專利名稱：：抗前列腺特異性膜抗原(psma)的人單克隆抗體的制作方法抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)的人單克隆抗體發(fā)明背景前列腺病是男性發(fā)病率和死亡率的主要原因。對(duì)于前列腺癌的治療包括手術(shù)、激素、放射療法和化學(xué)療法。對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺疾病幾乎沒有有效治療。因此，代表診斷和預(yù)后標(biāo)記的基因和/或基因產(chǎn)物以及治療耙標(biāo)的鑒定是關(guān)鍵的。前列腺特異性抗原(PSA)是一種在前列腺癌的臨床診斷和分期中有用的這樣的癌標(biāo)記。但是，在4-10ng/ml范圍內(nèi)PSA不能區(qū)別良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者前列腺癌，因此，需要細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)評(píng)價(jià)來證實(shí)正確的診斷(Barren,R丄等人(1998)Prostate36:181-188)。前列腺特異性膜抗原(PSMA)是與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有54%同源性的大約110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750個(gè)氨基酸。PSMA具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)19個(gè)氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)24個(gè)氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)707個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域。PSMA蛋白質(zhì)顯示神經(jīng)羧肽酶和葉酸水解酶活性，據(jù)凈艮道參與前列腺生長(zhǎng)和分化的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)(Heston,W.D.(1996)Urologe—AusgabeA.35:400-407)。PSM，是位于細(xì)胞質(zhì)中的PSMA的一種可變剪接形式。PSMA主要由前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)。在前列腺癌中，特別是在低分化的、轉(zhuǎn)移的和激素難以治療的癌中，PSMA的表達(dá)增加(Gregorakis,A丄等人(1998)SeminarsinUrologicOncology16:2-12;Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:85-515)。在前列腺外組織例知小腸、唾液腺、十二指腸粘膜、近端腎小管和腦中發(fā)現(xiàn)低水平PSMA表達(dá)(Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:85-515)。在一些惡性腫瘤(包括腎細(xì)胞癌和結(jié)腸癌)的腫瘤外周和腫瘤內(nèi)區(qū)域中的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中也表達(dá)PSMA，但是在正常組織的血管中不表達(dá)。另外，據(jù)報(bào)道PSMA與腫瘤血管生成相關(guān)(Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:81-85)。最近，已經(jīng)證明PSMA在結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腎癌和黑素瘤中的肺瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)月包中表達(dá)(Chang，S.S.(2004)Curr0pinInvestigDrugs5:611-5)?？筆SMA胞外域抗體已經(jīng)描述(參見，例如，Liu,H.等人(1997)CancerRes.57:3629—3634;Murphy,G.P.等人(1998)J.Urol.160:2396-2401;Wang，S.等人(2001)Int.J.Cancer92:871-876;Kato，K.等人(2003)Int.J.Urol.10:439-444;美國專利No.6,150,508和美國專利No.6,107,090)。最近，與PSMA結(jié)合的人和人源化抗體已經(jīng)描述(參見，例如，Bander,N.H.等人(2003)Semin.Oncol.30:667-676;PCT公布WO02/098897;PCT公布WO01/09192;PCT公布WO03/064606;PCT公布WO03/034903;和美國申請(qǐng)No.2004/0033229)。這些抗體已經(jīng)用于對(duì)前列腺癌細(xì)胞成像(參見，例如，Yao，D.等人UOO2)Semin.Urol.Oncol.20:211—218;Bander,N.H.等人(2003)J.Urol.170:1717-1721)?？?PSMA抗體也已經(jīng)在前列腺癌治療中用于治療性干預(yù)，一般與化療劑或》丈射性同位素聯(lián)合^f吏用(參見，例如，Nanus,D.M.等人(2003)J.Urol.170:S84-89;Milowsky，M.I.等人(2004)J.Clin.Oncol.22:2522-2531;Henry,M.D.等人(2004)CancerRes.64:7995-8001)。因此，PSMA是一種用于治療前列腺癌和以PSMA表達(dá)為特征的多種其他疾病的有價(jià)值的靶標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供與PSMA結(jié)合的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。本發(fā)明的抗體具有所需的特性，例如對(duì)PSMA的高親和力，被表達(dá)PSMA的細(xì)胞內(nèi)化的能力，和高熔解溫度(meltingtemperature)。優(yōu)選地本發(fā)明的抗體具有至少67°C,或者至少69°C,或者至少7rc的熔解溫度。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。本發(fā)明還提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VKL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)人Vh3-30.3基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VkL18基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)人Vh5-51基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VkL18基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:13、14、15和16的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:17、18、19和20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:25、26、27和28的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO'9的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO13的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO17的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO21的輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO.25的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:29的輕鏈可變區(qū)CDR3。另--優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:22的輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO:26的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:30的輕鏈可變區(qū)CDR3。另--優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO11的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO15的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO19的重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO23的輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO:27的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:31的輕鏈可變區(qū)CDR3。另--優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO:12的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:24的輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR3。本發(fā)明的其他優(yōu)選抗體或其抗原結(jié)合部分包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3和4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:5、6、7和8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一優(yōu)選組合包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體可以是，例如，如IgGl或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體?；蛘撸@些抗體可以是抗體片段，如Fab或Fab，2片段，或單鏈抗體。本發(fā)明還提供一種免疫偶聯(lián)物，其包含與諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素等治療劑連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)，特異性。，、二,、二…—乂。.，。，異性分子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。分的護(hù)酸分以及包含這些核酸的表達(dá)載體，和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。另一方面，本發(fā)明提供一種抑制受試者中胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤細(xì)胞或靠近該腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA，該方法包括給該受試者施用有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量的本發(fā)明的抗PSMA人抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供基于本文提供的抗-PSMA抗體的序列制備"第二代"抗-PSMA抗體的方法。例如，本發(fā)明提供制備抗-PSMA抗體的方法，該方法包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的CDR1序列、選自SEQIDNO:13、14、15和16的CDR2序列、和選自SEQIDNO:17、18、19和20的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的CDR1序列、選自SEQIDNO:25、26、27和28的CDR2序列、和選自SEQIDNO:29、30、31和32的CDR3序列；(b)改變至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制或阻止受試者中腫瘤(例如前列腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤)生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA。該方法包括給受試者聯(lián)合施用均為有效抑制或阻止肺瘤生長(zhǎng)的量的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑。在另一方面，本發(fā)明提供一種刺激受試者中腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，其中該胂瘤的細(xì)胞或靠近該肺瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA。該方法包括給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑，其量均為有效刺激腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的量。另一方面，本發(fā)明提供一種抑制受試者中與胂瘤相關(guān)的惡病質(zhì)的方法，其中該肺瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA。該方法包括給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑，其量均為有效抑制受試者中與腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)的量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制的協(xié)同效應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，抗腫瘤劑導(dǎo)致對(duì)腫瘤塊的損害，由此導(dǎo)致腫瘤的更有效的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在另一實(shí)施方案中，抗-PSMA抗體可以是7F12、1C3、2A10、2F5或2C6抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗腫瘤劑是化療劑，例如泰索帝(Taxotere)⑧(多西紫杉醇)。在另一實(shí)施方案中，所述抗腫瘤劑是抗血管發(fā)生劑，例如制管張素K1-3、Arresten、aaAT、血管能抑素(Canstatin)、DL-a-二氟曱基鳥氨酸、內(nèi)皮抑制素、煙曲霉素、染料木黃酮、米諾環(huán)素、星形孢菌素、沙利度胺和腫瘤抑素(Tumstatin)。在另一實(shí)施方案中，所述抗腫瘤劑是免疫調(diào)節(jié)劑，如抗-PDl抗體、抗-CTLA-4抗體、碌u代磷酸酯寡脫氧核糖核苷酸(1018ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT9907)、白介素-12和白介素-21。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定能夠與抗-PSMA抗體在抑制或阻止胂瘤生長(zhǎng)中協(xié)同作用的抗腫瘤劑的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA。該方法包括使指示成分接觸(a)單獨(dú)的待測(cè)抗腫瘤劑，(b)單獨(dú)的抗-PSMA抗體，和(c)待測(cè)抗腫瘤劑和抗-PSMA抗體，并且將(a)單獨(dú)的^f寺測(cè)抗腫瘤劑和(b)單獨(dú)的抗-PSMA抗體抑制或阻止肺瘤生長(zhǎng)的能力與(c)待測(cè)抗腫瘤劑和抗-PSMA抗體抑制或阻止胂瘤生長(zhǎng)的能力進(jìn)行比較，其中(c)抑制或阻止肺瘤生長(zhǎng)的程度大于(a)和(b)的加合效應(yīng)將導(dǎo)致鑒定出能夠與抗-PSMA抗體在抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)中協(xié)同作用的抗肺瘤劑。在另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其含有有效抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的量的抗-PSMA抗體(例如7F12、1C3、2A10、2F5或2C6)和抗腫瘤劑(例如泰索帝⑧(多西紫杉醇)、制管張素Kl-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-a-二氟曱基鳥氨酸、內(nèi)皮抑制素、煙曲霉素、染料木黃酮、米諾環(huán)素、星形孢菌素、沙利度胺、腫瘤抑素、抗-PDl抗體、抗-CTLA-4抗體、^危代^岸酸酯寡脫氧核糖核苷酸(1018ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT9907)、白介素-12或白介素-21)，和藥學(xué)上可接受的載體，或含有有效刺激腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的量的上述抗-PSMA抗體和抗肺瘤劑以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳述和實(shí)施例將是顯而易見的，該詳述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank項(xiàng)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。