全長模板大小接近。在PSA基因的內(nèi)部有一個工具酶酶切位點SACI，將PCR產(chǎn)物用SACI進行酶切。1%瓊脂糖電泳驗證。SACI酶切驗證結(jié)果顯示，在PSA基因內(nèi)部靠近5'端344bp有一個SACI酶切位點，擴增條帶大小為890bp，如果該片斷是PSA核酸序列，必然在SACI酶切處理后變?yōu)?40bp和550bp左右的核酸片斷。實驗結(jié)果如圖5，由實驗結(jié)果可以得出，片段被SACI酶切為大小分別為550bp和340bp的核酸片斷，說明該核酸序列可能含有PSA核酸序列。將獲得預(yù)測為PSA全長的擴增產(chǎn)物進行測序，并與GENBANK數(shù)據(jù)庫比對(見圖ll)，結(jié)果說明克隆片斷為人源PSA全長序列基因，無突變。實施例2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明人克隆的是苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)膜蛋白GP64的信號肽，具體序列如下atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacacaagcaagatggtaagcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcg(SEQIDNO:17)，引入BamHI酶切位點和Copl酶切位點。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以表2中Gp64+Sp、Gp64+As為引物，以GP64模板-1、2、3為模板，進行PCR，獲得GP64的信號肽。信號肽基因PCR擴增后的電泳結(jié)果如圖6。以表3所示序列為引物，以質(zhì)粒pWS3(自帶IgG2Fc，購自中國軍事醫(yī)學科學研究院)為模板，進行PCR，獲得人源IgG2Fc(簡稱hFc)。并且，兩端引入了HindIII和XhoI酶切位點。人IgG2Fc的擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖7所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以BamHI、Copl酶切前述獲得的GP64信號肽DNA序列，克隆入經(jīng)同樣酶切的pFASTBAC載體BamHI/C叩I位點內(nèi)，得到pFASTBAC-GP64質(zhì)粒；以HindIII和Xhol酶切前述獲得的IgG2Fc的DNA序列，克隆入經(jīng)同樣酶切的pFASTBAC-GP64載體Hindlll/Xhol位點內(nèi)，從而獲得pFastBac-GP64-Fc質(zhì)粒。以BamHI禾QXhol酶切前述獲得的PSA的DNA序列，克隆入經(jīng)同樣酶切的pFastBac-GP64-Fc質(zhì)粒中，獲得pFastBac-GP64-PSA-Fc質(zhì)粒。PSA基因轉(zhuǎn)入pFastBac-Fc-GP64質(zhì)粒后的PCR電泳驗證見圖8(用BamHI酶切)和圖9(用Xhol酶切)。說明GP64-PSA-Fc融合基因己經(jīng)被克隆進入pFastBac-Fc-GP64，目的基因的測序結(jié)果如SEQIDNO:1所示。蛋白翻譯序列如SEQIDNO:2所示。比對結(jié)果證明，pFastBac-GP64-PSA-Fc內(nèi)含有正確讀碼框的GP64信號肽基因序列，PSA全長基因，人IgG2Fc(1-38位為Gp64信號肽，41-277位為PSA編碼區(qū)，280-497位為人IgG2Fc)。理論分子量55道爾頓。實施例3.桿狀病毒的獲得與蛋白表達和純化將前述制備的pFastBac-GP64-PSA-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入DH10Bac基因工程菌，通過藍白斑篩選(選擇白斑)得到陽性克隆。從陽性桿粒菌中抽提獲得重組的Bacmid桿粒(其中攜帶GP64-PSA-Fc編碼基因)，以該Bacmid桿粒為模板，以表4所示序列為引物進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物進行電泳驗證。電泳結(jié)果如圖10。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將sf9細胞株從液氮中取出放于27。C無菌水中，待凍存細胞溶化后加入10mlSFM培養(yǎng)基中，吹打均勻后，lOOOrpm離心，重新洗滌細胞后將細胞以2X107ml培養(yǎng)于75cm2TFLASK，37。C培養(yǎng)2代。病毒的制備方法如下'①在六孔板中接種9X1()5個sf9細胞/2ml/L。其中培養(yǎng)基SFM中含有青霉素50U/ml，鏈霉素50ug/ml，10%FBS。27。C培養(yǎng)lh，使細胞貼壁。②培養(yǎng)細胞的同時，制備重組Bacmid桿粒與Cellfectin試劑復合物用100ul不完全Grace'smedium(不含雙抗、FBS)稀釋lug重組的Bacmid桿粒(約5ul);使用前將Cellfectin試劑倒置5-10次，使其充分混勻，取6ulCellfectin試劑用100ul不完全Grace'smedium(不含雙抗、FBS)稀釋；將上述兩種稀釋液合并(總體積約210ul)，輕輕混勻，室溫孵育15-45min。③在制備重組的Bacmid桿粒與Cellfectin試劑復合物期間，將六孔板中的培養(yǎng)基吸掉，用2ml不完全Grace'smedium(不含雙抗、FBS)洗滌一次，去掉培養(yǎng)基。在含有210ul的復合物的管內(nèi)加入800ul的不完全Grace'smedium(不含雙抗、FBS)，輕輕混勻，加到每個孔中。將六孔板內(nèi)的細胞孵育5h，27°C。⑤去掉復合物混合液，然后在每個孔中加2ml完全培養(yǎng)基(Grace，smedium,含雙抗、10%FBS)。⑥在27。C濕度培養(yǎng)箱中孵育72h或著直到細胞出現(xiàn)病毒感染跡象。重組桿粒的PCR驗證目的基因重組插入Bacmid載體(原理如圖12)后，利用載體兩端的通用引物進行擴增，則陽性克隆的片斷為載體大小加重組插入序列大小。所以目的基因擴增片斷大小為1500+270+2000=3770bp，電泳見圖13。泳道4和5顯示目的基因大小為接近4KB，提示目的基因已經(jīng)插入載體，且桿粒狀態(tài)良好，可以用來進行病毒的包裝實驗。P1病毒原種的(P1)分離與貯存①當sf9細胞出現(xiàn)感染跡象時，將上層培養(yǎng)基(約2ml)轉(zhuǎn)移到無菌帶蓋的EP管中，500g離心5min以去除細胞及大的碎片?？捎玫鞍捉Y(jié)合率低的0.2um的濾膜過濾，滴度損失小于10%。②將含病毒的上清液轉(zhuǎn)移到另一個無菌帶蓋的EP管中(一般，P1的滴度在106左右)。③將得到的病毒液體避光置于4'C冰箱(短期)。若長期保存，進行l(wèi)ml分裝，避光儲存于-7CTC。凍融后，在使用前進行滴度檢測。病毒的擴增①原代病毒(P1)滴度較低，介于1X106-1X107，擴增后滴度為1X107-1X108。②采用6孔板，2X106sf9細胞/L，細胞活力>97%。③在每個孔中加入適量的病毒。擴增病毒時可用下列公式進行計算MOI(MultiplicityOfInfection)在0.01至0.1之間。接種量(ml):MOI(phf/ml)X(細胞總數(shù))病毒接種的滴度(pfu/ml)。感染細胞48h收集的病毒擴增的將近100倍，超過48h收集的病毒質(zhì)量較低。每種病毒的收集時間都有一定的差別，如在72h收集，但是隨著細胞的裂解，病毒的增殖活力會受損。收集病毒上清，500g離心5min。轉(zhuǎn)移上清至滅菌管，得到P2病毒。保存如上所述。按照上述方法進行病毒P3的擴增。如病毒在-7(TC儲存過，在一定時間后，滴度會降低，在用于蛋白擴增前，需先進行病毒擴增。實施例4，PSA蛋白的大量表達和純化HighFive細胞的懸浮馴化培養(yǎng)2X107ml細胞放于細胞培養(yǎng)瓶中，27°C50rpm培養(yǎng)。72小時后將細胞進行收集，靜置10min。將上清lOOOrpm離心5min。用新鮮SFM稀釋細胞至2X107ml，27°C50rpm培養(yǎng)。重復上述方法，直到細胞可以懸浮培養(yǎng)。昆蟲細胞的生長曲線見圖14。采用懸浮馴化后的細胞進行懸浮培養(yǎng)，細胞密度可以達到lX10々ml，細胞存活率99%。HighFive細胞表達重組PSA-Fc:將懸浮細胞1000rpm，離心2min，洗滌細胞。以最優(yōu)化MOI感染昆蟲細胞，以2X107m重懸昆蟲細胞。27°C，96小時，2000rpm，4min。收集細胞上清。0.45um濾膜過濾。'昆蟲細胞的感染狀態(tài)見圖15?？梢姼腥竞蠹毎l(fā)生明顯的病變，包括細胞核變清晰，細胞變圓，細胞體積變大。病毒感染率100%。PSA蛋白純化每個1.5ml離心管中加入100ullMTris堿。10ralPBS緩沖液清洗ProteinG-sepharose4B純化柱。將培養(yǎng)基以lml/min速度注入ProteinG-s印harose4B純化柱。10mlPBS緩沖液清洗ProteinG-s印harose4B純化柱。0.1M甘氨酸0.5ml/min注入ProteinG-s印harose4B純化柱。收集目的蛋白。采用常規(guī)的方法，對純化后的蛋白進行WesterBlot鑒定。結(jié)果見圖16，從檢測結(jié)果來看，目的蛋白PSA-Fc被表達并純化，且純化效果良好。實施例5.PSA抗體的純化和辣根過氧化物酶(HRP)標記硫酸銨鹽析法純化抗體飽和度為33%，4'C放置過夜，離心得沉淀；用33%飽和硫酸銨溶液洗滌沉淀一次；加入少量PBS，溶解沉淀；對PBS4。C透析過夜后，離心得上清，即為純化的抗體(Ig)，測蛋白濃度。抗體與HRP酶的交聯(lián)(戊二醛兩步法)25y。戊二醛(GA)原液用PB稀釋到1.25%，取0.2ml;加入10mgHRP酶，混勻后22'C放置18小時；對0.85%-0.9%NaCl4'C透析，5小時。透析完后用0.85-0.，aCl稀釋到總體積lml;加入lml用0.85-0.9%NaCl稀釋的5mg/ml上述純化的抗體；加入O.lml1MPH9.5碳酸鹽緩沖液反應(yīng)，4'C，24小時；加入0.lml0.2M的賴氨酸終止反應(yīng)，室溫，2小時；對PBS4'C透析過夜；再次硫酸銨鹽析純化抗體，即得到酶標記后的抗體。實施例6.試劑盒的制備和使用1.試劑盒的制備材料PSA抗體以保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤細胞株分泌的抗體為包被抗體；以保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤細胞株分泌的抗體為檢測抗體來制備游離PSA(f-PSA)檢測試劑盒。以保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤細胞株分泌的抗體為包被抗體；以保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤細胞株分泌的抗體為檢測抗體來制備總PSA檢測(t-PSA)試劑盒。標準品采用實施例4獲得的PSA-Fc融合蛋白。標記物采用辣根過氧化物酶。底物采用頂B。固相載體采用96孔酶標板。包被液Na線0.738g，Na2C030.397g;調(diào)PH值為9.5左右，加水定容至250ml。稀釋液牛血清100ml，PBS899ml,Tween20lml。洗滌液1MTris20ml，1MHC116.8ml，Tween200.5ml，調(diào)PH值為7.0左右,加水定容至1U將各種試劑分別裝入容器(如小瓶或離心管)中，將容器以及固相載體裝入試劑盒中，得到游離PSA檢測試劑盒，或總PSA檢測試劑盒。實施例7.夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)(1)包被抗體用包被液將包被抗體作適當稀釋，濃度為5ug/ml，100"1/孔，4'C放置1618小時。(2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放3分鐘，反復3次，將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。(3)封閉封閉液200pl/孔，37。C放置2小時。(4)洗滌同(2)。(5)加樣加入待測的血清樣本或標準品，100ul/孔，同時加入無關(guān)蛋白BSA作陰性對照，37'C反應(yīng)2小時。(6)洗滌同(2)。(7)二抗加辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，100iU/孔，37°C反應(yīng)2小時。(8)洗滌同(2)。(9)顯色加底物TMB，100ul/孔，室溫下避光反應(yīng)10-15分鐘。(10)終止反應(yīng)加終止液2M濃H2S04，100ul/孔。(11)結(jié)果檢測用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長450nm下進行檢測。(12)結(jié)果計算-A)制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定OD值為縱坐標，作出標準曲線。B)計算待測樣品PSA濃度當標準曲線和質(zhì)控品均被判定有效時，根據(jù)待測樣本的OD值從標準曲線計算出待測樣品的PSA濃度。實施例8.天然PSA和本發(fā)明的PSA-Fc的比較1.游離PSA檢測試劑盒檢測PSA國際標準品和PSA-Fc(1)游離PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的濃度梯度稀釋曲線初始濃度為112ng/ml的PSA-Fc分別稀釋至1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，使用實施例6制備的游離PSA檢測試劑盒進行檢測，450nm讀取底物吸光度。結(jié)果見圖17。結(jié)果表示，PSA-Fc能夠與試劑盒中的包被抗體與檢測抗體特異性結(jié)合，PSA-Fc在游離PSA檢測試劑盒中的線性范圍經(jīng)過校正為0-25ng/ml。(2)游離PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的劑量效應(yīng)曲線取PSA-Fc濃度分別為0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml。使用實施例6制備的游離PSA檢測試劑盒進行檢測，450nm讀取底物吸光度。結(jié)果如圖18。結(jié)果表示，PSA-Fc在該檢測試劑盒中線性度良好。(3)游離PSA檢測試劑盒衡量PSA國際標準品、PSA-Fc作為標準品的線性相關(guān)性分別取PSA-Fc:Ong/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml'25ng/ml,與PSA國際標準品Ong/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml同時用實施例6制備的游離PSA檢測試劑盒檢測，比較PSA-Fc與國際標準品的相關(guān)性。該PSA國際標準品購自英國NIBSC批號為96/670，該國際標準品是分離自人體的PSA天然蛋白。結(jié)果如表5和圖19。結(jié)果表示，PSA-Fc與PSA國際標準品(NIBSC-FPSA)用作標準品檢測f-PSA,PSA國際標準品和PSA-Fc在0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml的范圍內(nèi)兩者的線性相關(guān)度達到0.9995。說明天然標準品完全可以被PSA-Fc替代用于f-PSA試劑盒檢測的標準品。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>2.總PSA檢測試劑盒衡量PSA國際標準品，PSA-Fc作為標準品的線性相關(guān)性(1)總PSA檢測試劑盒檢測PSA-Fc的濃度梯度稀釋曲線-初始濃度為110ng/ml的PSA-Fc分別被稀釋至1/8,1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，用實施例6制備的總PSA檢測試劑盒檢測，450nm讀取底物吸光度。結(jié)果見圖20。結(jié)果表示，PSA-Fc在總PSA檢測試劑盒中的線性范圍經(jīng)過校正為0-25ng/ml。(2)總PSA試劑盒檢測PSA-Fc劑量效應(yīng)曲線取PSA-Fc濃度分別為0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25rig/ml。使用實施例6制備的總PSA檢測試劑盒進行檢測，450nm讀取底物吸光度。結(jié)果如圖21。結(jié)果表示，PSA-Fc在該檢測試劑盒中線性度良好。(3)總PSA檢測試劑盒衡量PSA國際標準品，PSA-Fc作為標準品的線性相關(guān)性分別取PSA-Fc:Ong/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，與國際標準品Ong/ml，1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml同時用試劑盒檢測，使用實施例6制備的總PSA檢測試劑盒比較PSA-Fc與PSA國際標準品的相關(guān)性。結(jié)果如表6和圖22。結(jié)果表示，PSA-Fc與PSA國際標準品(NIBSC-TPSA)用作標準品檢測總PSA，PSA國際標準品和PSA-Fc在0ng/ml，1ng/ml，2.5ng/ml,5ng/ml,lOng/ml,25ng/ml的范圍內(nèi)兩者的線性相關(guān)度達到0.9952。