圖1A顯示1C3人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:33)和氨基酸序列(SEQIDNO:1)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:9)、CDR2(SEQIDNO:13)和CDR3(SEQIDNO:17)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖IB顯示1C3人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:37)和氨基酸序列(SEQIDNO:5)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:21)、CDR2(SEQIDNO:25)和CDR3(SEQIDNO:29)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖2A顯示2A1G人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:34)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:10)、CDR2(SEQIDNO:14)和CDR3(SEQIDNO:18)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖2B顯示2A10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:38)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:22)、CDR2(SEQIDNO:26)和CDR3(SEQIDNO:30)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖3A顯示2F5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:35)和氨基酸序列(SEQIDNO:3)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:11)、CDR2(SEQIDNO:15)和CDR3(SEQIDNO:19)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖3B顯示2F5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:39)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:23)、CDR2(SEQIDNO:27)和CDR3(SEQIDNO:31)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖4A顯示2C6人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:36)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:12)、CDR2(SEQIDNO:16)和CDR3(SEQIDNO:20)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖4B顯示2C6人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核香酸序列(SEQIDNO:40)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:24)、CDR2(SEQIDNO:28)和CDR3(SEQIDNO:32)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5顯示1C3的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:l)與人種系VH3-30.3氨基酸序列(SEQIDNO:41)和JH6b種系(SEQIDNO:45)的比只于。圖6顯示2A10(SEQIDNO:2)、2F5(SEQIDNO:3)和2C6(SEQIDNO:4)的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:42)的比對(duì)。圖7顯示1C3(SEQIDNO:5)、2A10(SEQIDNO:6)和2F5(SEQIDNO:7的殘基1-107)的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VkL18氨基酸序列(SEQIDNO:43)和JK4種系(SEQIDNO:46)的比對(duì)。圖8顯示2C6的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:8)與人種系VkL6氨基酸序列(SEQIDNO:44)和JK3種系(SEQIDNO:47)的比對(duì)。圖9顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果證明抗人PSMA的人單克隆抗體2F5、2A10和2C6與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合。圖10顯示ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果證明抗人PSMA的人單克隆抗體與從LNCaP細(xì)胞中純化的PSMA特異性結(jié)合。圖11A-11B是抗體結(jié)合竟?fàn)幯芯康慕Y(jié)果，該結(jié)果證明抗人PSMA的人單克隆抗體2A10和7F12竟?fàn)幗Y(jié)合表達(dá)PSMA的LNCaP前列腺癌細(xì)胞。圖11A顯示125I-7F12與冷7F12抗體的竟?fàn)?。圖11B顯示125I-2A10與冷2A10抗體的竟?fàn)帯D12A-12B顯示通過4-胸苷釋放試驗(yàn)進(jìn)行的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗PSMA的人單克隆抗體2A10進(jìn)入表達(dá)PSMA的LNCaP前列腺癌細(xì)胞中。圖12A顯示在導(dǎo)入抗體之前接種2小時(shí)的LNCaP細(xì)胞的結(jié)果。圖12B顯示在導(dǎo)入抗體之前接種過夜的LNCaP細(xì)胞的結(jié)果。圖13A-13B顯示用以下任一種治療的小鼠的平均值和中值LNCaP腫瘤異種移植物生長(zhǎng)曲線抗-PSMA7F12抗體、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗(Rituxan)、泰索帝(2mg/kg)、泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)或PBS。圖13C-13D顯示用以下任一種治療的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值體重變化抗-PSMA7F12抗體、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗、泰索帝(2mg/kg)、泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)或PBS。圖14A-14B顯示用以下任一種治療的小鼠的平均值和中值LNCaP腫瘤異種移植物生長(zhǎng)曲線抗-PSMA7F12抗體、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗或PBS。圖14C-14D顯示用以下任一種治療的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值體重變化抗-PSMA7F12抗體、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗或PBS。圖15A-15B顯示用以下任一種治療的小鼠的平均值和中值LNCaP胂瘤異種移植物生長(zhǎng)曲線泰索帝(4mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA7FU抗體聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)或PBS。圖15C-15D顯示用以下任一種治療的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值體重變化泰索帝(4mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(4mg/kg)或PBS。圖16A-16B顯示用以下任一種治療的小鼠的平均值和中值LNCaP腫瘤異種移植物生長(zhǎng)曲線泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)或PBS。圖16C-16D顯示用以下任一種治療的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值體重變化泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)、同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗聯(lián)合泰索帝(2mg/kg)或PBS。圖17A-B顯示細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果，證明毒素偶聯(lián)的人單克隆抗-PSMA抗體經(jīng)(A)3小時(shí)洗滌和(B)連續(xù)洗滌表現(xiàn)出對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖18是給予同種型對(duì)照抗體-藥物偶聯(lián)物、aPSMA抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖。圖19是給予各種含量的ocPSMA抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠胂瘤體積隨時(shí)間的變化圖。圖20是給予各種含量的同種型對(duì)照抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖。圖21是給予各種含量的同種型對(duì)照抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠隨時(shí)間的體重變化圖。圖22是給予各種含量的aPSMA抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠隨時(shí)間的體重變化圖。圖23是對(duì)于初始平均腫瘤體積為240mm3的腫瘤，給予同種型對(duì)照抗體-藥物偶聯(lián)物、aPSMA抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖。圖24是對(duì)于初始平均腫瘤體積為430mn^的腫瘤，給予aPSMA抗體-藥物偶聯(lián)物或單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液(載體)的小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與PSMA高親和力特異性結(jié)合的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體來源于特定重鏈和輕鏈種系序列，和/或包含特定結(jié)構(gòu)特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子、和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用該抗體的方法，例如用于治療疾病如癌癥。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。術(shù)語"前列腺特異性膜抗原，，和"PSMA"在本文中可以互換使用，包括細(xì)胞天然表達(dá)的并且保持與本文所述抗體1C3、2A10、2F5或2C6結(jié)合的人PSMA的任何變體、同種型和物種同源物。人PSMA蛋白的完整的氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為NP—004467。編碼人PSMA蛋白的完整的cDNA序列的Genbank登錄號(hào)為麗_004476。"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"是指在信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞的一部分向一個(gè)細(xì)胞的另一部分傳送中起作用的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。本文使用的短語"細(xì)胞表面受體"包括，例如，能夠接收信號(hào)和跨過細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號(hào)的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的"細(xì)胞表面受體"的一個(gè)例子是PSMA受體。本文提到的術(shù)語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即"抗原結(jié)合部分")或單鏈。"抗體"是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、Ch2和Ch3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域"組成。Vh和Vt區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè)Vh和Vl均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列FR1,CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3,CDR3,FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱為"抗體部分，，)是指保留與抗原(例如PSMA)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來行使。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由V"VH、Cl和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)由Vh和"結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域l和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中Vl和VH區(qū)配對(duì)構(gòu)成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對(duì)這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與PSMA特異性結(jié)合的分離的抗體基本不含與除PSMA以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。但是，與PSMA特異性結(jié)合的分離的抗體與諸如來自其他物種的PSMA分子等其他抗原可以具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。本文使用的術(shù)語"人抗體"包括具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也來源于人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術(shù)語"人抗體，，不包括其中來源于另一哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。術(shù)語"人單克隆抗體，，是指表現(xiàn)為單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中獲得。本文使用的術(shù)語"重組人抗體"包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的Vh和Vl區(qū)的氨基酸序列盡管是來源于人種系Vh和VL序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中本文使用的術(shù)語"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。短語"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體，，在此與術(shù)語"與抗原特異性結(jié)合的抗體"可互換使用。術(shù)語"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物。術(shù)語"人源化抗體，，是指其中來源于另外一種哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。術(shù)語"嵌合抗體"是指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來源于另一個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。本文使用的術(shù)語"與人PSMA特異性結(jié)合，，的抗體是指以5xl(T8M或更低、更優(yōu)選lxlG—8M或更低、更優(yōu)選5xl(TM或更低、更優(yōu)選1.2xl(T9M或更低、甚至更優(yōu)選1.2xl(TM至1.2xlO_1°M之間或更低的K。與人PSMA結(jié)合的抗體。本文使用的術(shù)語"Ka，"或"Ka"是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文使用的術(shù)語"Kdis"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術(shù)語"Kd"是指解離常數(shù)，它是由Kd與L的比值獲得的(即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度(M)?？贵w的K。值可能用本領(lǐng)域建立的方法測(cè)定。測(cè)定抗體K。的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如81&"^@系統(tǒng)。本文使用的術(shù)語IgG抗體的"高親和力"是指抗體對(duì)于靶抗原的K。為1G—7M或更低、更優(yōu)選1G—8M或更低、更優(yōu)選1G—9M或更低、更優(yōu)選—lflM或更低。但是對(duì)于其他抗體同種型來說，"高親和力"結(jié)合可能不同。例如，對(duì)于IgM同種型來說，"高親和力"結(jié)合是指抗體具有1G—7M或更低、更優(yōu)選1G—8M或更低、甚至更優(yōu)選10—9M或更低的KD。本文使用的術(shù)語"載體，，是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是"質(zhì)粒"，它是指環(huán)形雙鏈DM環(huán)，其中可以連接另外的DM片段。另一種載體類型是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能夠在它所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠引導(dǎo)與它們有效連接的基因的表達(dá)。這些載體在本文中被稱為"重組表達(dá)載體"(或者簡(jiǎn)稱為"表達(dá)載體")。通常在重組DM技術(shù)中使用的表達(dá)載體常常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒，，和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明也包括其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等同的功能。本文使用的術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)稱為"宿主細(xì)胞")是指已經(jīng)導(dǎo)入了重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語不僅指特定受試者的細(xì)胞，而且指該細(xì)胞的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響，某些修飾可能在后代中發(fā)生，這些后代實(shí)際上可能與親本細(xì)胞不同，但是仍然包含在本文使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"中。重組宿主細(xì)胞包括，例如，CH0細(xì)胞、轉(zhuǎn)染瘤和淋巴細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"受試者，，包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語"非人類動(dòng)物"包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，，是指具有含有一種或多種人類重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(整合或者非整合到動(dòng)物的天然基因組DNA內(nèi))的基因組并且能夠表達(dá)完全人類抗體的非人類動(dòng)物。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可能具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，使得該小鼠在用PSMA抗原和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞免疫時(shí)產(chǎn)生人抗-PSMA抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合到小鼠的染色體DNA內(nèi)，例如轉(zhuǎn)基因(例如HuMAb)小鼠，或者人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保持在染色體外，如W002/43478所述的轉(zhuǎn)染色體(例如KM)小鼠。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠通過經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換能夠產(chǎn)生抗PSMA人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)。本文使用的術(shù)語"受試者，，包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語"非人類動(dòng)物，，包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。本發(fā)明的各個(gè)方面在下面的部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述。抗-PSMA抗體本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與人PSMA特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與PSMA高親和力結(jié)合，例如K。為5xl(TM或更低。作為另一個(gè)例子，抗體與表達(dá)PSMA的LNCaP(ATCCCRL-1740)細(xì)胞系特異性結(jié)合。評(píng)價(jià)抗體與PSMA結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定在本領(lǐng)域中公知，包括，例如ELISA、Westernblots和RIA。合適的測(cè)定在實(shí)施例中詳細(xì)描述?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法來評(píng)<介，例如ELISA、Scatchard和Biacore分析。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選性質(zhì)包括被表達(dá)PSMA的細(xì)胞內(nèi)化的能力和高熱穩(wěn)定性。抗體的內(nèi)化可以如實(shí)施例6所述評(píng)價(jià)。熱穩(wěn)定性可以如實(shí)施例7所述評(píng)價(jià)。本發(fā)明優(yōu)選的抗體的熔點(diǎn)至少為65°C,更優(yōu)選至少66°C，更優(yōu)選至少67°C，更優(yōu)選至少68°C,更優(yōu)選至少69°C,更優(yōu)選至少70°C,更優(yōu)選至少71°C。本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有67X:至72°C,更優(yōu)選68。C至72°C，或69。C至72。C,或7(TC至72。C，或69。C至71.43。C的熔點(diǎn)，或者抗體的熔點(diǎn)大約為71.43°C。單克隆抗體1C3、2A10、2F5和2C6本發(fā)明優(yōu)選的抗體是如實(shí)施例1和2所述分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體1C3、2A10、2F5和2C6。1C3、2A10、2F5和2C6的VH氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:1、2、3、4中。1C3、2A10、2F5和2C6的Vt氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:5、6、7、8中。假定這些抗體中的每一個(gè)都能夠與PSMA結(jié)合，則Vh和W序列可以"混合并匹配"，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PSMA結(jié)合分子。PSMA與這些"混合并匹配的，，抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如FACS或ELISA)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)Vh和Vj連混合并匹配時(shí)，來自特定VH/Vt配對(duì)的VH序列纟皮替換為結(jié)構(gòu)上相似的、序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/W配對(duì)的叭序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的Vl序列。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:5、6、7、8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA、優(yōu)選與人PSMA特異性結(jié)合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供包含1C3、2A10、2F5和2C6的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。1C3、2A10、2F5和2C6的VHCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:9、10、11和12中。1C3、2A10、2F5和2C6的VHCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:13、14、15和16中。1C3、2A10、2F5和2C6的VHCDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:17、18、19和20中。1C3、2A10、2F5和2C6的VKCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:21、22、23和24中。1C3、2A10、2F5和2C6的WCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:25、26、27和28中。1C3、2A10、2F5和2C6的^CDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:29、30、31和32中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat,E丄等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)勾畫出。假如這些抗體均能與PSMA結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由CDRl、2和3區(qū)提供的，則VHCDRl、CDR2和CDR3序列與VKCDRl、CDR2和CDR3序列可以"混合并匹配"(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個(gè)抗體必須含有VHCDRl、CDR2和CDR3和VKCDRl、CDR2和CDR3)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PSMA結(jié)合分子。PSMA與這些"混合并匹配的，，抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試一瞼(例如FACS、ELISA,Biacore分析)來枱，測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VHCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vh序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。同樣，當(dāng)VKCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，通過將一個(gè)或多個(gè)Vh和/或CDR區(qū)序列替換為來自本文公開的單克隆抗體1C3、2A10、2F5和2C6的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的L和、序列。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:13、14、15和16的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO17、18、19和20的氨基酸序列的重21、22、23和24的氨基酸序列的輕25、26、27和28的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與PSMA、優(yōu)選與人PSMA特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:9的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:17的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:21的輕《連可變區(qū)(e)包含SEQIDNO:CDR125的輕《連可變區(qū);和(f)包含SEQIDNO:CDR229的輕鏈可變區(qū)CDR3.在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括:(a)包含SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:14的重4連可變區(qū)CDR2;〔c)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區(qū)CDR3;〔d)包含SEQIDNO.22的輕《連可變區(qū)CDR1;〔e)包含SEQIDNO,26的輕鏈可變區(qū)CDR2;〔f)包含SEQIDNO30的輕鏈可變區(qū)CDR3。t另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括:a)包含SEQIDNO11的重鏈可變區(qū)CDR1;:b)包含SEQIDNO15的重鏈可變區(qū)CDR2;:c)包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR3;:d)包含SEQIDNO:23的輕鏈可變區(qū)CDR1;:e)包含SEQIDNO:27的輕鏈可變區(qū)CDR2;:f)包含SEQIDNO:31的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括:a)包含SEQIDNOb)包含SEQIDNOc)包含SEQIDNOd)包含SEQIDNOe)包含SEQIDNOf)包含SEQIDNO12的重鏈可變區(qū)CDR116的重鏈可變區(qū)CDR220的重鏈可變區(qū)CDR324的輕鏈可變區(qū)CDR128的輕鏈可變區(qū)CDR232的輕鏈可變區(qū)CDR3和和和具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VKL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或來源于人VH3-30.3基因(SEQIDNO:41)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或來源于人VKL18基因(SEQIDNO:43)的輕鏈可變區(qū)；且其中該抗體與PSMA、優(yōu)選與人PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或來源于人VH5-51基因(SEQIDNO:42)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或來源于人VKL18基因(SEQIDNO:44)的輕鏈可變區(qū)；且其中該抗體與PSMA、優(yōu)選與人PSMA特異性結(jié)合。分別具有VH3-30.3和VkL18的Vh和VK的抗體的一個(gè)例子是1C3。分別具有VH5-51和VkL18的Vh和Vk的抗體的例子是2A10和2F5。在本文中，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該人抗體包含"產(chǎn)自，，或"來源于"特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。"產(chǎn)自"或"來源于，，人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高。/。同一性)的人種系免疫球蛋白序列。"產(chǎn)自"或"來源于，，特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo)致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90%相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時(shí)確認(rèn)該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。一般來說，來源于特定人種系序列的人抗體顯示與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況下，該人抗體可能顯示與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個(gè)、或者甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸的差異。同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與本文所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗-PSMA抗體的所需功能特性。例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1、2、3和4的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:5、6、7和8的氨基酸序列至少80°/。同源的氨基酸序列；且(c)該抗體與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞系特異性結(jié)合。在另外一些實(shí)施方案中，Vh和/或Vt氨基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和Vl區(qū)高度(即80%或更高)同源的Vh和Vl區(qū)的抗體可以如下荻得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:33、34、35、36、37、38、39和40的核酸分子，然后用本文所述的功能試-驗(yàn)檢測(cè)編碼的被改變抗體的保留的功能(即以5x10—8M或更低的KD與人PSMA結(jié)合)。本文使用的兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分同一性?？紤]為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度后，兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性=相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)xl00)。兩個(gè)序列之間的序列比4交和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.O版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分，4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可/人http:〃www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM^O矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。另外，或者可替代地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作"查詢序列，，來對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如用來鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50,字長(zhǎng)=3,以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如Altschul等(199"NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和亂AST)的缺省參數(shù)。參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如1C3、2A10、2F5或2C6)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-PSMA抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:17、18、19和20的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且(c)該抗體與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞系特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:13、14、15和16的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:25、26、27和28的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。