說明天然標準品完全可以被PSA-Fc替代用于t-PSA試劑盒檢測的標準品。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例9.重組PSA(不含IgGFc元件)的制備基本的制備方法同制備PSA-Fc，不同點在于在構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-GP64-PSA-Fc時，在PSA與Fc段之間加上煙草病毒蛋白酶(rTEV)的酶切位點的編碼序歹U(GAAAACCTGTATTTTCAGGGC(SEQIDNO:18),其對應(yīng)的蛋白序列為ENLYFQG(SEQIDNO:19))。表達和純化同前，獲得重組的PSA-rTEV-Fc融合蛋白。在獲得重組的PSA-rTEV-Fc后，利用rTEV蛋白酶進行酶切，分離獲得切除了IgGFc的重組PSA。菌種保藏本發(fā)明涉及的單抗雜交瘤細胞株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學)，保藏號分別為CCTCCC200620(雜交瘤細胞系S-l15-8)、CCTCCC200621(雜交瘤細胞系S-191-5)、CCTCCC200622(雜交瘤細胞系S-44-10),保藏日均為2006年4月29閂。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120>前列腺特異性抗原診斷試劑盒<130>073068<160〉21〈170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1491<212>DNA〈213>人工序列<220><221>misc—feature<223>融合i因<400>1atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttc犯t犯ggaBca^caca^gcaagatggta60agcgctattgttttatatgtgctutggcggcggcggcgcattctgcctttgcggg3tcc120attgtgggaggctgggagtgCg3g33gC3ttcccaaccctggcaggtgcttgtggcctct180cgtggcagggC3gtXtgCggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcc240C3CtgC3tC3ggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaa300gacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagc360ctcctg犯gsatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctc420cgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtg犯ggtcatggeicctgcccscccag480gagccagcsctggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaacc柳ggag540ttcttgaccctcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgt600gcgcaagttcaccctcag犯ggtg3CC卿ttC3tgCtgtgtgctggacgctggac鄉(xiāng)g660ggcaa犯gc3cctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaa720ggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacacc780aaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggcc幼ccc840tgcccaccgtgcccagcacctg犯ctcctgggggg織gtcagtcttcctcttcccccca900犯acccaaggacaccctcatgstctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggac960gtgagccacgeiagaccctgaggtc犯gttcaactggtscgtggscggcgtgg鄉(xiāng)tgcat1020犯tgcc犯gacaaagccgcggg3gg兆Cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtc1080ctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc卿gagtacaagtgcaaggtctccaac1140aaagccctccC3gcccccatcgagaa犯ccatctccaasggccccg3gaa1200CC3C3ggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccasg犯cc3ggtcagcctg1260acctgcctggtc犯aggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag3gC3atggg1320C3gCCgg卿gaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttc1380ctctacagcaagctcaccgtggac卿agcaggtggcagcagggg犯cgtcttctcatgc1440tccgtgatgcatgaggctctgC3C33CC3Ctacacgcagaagagcctctcc1491<210〉2<211>497<212>PRT<213〉人工序列<220〉<221>MISC一FEATURE<223〉融合^白<400>