本文使用的術(shù)語"保守序列修飾"是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域-公知的標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、P-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用本文所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)改變的抗體保留的功能(即(C)所述的功能)。與本發(fā)明的抗-PSMA抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任意PSMA單克隆抗體結(jié)合相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉竟?fàn)幗Y(jié)合PSMA的抗體)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于交叉竟?fàn)幯芯康膮⒈瓤贵w可以是單克隆抗體1C3(具有分別如SEQIDNO:1和5所示的Vh和、序列)或單克隆抗體2A10(具有分別如SEQIDNO:2和6所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體2F5(具有分別如SEQIDNO:3和7所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體2C6(具有分別如SEQIDNO:4和8所示的Vh和Vl序列)。這些交叉竟?fàn)幙贵w可以根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)PSMA結(jié)合測(cè)定中與1C3、2A10、2F5或2C6交叉竟?fàn)幍哪芰龛b定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測(cè)定或流式細(xì)胞分析來i正明與本發(fā)明抗體的交叉竟?fàn)帯１辉嚳贵w抑制例如1C3、2A10、2F5或2C6與人PSMA結(jié)合的能力證明，該被試抗體可以與1C3、2A10、2F5或2C6竟?fàn)幗Y(jié)合人PSMA,因此與1C3、2A10、2F5或2C6結(jié)合人PSMA上相同的表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與1C3、2A10、2F5或2C6結(jié)合人PSMA上相同表位的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實(shí)施例所述制備和分離。工程化抗體和修飾的抗體本發(fā)明的抗體還可以如下制備用具有本文所公開的一種或多種Vh和/或VL序列的抗體作為起始材津牛，改造一種纟務(wù)飾的抗體，該修飾的抗體可具有與起始抗體相比改變的特性?？梢酝ㄟ^修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即Vh和/或vj例如一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基來構(gòu)建改造抗體。另外或者可替代地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來改造抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能。可以進(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程化是CDR移植?？贵w主要是通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個(gè)原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個(gè)抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann,L.等(1998)Nature332:323-327;Jones,P.等(1986)Nature321:522-525;Queen,C.等(1989)Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美國專利5,225,539，和Queen等人的美國專利5,530,101;5，585，089;5，693，762和6，180，370)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:9、10、11和12、SEQIDNO:13、14、15和16和SEQIDNO:17、18、19和20的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:21、22、23和24、SEQIDNO:25、26、27和28和SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體1C3、2A10、2F5或2C6的Vh和叭CDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)"VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫(可從因特網(wǎng)上www,mrc-cpe.cam,ac,uk/vbase獲得)，以及Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242;Tomlinson，I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox，J.P.L.等(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836;其內(nèi)容均在此引用作為參考。抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的VH3-30.3構(gòu)架序列(SEQIDNO:41)和/或VH5-51構(gòu)架序列(SEQIDNO:42)和/或VkL18構(gòu)架序列(SEQIDNO:43)和/或VkL6構(gòu)架序列(SEQIDNO:44)。VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國專利5，530，101;5,585,089;5，693，762和6，180，370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是突變Vh和/或VkCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合的影響或者其他目標(biāo)功能特性可以用此處所述和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。優(yōu)選引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)不超過1、2、3、4或5個(gè)殘基。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-PSMA單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)VHCDR1區(qū)，其包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的氨基酸序列，或與SEQIDNO:9、10、11和12相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:13、14、15和16的氨基酸序列，或與SEQIDNO:13、14、15和16相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:17、18、19和20的氨基酸序列，或與SEQIDNO:17、18、19和20相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDR1區(qū)，其包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的氨基酸序列，或與SEQIDNO:21、22、23和24相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:25、26、27和28的氨基酸序列，或與SEQIDNO:25、26、27和28相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列，或與SEQIDNO:29、30、31和32相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對(duì)其VH和/或VK內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基"回復(fù)突變，，為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。這種"回復(fù)突變，，的抗體也包括在本發(fā)明中。例如，對(duì)于2C6,、的氨基酸殘基#9(FR1內(nèi))是絲氨酸，而在相應(yīng)的VK5-51種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(例如)定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變"回復(fù)突變"為種系序列(例如，2C6的Vh的FR1的殘基9可以從絲氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸)。另一個(gè)例子是，對(duì)于2F5，VH的氨基酸殘基t84(FR3內(nèi))是天冬酰胺，而在相應(yīng)的VH5-51種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將2F5的Vh的FR3的殘基#18從天冬酰胺"回復(fù)突變，，為絲氨酸。另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、乃至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，由此降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為"脫免疫"，在Carr等人的公布號(hào)為20030153043的美國專利中詳細(xì)記載。除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾以改變其糖基化，由此改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利No.5，677，425號(hào)中詳細(xì)記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了(例如)促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc4交鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在Ward等人的美國專利No.6,165,745號(hào)中詳細(xì)記載。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期?？梢允褂酶鞣N方法。例如，如Ward的美國專利No.6,277,375所述，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美國專利No.5,869,046和6,121,022所述，為了提高生物半衰期，該抗體可以在CH1或CL區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變，使之含有來自IgGFc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位。在其他一些實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的Cl成分。該方法在Winter等人的美國專利No.5，624,821和5，648，260中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國專利No.6,194,551中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，改變氨基酸位點(diǎn)239、10、11和1239中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO94/29351中進(jìn)一步描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對(duì)FcY受體的親和力，通過在下列位點(diǎn)處修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fc區(qū)238，239,248,249,252，254，255，256，258，265，267,268，269，270,272，276，278,280,283，285，286,289,290,292，293，294,295,296,298，301，303，305，307,309，312，315，320，322，324,326,327，329,330,331,333，334，335，337，338，340，360,373，376，378,382,388,389,398,414，416,419，430，434，435,437，438或439。該方法在Presta的PCT公布WO00/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgGl上對(duì)于FcyRI、FcyRn、FcyRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位點(diǎn)256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcyRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcyRIII的結(jié)合T256A/S298A,S298A/E333A,S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在另一實(shí)施方案中，改變抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對(duì)抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過(例如)改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，使一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn)處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國專利No.5，714，350和6，350，861中更詳細(xì)地4苗述。另外，或者可替代地，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過(例如)在具有改變的糖基化機(jī)制的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。具有改變的糖基化機(jī)制的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì)胞在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，細(xì)胞系Ms7(M、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8(oc(l，6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。通過使用兩種替代載體定向破壞CH0/DG44細(xì)胞中的FUT8基因，產(chǎn)生Ms704、Ms705和Ms709FUT8+細(xì)胞系(參見Yamane等的美國專利申請(qǐng)No.20O40110704和Yamane-Ohnuki等.(20(M)BiotechnolBioeng87:614-22)。另一個(gè)例子是，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，F(xiàn)UT8基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，通過減少或消除了a(1,6)鍵相關(guān)的酶，在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結(jié)合抗體Fc區(qū)的N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有這種酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公布W003/035835記載了一種變異CHO細(xì)胞系，Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公布W099/54342記載了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如(3(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例如，巖藻糖苷酶a-L-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基(Tarentino，A.L.等.(1975)Biochem.14:5516-23)。本發(fā)明涉及的對(duì)此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)可與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。本文使用的術(shù)語"聚乙二醇，，包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(Cl-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是無糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中7^知，并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384?？贵w工程化方法如上所述，能夠利用具有此處公開的Vh和Vk序列的抗-PSMA抗體，通過修飾Vh和/或Vk序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-PSMA抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-PSMA抗體(例如1C3、2A10、2F5或2C6)的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗-PSMA抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人PSMA結(jié)合。如上所述，例如，1C3、2A10、2F5或2C6的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-PSMA抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。而是利用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該"第二代"序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-PSMA抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的CDR1序列、選自SEQIDNO:13、14、15和16的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:17、18、19和20的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的CDR1序列、選自SEQIDNO:25、26、27和28的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:29、30、31和32的CDR3序列;(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將所述改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-PSMA抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞系特異性結(jié)合。改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的(如實(shí)施例中所述的)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測(cè)定)來評(píng)價(jià)。在本發(fā)明抗體的工程化方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-PSMA抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對(duì)結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-PSMA抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT/>布W002/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布W003/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法與其他細(xì)胞成分或其他摻雜物(例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時(shí)，核酸是"分離的"或"基本上純的，，。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本發(fā)明的4亥酸可以是，例^口，DNA或RM,并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對(duì)于雜交瘤(例如，由如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對(duì)于(例如使用噬菌體展示技術(shù))從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體，可以從文庫中回收編碼該抗體的核酸。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼1C3、2A10、2F5或2C6單克隆抗體的VH和VL序列的核酸分子。編碼1C3、2A10、2F5或2C6的VH序列的DNA序列分別在SEQIDNO:33、34、35和36中示出。編碼1C3、2A10、2F5或2C6的VL序列的DNA序列分別在SEQIDNO:37、38、39和40中示出。一旦獲得編碼VH和VL片段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另一個(gè)DNA片段有效連接。如本文使用的術(shù)語"有效連接，，意思是兩個(gè)MA片段連接在一起，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀框內(nèi)。通過將編碼VH的DM與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CHI恒定區(qū)的另外一種DNA分子有效連接。通過將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例^口，Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或X恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是K恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQIDNO:48)的另外一個(gè)片段有效連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其VL和VH區(qū)通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)Proc.Na".Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)能夠通過多種技術(shù)制備，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述獲得的鼠單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其改造為含有非鼠(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國專利No.5，225，539,和Queen等人的美國專利No.5,530,101;5，585，089;5，693,762和6,180，370)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗PSMA人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別被稱作HuMAb小鼠和KM小鼠tm的小鼠，并且在此通稱為"人Ig小鼠，，0HuMab小鼠⑧(Medarex，Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(ja和y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源(I和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或K表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgGK單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994),同上；綜述Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93，和Harding,F.和Lonberg，N.(1995)Ami.N.Y.Acad.Sci764:536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor,L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen,J.等(1993)InternationalImmunology5:647-656;Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90:3720-3724;Choi等(1993)NatureGenetics4:117-123;Chen,J.等(1993)EMB0J.12:825-5130;Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等(1994)InternationalImmunology6:579-591;和Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，Lonberg和Kay的美國專利No.5,545,806;5,569,825;5，625，126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;和5,770,429;和Surani等人的美國專利No.5,545,807;Lonberg和Kay的PCT7>布號(hào)WO92/03918，WO93/12227,WO94/25585，WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962;和Korman等人的PCT公布號(hào)W001/14424。在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此被稱為"KM小鼠，，，在Ishida等人的PCT公布WO02/43478中詳細(xì)描述。再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利No.5，939，598;6,075,181;6，114,598;6,150，584和6，162，963中描述。而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠，，；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889-894),其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法來制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國專利No.5,223,409;5，403,484;和5,571,698;Dower等人的美國專利No.5,427,908和5,580,717;McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和6,172,197;和Griffiths等人的美國專利No.5，885，793;6，521，404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6，593，081。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國專利No.5，476,996和5，698，767中描述。人Ig小鼠的免疫當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，可以根據(jù)Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474):856—859;Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851;和PCT公布￥098/24884和WO01/14424所述，用表達(dá)PSMA的細(xì)胞系如LNCaP細(xì)胞系(ATCCCRL-1740)、純化的或富集的PSMA抗原和/或重組PSMA制劑、或PSMA融合蛋白免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時(shí)小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的PSMA抗原的制劑(5-50jag)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。產(chǎn)生抗PSMA完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在下面的實(shí)施例1中描述。應(yīng)用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)除弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時(shí)，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免疫方案進(jìn)程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-PSMA人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HC07和HCo12轉(zhuǎn)基因可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠?？商娲幕蛘吡硗猓梢允褂肒M小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。針對(duì)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50%PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X6!3-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC,CRL1580)融合。細(xì)胞以大約2xl05的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20%胎克隆血清，18%"653"條件基質(zhì)，5%Origen(IGEN)，4mML—谷氛醜胺，1mM丙酉同酉菱4內(nèi)，5mMHEPES,0.055mM2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;融合后24小時(shí)加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA根據(jù)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對(duì)于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，N丄)進(jìn)行親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色i普法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且在-80°C下保存。產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備利用(例如)本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如,Morrison,S.(1985)science229:1202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，并將該DM插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語"有效連接，，意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個(gè)基因插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段上與載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的活，則平端連接)。通過將本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得Vh區(qū)段與栽體中的Ch區(qū)段有效連接，而Vk區(qū)段與栽體中的"區(qū)段有效連接，可以產(chǎn)生任意抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外，或者可替代的，重組表達(dá)載體可以編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?？商娲乜梢?吏用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或(3-珠蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自諸如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)等不同來源的序列組成，SRoc啟動(dòng)子系統(tǒng)含有來自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Takebe,Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞(參見，例如，Axel等人的美國專利No.4,399,216，4，634，665和5,179,017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氬葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細(xì)胞中用于氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，因?yàn)檫@樣的真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，抗體基因的原核表達(dá)無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CH0細(xì)胞)(包括Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CH0細(xì)胞，和DHFR選捧性標(biāo)記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是W087/04462、W089/01036和EP338,841/>開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的時(shí)間，而產(chǎn)生抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體?？贵w與抗原結(jié)合的表征通過(例如)流式細(xì)月包術(shù)，可以4企測(cè)本發(fā)明的抗體與PSMA的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說，從組織培養(yǎng)瓶中新鮮收獲LNCaP細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。LNCaP細(xì)胞懸液直接用第一抗體染色或在用10%多聚曱醛的PBS溶液固定后染色。將約1百萬個(gè)細(xì)胞重懸浮在含有0.5%BSA和50-200|ag/ml第一抗體的PBS中，在冰上溫育30分鐘。用含有0.1%BSA，0.01%Na&的PBS洗滌細(xì)胞兩次，重懸浮在100pl的1:100稀釋的FITC—4禺聯(lián)的山羊4元人IgG(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)中，再在冰上溫育30分鐘。再次洗滌細(xì)胞兩次，重懸浮在0.5ml洗滌緩沖液中，用FACSCalibur血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton-Dicki謂n，SanJose,CA)分析焚光染色。可替代地，通過(例如)標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以4全測(cè)本發(fā)明的抗體與PSMA的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說，用0.25)ug/ml的純化PSMA在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。