224MetSerAlaLysVal65HisPheProProPro145GluGluHisThrCys225GlySerlieLeuThr305ValValSerLeuAla385ProGinAlaThrLeuLysHisHis50CysCysHisHisGly130AlaProProValLys210SerlieLeuValLeu290LeuSerGluThrAsn370ProGinValValPro450LeuMetSer35SerGlylieProPro115AspGluAlaGlulie195PheGlyThrTyrAla275GlyMetHisValTyr355GlylieValSerGlu435ProValVal20AlaGinGlyArgGlu100LeuAspLeuLeuGlu180SerMetAspSerThr260AsnGlylieGluHis340ArgLysGlu丁yrLeu420TrpValAsn5SerPheProValAsn85AspTyrSerThrGly165PheAsnLeuSerTrp245LysProProSerAsp325AsnValGluLysThr405ThrGluLeuGinAlaAlaTrpLeu70LysThrAspSerAsp150ThrteuAspCysGly230GlyValLeuSerArg310ProAlaValTyrThr390LeuCysSerAspSerlieGlyGin55ValSerGlyMetHis135AlaThrThrValA]a215GlySerValGluVal295ThrGluLysSerLys375lieProLeuAsnSer455HisValSer40ValHisValGinSer120AspValCysProCys200GlyProGluHisThr280PheProValThrGinGly10LeuTyr25lieValLeuValProGinlieLeu90ValPhe105LeuLeuLeuMetLysValTyrAla170LysLys185AlaGinArgTrpl>euValProCys250TyrArg265CysProLeuPheGluValLysPhe330LysPro345LeuThrVal360CysLysValSerLysAlaProSerArg410ValLysGly425GlyGinPro440AspGlyProPheValGlyAlaTrp75LeuGinLysLeuMet155SerLeuValThrCys235AlaLysProProThr315AsnArgValSerLys395AspPheGluPheAsnLeuGlySer60ValGlyValAsnLeu140AspGlyGinHisGly220AsnLeuTrpCysPro300CysTrpGluLeuAsn380GlyGluTyrAsnPhe柳LysLeuTrp45ArgLeuArgSerArg125ArgLeuTrpCysPro205GlyGlyProliePro285LysVal丁yrGluHis365LysGinLeuProAsn445LeuGluAla30GluGlyThrHisHis110PheLeuProGlyVal190GinLysValGluLys270AlaProValValGin350GinAlaProThrSer430TyrTyrHis15AlaCysArgAlaSer95SerLeuSerThrSer175AspLysSerLeuArg255AspProLysValAsp335TyrAspLeuArgLys415AspLysSerThrAlaGluAlaAla80LeuPheArgGluGin160lieLeuValThrGin240ProThrGluAspAsp320GlyAsnTrpProGlu400AsnlieThrLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCys465470475480SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeu485490495Ser<210〉3<211〉16<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>raise—feature<223〉引物〈400〉3cctgtccgtgacgtgg<210>4<211>20<212〉腿<213〉人工序列<220〉〈221>misc一feature<223>引物<400>4ccaagcttaccacctgcacc〈210〉5<211>17<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉5ggacagagtgggttatg<210>6<211>16<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉6tgcacccctcatcctg<210〉7<211〉17〈212〉DNA<213>人工序列<400>7ctctggtctacacctgt<210〉8<211>16<212〉DNA<213〉人工序列<400>8cttttcctagcaaccc<210>9<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉9gcaggg卿gagtgagatag<210〉10<211〉48<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉模板<400〉10atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacaca<210〉11<211>39<212〉DNA〈213>人工序列<220><221>misc—feature<223>模板〈400〉11ataaaacaatagcgcttaccatcttgcttgtgtgttcct<210>12〈211〉48<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉模板<柳>12attgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcg<211>27<212〉,<213>人工序列<220〉〈221>misc—feature<223>引物<400>13cccaagctttttacccggagacaggga<210>14<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>14CCgCtCg3g3C3tgCCC3CCgtgCCC3<210〉15<211>16<212〉隨<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400>15gtttcccagtcacg3C<210〉16<211〉17<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400>16caggaaacagctatgac<210〉17<211〉114<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>AcNPV病毒膜蛋白GP64的信號肽編碼序列<400〉17atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacacaagcaagatggtaagcgctattgttUatatgtgctmggcggcggcggcgcattctgcctttgcg〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>蛋白il切位點基因序列<400>18g3333CCtgt3ttttC3gggC<210>19<211>7<212〉PRT<213>人工序列<400〉19GluAsnLeuTyrPheGlnGly15<210>20<211〉38<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉20ataagaatcggtccgaaaccatgctactagtaaatcag<210〉21〈211〉25<212>廳<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉21gggatcccgcaaaggcagaatgcgc29權(quán)利要求1.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括(a)前列腺特異性抗原PSA元件；(b)G型免疫球蛋白功能區(qū)元件；以及(c)任選的位于PSA元件和G型免疫球蛋白功能區(qū)元件之間的連接肽。2.如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基端還包括苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白GP64信號肽。3.—種核酸分子，其特征在于，(i)所述的核酸分子編碼權(quán)利要求1或2所述融合蛋白；或(ii)所述的核酸分子與(i)所述的核酸分子相互補。4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的核酸分子。5.—種基因工程化的細胞，其特征在于，所述的細胞含有權(quán)利要求4所述的載體；或所述的細胞基因組中整合有權(quán)利要求3所述的核酸分子。6.—種制備權(quán)利要求l所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟在適合表達的情況下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的細胞，從而產(chǎn)生權(quán)利要求l所述的融合蛋白；和分離權(quán)利要求l所述的融合蛋白。7.權(quán)利要求l所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備檢測前列腺特異性抗原PSA的試劑盒。8.—種檢測前列腺特異性抗原PSA的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有-容器a，所述容器a中裝有權(quán)利要求l所述的融合蛋白，作為標準品。9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括容器b，所述容器b中裝有特異性結(jié)合PSA的第一抗體；和/或容器c，所述容器c中裝有特異性結(jié)合PSA的第二抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同o10.—種制備前列腺特異性抗原PSA蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括-對權(quán)利要求l所述的融合蛋白進行切割，去除G型免疫球蛋白功能區(qū)元件，從而獲得PSA蛋白。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種前列腺特異性抗原PSA與G型免疫球蛋白功能區(qū)(IgGFc)融合蛋白，本發(fā)明還公開了含有所述融合蛋白作為標準品的PSA檢測試劑盒。本發(fā)明將IgGFc與前列腺特異性抗原PSA相融合表達，不僅可大量地獲得融合蛋白，而且該融合蛋白的純化非常簡單且生物活性與天然PSA接近。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中難以重組表達以及純化與天然PSA接近的重組PSA的技術(shù)缺陷，大大降低了PSA檢測試劑盒的制造成本。文檔編號G01N33/574GK101324576SQ20071004191公開日2008年12月17日申請日期2007年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者兵孫,宇胡,蔡興峰,袁建偉,黃超峰申請人:中國科學院上海生命科學研究院