向各個(gè)孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自PSMA免疫小鼠的血漿的稀釋液)，并且在37。C下溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，之后與偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的第二試劑(例如，對(duì)于人抗體，為山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑)一起在37。C下溫育1小時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用pNPP底物(lmg/ml)顯色，并且在OD405-650下分析。優(yōu)選地，用表現(xiàn)出最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與PSMA免疫原有陽性反應(yīng)性的雜交瘤。將與PSMA高親合力結(jié)合的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個(gè)雜交瘤中選擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個(gè)克隆(通過ELISA),制備5-10小瓶細(xì)胞庫，保存在-14(TC下，用于抗體純化。為了純化抗-PSMA抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色^普;險(xiǎn)查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,并且使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)0D，確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-8(TC下保存。為了確定選擇的抗-PSMA單克隆抗體是否與獨(dú)特表位結(jié)合，可以^吏用商售試劑(Pierce,Rockford，IL)將每種抗體生物素化?？梢约裚用如上所述的PSMA包被的ELISA板，應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行竟?fàn)幯芯俊？梢允褂面溍箍股锼氐鞍?堿性磷酸酶4果針纟企測(cè)生物素化mAb的結(jié)合。此外，也可以用》文射標(biāo)記的抗體進(jìn)行竟?fàn)幯芯?，未?biāo)記的竟?fàn)幙贵w可以在Scatchard分析中檢測(cè)，如下文實(shí)施例中進(jìn)一步描述。為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對(duì)特定同種型抗體具有特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4"C下用l|_ig/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用ly。BSA封閉之后，平板與ljig/ml或更少的測(cè)試單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照物在室溫下反應(yīng)1-2小時(shí)。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。可以通過Western印跡法進(jìn)一步檢測(cè)抗-PSMA人IgG與PSMA抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)要地說，制備PSMA并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測(cè)的單克隆抗體探針結(jié)合。人IgG的結(jié)合可以用抗人IgG石咸性磷酸酶^r測(cè)，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis,Mo.)顯色。免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明涉及與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯(lián)的抗-PSMA抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為"免疫偶聯(lián)物"。包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作"免疫毒素，，。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒P塞吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和噤呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如抗代謝物(例如，氨曱喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BS麗)和洛莫司汀(CC冊(cè))、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個(gè)例子是可作為商品購得的(MylotargTM;Wyeth-Ayerst)?？梢岳帽绢I(lǐng)域使用的連接體技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的連接體類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體?？梢赃x擇(例如)在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的連接體和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;Trail,P丄等(2003)Cancer.Immunol.I醒nother.52:328-337;Payne,G.(2003)CancerCell3:207—212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan,I.禾口Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089—1091;Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也被稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、硤125、銦m、釔9°和镥'"。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括Zevalin(IDECPharmaceuticals)和Bexxar(CorixaPharmaceuticals),并且肯l本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于改變特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素，；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-l("IL-l")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF")或其他生長(zhǎng)因子。將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，in單克隆抗體AndCancerTherapy,Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellstrora等,"AntibodiesForDrugDelivery，，,inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等(ecL)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview"，in單克隆抗體'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(ed.),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",in單克隆抗體For<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>雙特異性分子另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗-PSMA抗體或其片段的雙另一個(gè)功能性分子上，如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì)(例如另一個(gè)抗體或受體的配體)上，從而生成可與至少兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)或靶分子結(jié)合的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體實(shí)際上可以被衍生化或連接到一個(gè)以上的其他功能性分子上，從而生成可與兩個(gè)以上不同結(jié)合位點(diǎn)和/或靶分子結(jié)合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在本文使用的術(shù)語"雙特異性分子"內(nèi)。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可與一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合等)，從而得到雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，其具有至少一種對(duì)于PSMA的第一結(jié)合特異性和對(duì)于第二種目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，第二種目標(biāo)表位是Fc受體，如人FcyRI(CD64)或人Fca受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達(dá)FcYR或FcaR的效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))結(jié)合，又能與表達(dá)PSMA的靶細(xì)胞結(jié)合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達(dá)PSMA的細(xì)胞導(dǎo)向于效應(yīng)細(xì)胞，并且觸發(fā)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬作用、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放、或超氧陰離子的產(chǎn)生。在雙特異性分子是多特異性分子的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除抗-Fc結(jié)合特異性和抗-PSMA結(jié)合特異性之外，該分子還可包括第三結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第三結(jié)合特異性是抗增強(qiáng)因子(EF)部分，例如與參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)結(jié)合因而增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的分子。"抗增強(qiáng)因子部分"可以是與諸如抗原或受體等特定分子結(jié)合，從而導(dǎo)致結(jié)合決定簇對(duì)Fc受體或靶細(xì)胞抗原的作用增強(qiáng)的抗體、功能性抗體片段或配體。"抗增強(qiáng)因子部分"可與Fc受體或靶細(xì)胞抗原結(jié)合。可替代的，抗增強(qiáng)因子部分可以與一種實(shí)體結(jié)合，該實(shí)體不同于第一和第二結(jié)合特異性所結(jié)合的實(shí)體。例如，抗增強(qiáng)因子部分可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞結(jié)合(如經(jīng)由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細(xì)胞，該細(xì)胞導(dǎo)致針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答增強(qiáng))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個(gè)抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括(例如)Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其最小片段，如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladner等人的美國專利No.4,946,778所述，該專利的內(nèi)容引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于Fcy受體的結(jié)合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。本文使用的術(shù)語"IgG受體，，是指位于染色體1上的8個(gè)y-鏈基因中的任意一個(gè)。這些基因編碼總共12個(gè)跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分組為3個(gè)FcY受體類別Fc"yRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)cY受體是人高親和力FcyRI。人FcyRI是72kDa的分子，對(duì)單體IgG表現(xiàn)出高親和力(108-109nt1)。某些優(yōu)選抗-Fcy單克隆抗體的制備和表征由Fanger等人在PCT申請(qǐng)WO88/00052和美國專利號(hào)4，954，617中描述，將其內(nèi)容整體引入本文作為參考。這些抗體在與受體的Fey結(jié)合位點(diǎn)不同的位點(diǎn)處與FcyRI、FcyRII或FcyRIII的表位結(jié)合，因而，其結(jié)合基本不^皮生理學(xué)水平的IgG阻斷?？捎糜诒景l(fā)明中的特定抗-FcyRI抗體為mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。產(chǎn)生mAb32的雜交瘤可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，ATCC保藏號(hào)為HB9469。在另外一些實(shí)施方案中，抗-Fcy受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征在Graziano,R.F.等(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和PCT公布W094/10332中描述。產(chǎn)生H22抗體的細(xì)胞系以HA022CL1的名稱保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CRL11177。在另外一些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)Fc受體的結(jié)合特異性由可與人IgA受體如Fc-a受體(FcotRI(CD89))結(jié)合的抗體提供，該抗體的結(jié)合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語"IgA受體"包括位于染色體19上的一個(gè)a-基因的基因產(chǎn)物(FcaRI)。已知該基因編碼幾個(gè)55-110kDa的可變剪接跨膜同種型。FcaRI(CD89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達(dá)，但不在非效應(yīng)細(xì)胞群體上組成型表達(dá)。FcocRI對(duì)IgAl和IgA2兩者均具有中等親和力(約5xl07M—1),在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細(xì)胞因子后該親和力增力口(Morton,H.C.等(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已描述了4種FcaRI-特異性單克隆抗體，它們;陂確定為A3、A59、A62和A77，它們?cè)贗gA配體結(jié)合域之外與FcaRI結(jié)合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。FcaRI和FcyRI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選觸發(fā)受體，因?yàn)樗鼈?l)主要表達(dá)于諸如單核細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞上；(2)高水平表達(dá)(如每個(gè)細(xì)胞表達(dá)5,000-100,000個(gè))；(3)是細(xì)胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導(dǎo)導(dǎo)向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強(qiáng)的抗原呈遞。優(yōu)選人單克隆抗體，可以在本發(fā)明的雙特異性分子中使用的其他抗體包括鼠、嵌合和人源化單克隆抗體?？赏ㄟ^應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的方法偶聯(lián)組成的結(jié)合特異性，如抗_FcR和抗-PSMA結(jié)合特異性，來制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結(jié)合特異性可分開生成，然后彼此偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可以使用多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5,5，-二硫代二(2-灘基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡。定二碌u代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己基-1-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(1984)J,Exp.Med.160:1686;Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78，118—132);Brennan等(1985)Science229:85-513和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為SATA和硫代-SMCC，兩者均可從PierceChemicalCo.(Rockford,IL)獲得。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可通過兩個(gè)重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而偶聯(lián)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)鉸鏈區(qū)進(jìn)行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個(gè)，優(yōu)選1個(gè)巰基殘基。可替代的，兩種結(jié)合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。當(dāng)雙特異性分子是mAbxmAb，mAbxFab，F(xiàn)abxF(ab，)2或配體xFab融合蛋白時(shí)，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個(gè)單鏈抗體和一個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。制備雙特異性分子的方法例如在美國專利No.5,260,203、美國專利No.5,455,030、美國專利No.4,881,175、美國專利No.5，132，405，美國專利No.5，091，513、美國專利No.5，476,786、美國專利No.5,013,653、美國專利No.5，258，498和美國專利No.5，482，858中描述。雙特異性分子與其特異性耙標(biāo)的結(jié)合可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、FACS分析、生物測(cè)定(如生長(zhǎng)抑制)或Western印跡分析來證實(shí)。這些試驗(yàn)中的每一個(gè)通常通過應(yīng)用對(duì)目標(biāo)復(fù)合物具有特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)來檢測(cè)特定目標(biāo)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，可以利用識(shí)別和特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測(cè)FcR-抗體復(fù)合物?；蛘?，這些復(fù)合物可利用多種其他免疫分析中的任一種來檢測(cè)。例如，可對(duì)抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記并且在》文射免疫測(cè)定(RIA)中使用(參見，例如，Weintraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,1986年3月，在此引入作為參考)。通過諸如使用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的手段或者通過放射自顯影方法，能夠檢測(cè)放射性同位素。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，活性的抗體組合(或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子)。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的抗-PSMA抗體聯(lián)合至少一種其他的抗炎劑或免疫抑制劑?？稍诼?lián)合治療中使用的治療劑的例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。本文使用的"藥學(xué)上可接受的載體，，包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包裹上一種材料，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽。"藥學(xué)上可接受的鹽，，是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和石威加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鉤等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N,N，-二爺基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(l)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞-克酸鈉，亞;危酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁雍茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、ot-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，才直物油如橄欖油，和注射用?幾酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可含有輔料，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑任何與活性化合物不相容以外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的。可以將組合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100%計(jì)，這個(gè)量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的所需反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時(shí)間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的限制。對(duì)于抗體的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3rag/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg范圍內(nèi)。一個(gè)治療方案的例子需要每周給藥一次、每?jī)芍芤淮巍⒚咳芤淮?、每四周一次、每月一次、?月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-PSMA抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體j吏用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個(gè)月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)?？贵w通常多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測(cè)定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約l-1000|Lig/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300|ag/ml。可替代地，抗體也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況下需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長(zhǎng)的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對(duì)較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)、而對(duì)患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、應(yīng)用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。本發(fā)明的抗-PSMA抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重程度降低、疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對(duì)于PSMA+胂瘤的治療，相對(duì)于未接受治療的受試者，"治療有效劑量"優(yōu)選地將細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約20%，更優(yōu)選至少約40%，更優(yōu)選至少約60%,更優(yōu)選至少約80%。化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)?？商娲?，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)檢查該化合物的體外抑制能力，來評(píng)價(jià)組合物的這種性能。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重程度和選擇的特定組合物或給藥途徑。本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域7>知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。如此處所用的短語"腸胃外給藥，，是指腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、石更膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注?？商娲?，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部?；钚曰衔锟梢耘c保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，SustainedandcontrolledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson:ed.，MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5,399,163;5,383,851;5，312，335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556中^^開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利No.4,486,194,該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233,該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No.4,447,224，該專利/〉開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利No.4,439,196，該專利7>開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利No.4,475,196，該專利7>開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和才莫塊。在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時(shí))，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522，811;5,374,548;和5,399，331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)部分，從而增強(qiáng)靶向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。耙向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5，416，016);甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M.0wais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也參見K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J丄Killion;I丄Fidler(1994)Immunomethods4:273。本發(fā)明的應(yīng)用和方法本發(fā)明的抗體、抗體組合物和方法具有涉及診斷和治療與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病的許多體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。例如，這些分子可以施用于(例如)在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者例如在體內(nèi)施用于人類受試者，從而治療、預(yù)防或診斷多種疾病。本文使用的術(shù)語"受試者"包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、牛、馬、豬、雞、鳥類、兩棲類動(dòng)物和爬行類動(dòng)物。優(yōu)選的受試者包括患有與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病的人類患者。這些方法特別適合治療患有異常PSMA表達(dá)相關(guān)疾病的人類患者。當(dāng)抗PSMA抗體與另一種藥物一起給藥時(shí)，這兩種藥物可以相繼或同時(shí)給藥。在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如抗體或免疫偶聯(lián)物)的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可以通過(例如靜脈內(nèi)或皮下)注射給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或配方。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在開始時(shí)檢測(cè)本發(fā)明的抗體與體外治療或i貪斷應(yīng)用有關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以利用ELISA和流式細(xì)月包測(cè)定法檢測(cè)本發(fā)明的組合物。而且，可以測(cè)定這些分子引發(fā)至少一種效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性(包括抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺傷)的活性。測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC的方案在下面的實(shí)施例中描述。A.4全測(cè)方法在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用來4全測(cè)PSMA的水平，或在膜表面上含有PSMA的細(xì)胞的水平，然后可以將這些水平與特定疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中PSMA抗原的存在或測(cè)定細(xì)胞表面上PSMA抗原的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對(duì)照樣品與特異性結(jié)合PSMA的抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中存在PSMA抗原。例如，可以使用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)枱二測(cè)方法，如ELISA和流式細(xì)胞測(cè)定。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中PSMA(例如人PSMA抗原)的存在或測(cè)定PSMA的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對(duì)照樣品與特異性結(jié)合PSMA的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中存在PSMA。本發(fā)明的組合物也可以用來耙向表達(dá)PSMA的細(xì)胞，例如用于標(biāo)記這些細(xì)胞。為此應(yīng)用，可以將結(jié)合劑與可被檢測(cè)到的分子連接。因此，本發(fā)明提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)PSMA的細(xì)胞的方法?？蓹z測(cè)標(biāo)記物可以是，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。B.PSMA+細(xì)力包的生長(zhǎng)的抑制該抗體可以用來抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)，這又可以與PSMA表達(dá)相關(guān)的某些疾病癥狀的預(yù)防或緩解相關(guān)聯(lián)。與非疾病狀態(tài)相比疾病狀態(tài)期間PSMA表達(dá)的差異可以如下確定在允許在抗體與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，使來自該疾病患者的試樣和對(duì)照樣品與抗PSMA抗體4妄觸。4全測(cè)在抗體與PSMA之間形成的任何復(fù)合物，并對(duì)樣品和對(duì)照進(jìn)行比專交。例如，該抗體可以用來在體內(nèi)或在體外引起一種或多種下列生物活性抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺傷；在人效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬作用或ADCC;抑制可溶性PSMA的脫落。如本文所述，與巖藻糖基化形式的抗體相比，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC活性。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制PSMA+細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，包括在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下，使所述細(xì)胞接觸抗-PSMA抗體。例如，該細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗-PSMA抗體是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以用來調(diào)節(jié)耙細(xì)胞上的PSMA水平，例如通過對(duì)細(xì)胞表面上的受體加帽(capping)以及將其清除?？?Fc受體抗體的混合物也可以用于該目的。輩巴標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物連接的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于耙向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨p盆細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞可以從所治療的受試者中獲得。靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為在生理學(xué)可接受的溶液中的細(xì)胞懸浮液施用。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個(gè)的數(shù)量級(jí)，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處例如在表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞處的局部化，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的殺傷。施用途徑也可以不同。應(yīng)用耙標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物和/或帶有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗胂瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞排斥。C.免疫偶聯(lián)物的應(yīng)用和聯(lián)合治療在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體連接，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以將目標(biāo)化合物(例如治療劑、標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等)靶向至具有PSMA細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。因此，本發(fā)明也提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)PSMA的細(xì)胞的方法(例如應(yīng)用可4企測(cè)標(biāo)記物，如》文射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)?？商娲?，免疫偶聯(lián)物通過將細(xì)胞毒素或放射性毒素靶向至PSMA,也可以用來殺傷具有PSMA細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，如表達(dá)PSMA的肺瘤細(xì)^m由此消除胂瘤細(xì)^^。在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcy或FcY受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素，(IFN，)和腫瘤壞死因子(TNF)。在另一實(shí)施方案中，可以對(duì)用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者另外施用(在施用本發(fā)明的抗體之前、同時(shí)或之后)另一種治療劑，如增強(qiáng)或加強(qiáng)人抗體的治療效果的細(xì)胞毒劑或放射性毒劑?？贵w可以與該治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對(duì)于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時(shí)給藥，或者可以與其他已知治療(如抗癌治療，例如放射治療)共同應(yīng)用。這些治療劑特別包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平時(shí)有效。順鉑以100mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對(duì)人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對(duì)抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。D.癌癥的治療已經(jīng)證明PSMA在胂瘤細(xì)胞如前列腺癌肺瘤細(xì)胞上表達(dá)，也已證明在靠近癌細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞如尿道上皮癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和肝轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞上表達(dá)(見美國專利No.6,136,311)。因此，本發(fā)明的抗體通過抑制表達(dá)PSMA的肺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者通過抑制靠近腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以用來治療癌癥。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞是PSMA+，其中給受試者施用本發(fā)明的抗-PSMA抗體，使腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制。對(duì)于人類受試者，抗體優(yōu)選是人源化或人抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞來自于諸如結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤等癌。本發(fā)明的治療方法包括給受試者施用有效治療或預(yù)防疾病的量的本發(fā)明的抗體組合物?？贵w組合物可以單獨(dú)施用或與諸如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑等另一種治療劑一起施用(與抗體偶聯(lián)或與抗體一起施用)，該另一種治療劑與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同起作用，以治療或預(yù)防與PSMA表達(dá)相關(guān)的疾病。本發(fā)明的治療方法還包括給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體和另一種藥物，如抗腫瘤劑，該另一種藥物與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用，以治療或預(yù)防與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病。如本文所示，抗-PSMA抗體7F12和泰索帝⑧(多西紫杉醇)聯(lián)用導(dǎo)致在動(dòng)物模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)，以及治愈動(dòng)物與腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)(見實(shí)施例8)。不受機(jī)理所限制，據(jù)認(rèn)為使用抗肺瘤劑導(dǎo)致腫瘤塊的損害，因此使抗體、效應(yīng)細(xì)胞或替代效應(yīng)成分能夠改進(jìn)地進(jìn)入，導(dǎo)致更有效的細(xì)胞毒性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用抗腫瘤劑導(dǎo)致腫瘤塊的損害，從而使效應(yīng)細(xì)胞能夠進(jìn)入腫瘤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的更有效的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用抗胂瘤劑例如微管抑制劑使腫瘤細(xì)胞對(duì)由抗PSMA介導(dǎo)的殺傷本質(zhì)上更敏感。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，施用抗-PSMA抗體和抗腫瘤劑獲得的協(xié)同或加合效應(yīng)不依賴于或者并非起因于PSMA抗原對(duì)基底側(cè)質(zhì)膜的頂極性(apicalpolarity)的逆轉(zhuǎn)。本文使用的術(shù)語"抗-PSMA抗體"包括與人前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合的任何抗體。這些抗體的例子包括本文所述的抗體、美國專利申請(qǐng)No.10/059989和PCT公開號(hào)WO03064606A3所述的抗體，或美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/660431所述的抗體。上述每一申請(qǐng)的完整內(nèi)容均引入本文作為參考。本文使用的術(shù)語"抗肺瘤劑"包括可以用來(例如部分或全部)破壞或幫助破壞腫瘤的任何試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗腫瘤劑能夠引起腫瘤塊的損害，由此使效應(yīng)細(xì)胞能夠更容易地進(jìn)入腫瘤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的更有效的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。術(shù)語"抗腫瘤劑"包括化療劑、血管發(fā)生抑制劑、微管阻斷劑、免疫調(diào)節(jié)劑、DNA嵌入劑/交聯(lián)劑、DNA合成抑制劑、DNA-RM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、酶抑制劑和基因調(diào)節(jié)劑。術(shù)語"化療劑，，包括任何可以用來治療癌癥(例如前列腺癌)的試劑?；焺┌ㄍ榛瘎?、抗代謝物、植物生物堿、抗腫瘤抗生素和類固醇激素?；焺┑木唧w例子包括但不限于全反式維曱酸、氨魯米特、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博來霉素(Blenoxane)、白消安(Myeleran)、卡柏、碳柏(伯爾定)、卡莫司汀(BCNU)、卡培他濱、CCNU(洛莫司汀)、苯丁酸氮芥(留可然)、2-氯脫氧腺苷(2-CDA;克拉屈濱、克拉立平)、順-鉑(Platinol)、順鉑(順-DDP)、順鉑硫酸博來霉素、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺(CytoxanlCTX)、環(huán)磷酰胺羥基脲、阿糖胞苷(Ara-C;胞嘧啶阿拉伯糖苷)、柔紅霉素(Cerubidine)、達(dá)卡巴嗪(DTIC;二曱基三氮烯咪唑羧酰胺)、更生霉素(放線菌素D)、柔紅霉素(道諾霉素；柔毛霉素)、己烯雌酚、多西紫杉醇(泰索帝)、去氧氟尿苷、多柔比星(亞德里亞霉素)、表柔比星、乙炔雌二醇(Ethinylestradoil)、依托泊苷(Etopaside)(VP-16、VePesid)、氟尿嘧啶(5-Fu;氟脲嘧咬脫氧核苷、氟脫氧尿嘧咬；FUdR)、氟達(dá)拉濱(Fludara)、氟他胺、氟甲睪酮、吉西他濱(Gemzar)、赫賽汀(曲妥單抗；抗-HER2單克隆抗體)、羥基脲(Hydrea)、己酸羥孕酮、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺(Ifex)、干擾素a、伊立替康(CPT-ll)、L-天冬酰胺酶、亮丙瑞林、二氯曱基二乙胺、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖(Melphelan)(Alkeran)、巰噤呤(6-巰基嘌呤；6-MP)、氨甲喋呤(MTX;曱氨喋呤)、絲裂霉素(絲裂霉素C)、米托坦(o,p'-DDD)、米托蒽醌(Novantrone)、奧沙利鉑、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞、噴司他丁(2-脫氧柯福霉素)、普卡霉素(光輝霉素)、潑尼松、丙卡巴肼(Matulane;N-曱基肼、MIH)、Rituxin(Rituximap)、司莫司汀(曱基-CCNU)、鏈佐星、紅豆杉醇(Taxol)、他莫昔芬、替尼泊苷、Tertiposide、丙酸睪丸酮、硫鳥嘌呤(6-硫代鳥噪呤；TG)、塞替派、雷替曲塞(Raltitrexed)、托泊替康(和美新；(S)-10-[(二曱氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羥基-lH-吡喃[3'，4')、曲奧舒凡(0vastat)、戊柔比星、長(zhǎng)春堿(VLB;Velban)、長(zhǎng)春新石成(Oncovin)、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱(Navelbine)。術(shù)語"微管阻斷劑，，包括任何能夠破壞微管的正常組織和動(dòng)力學(xué)醇)、泰索帝⑧(多西紫杉醇))、長(zhǎng)春花堿類(長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿(Oncovin)、長(zhǎng)春地辛(Eldisine、Fildesin)、長(zhǎng)春瑞濱(Navelbine))、2-曱氧雌二醇(2ME2)、雌莫司汀、埃博霉素(epothilones)、秋水仙堿、多拉司他汀15、諾考達(dá)唑、鬼臼毒素、根霉素。術(shù)語"血管發(fā)生抑制劑，，和"抗血管發(fā)生劑"在本文中可以互換使用，包括任何能夠阻止或抑制血管形成的藥物。血管發(fā)生抑制劑的具體例子包括但不限于制管張素Kl-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-ct-二氟甲基鳥氨酸、內(nèi)皮抑制素、煙曲霉素、染料木黃酮、米諾環(huán)素、星形孢菌素、(±)-沙利度胺和腫瘤抑素。術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)劑"包括任何調(diào)節(jié)(例如刺激)免疫應(yīng)答的藥物。免疫調(diào)節(jié)劑的例子包括，例如單獨(dú)或組合的抗-PD1抗體和抗-CTLA-4抗體，尤其如2005年5月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/679,466;PCT/>開WO01/14424;2005年11月21日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/738,434;和2005年12月8日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)___________(代理人案巻號(hào)MEDX-0124US2或04280/1203401-US1)所述，其完整內(nèi)容引入本文作為參考。號(hào)(例如CD28或ICOS)的抗體、通過CTLA4激活抑制信號(hào)的抗體、和/或抗其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物(例如CD40、CD40配體或細(xì)胞因子)、融合蛋白(例如CTLA4-Fc、PD-l-Fc)和免疫抑制藥物(例如雷帕霉素、環(huán)孢素A或FK506)的抗體。免疫調(diào)節(jié)劑的其他例子包括硫代磷酸酯寡脫氧核糖核苷酸(1018ISS)、GVAX(—種GM-CSF基因疫苗)、白介素(例如，白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7(CYT9907)、-8、-9、-10、-11、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29和-30),例如重組白介素抗體，例如IL-2,例如阿地白介素，例如重組白介素(例如重組白介素-21(rIL-21))，例如IL-ll,例如奧普瑞白介素，例如白介素受體拮抗劑，例如IL-1受體拮抗劑，例如阿那白滯素、葡糖腦苷脂酶，例如伊米苷酶、巨噬細(xì)胞活化因子、巨噬細(xì)胞肽、B細(xì)胞因子和T細(xì)胞因子。DM嵌入劑/交聯(lián)劑的例子包括但不限于博來霉素、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)(順鉑)、美法侖、米托蒽醌和奧沙利鉑。DNA合成抑制劑的例子包括但不限于(±)_氨曱喋呤(氨曱喋呤)、3-氨基-l，2,4-苯并三唑1，4-二氧化物、氨喋呤、胞嘧啶l3-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5'-脫氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韋、羥基脲和絲裂霉素C。DM-RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的例子包括但不限于放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、高三尖杉酯堿和伊達(dá)比星。酶抑制劑的例子包括但不限于S(+)-喜樹堿、姜黃色素、(-)-魚藤素、5，6-二氯苯-咪唑1-P-D-呔喃核糖苷、依托泊苷、福美坦、福司曲星、Hispidin、2-亞氨基-1-咪唑烷乙酸(環(huán)肌酸)、洛伐他汀、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制劑AG34和酪氨酸磷酸化抑制劑AG879?；蛘{(diào)節(jié)劑的例子包括但不限于5-氮雜-2'-脫氧胞苷、5-氮雜胞苷、膽鈣化甾醇(維生素D3)、4-羥泰米芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、全反式視黃醛(維生素A醛)、維曱酸、全反式(維生素A酸)、9-順式-維曱酸、13-順式-維曱酸、視黃醇(維生素A)、他莫昔芬和曲格列酮。本發(fā)明的方法還包括給受試者聯(lián)合施用免疫偶聯(lián)物(包含與諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素等治療劑連接的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分)和抗腫瘤劑，該抗腫瘤劑與抗體組合物一起或協(xié)同作用，治療或預(yù)防與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括給受試者聯(lián)合施用雙特異性分子(包含與第二功能部分連接的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體不同的結(jié)合特異性)和抗腫瘤劑，該抗腫瘤劑與抗體組合物一起或協(xié)同作用，治療或預(yù)防與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病?？闺狭鰟┛梢砸员绢I(lǐng)域爿^知或者如本文(見藥物組合物)所述的任意治療有效劑量施用?？?PSMA抗體可以與一種抗腫瘤劑聯(lián)合施用?？?PSMA抗體也可以與兩種或多種抗腫瘤劑聯(lián)合施用?？?PSMA抗體和抗肺瘤劑可以同時(shí)施用。例如，抗-PSMA抗體和抗腫瘤劑可以在一種藥物制劑中一起施用。在另一實(shí)施方案中，抗_PSMA抗體和抗腫瘤劑可以作為兩種或多種分開的藥物制劑同時(shí)施用?？?PSMA抗體和抗腫瘤劑也可以在不同時(shí)間施用。例如，抗腫瘤劑可以在施用抗-PSMA抗體之前施用(例如在施用抗-PSMA抗體之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、24或48小時(shí))?；蛘撸?PSMA抗體可以在施用抗腫瘤劑之前施用(例如在施用抗腫瘤劑之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、24或48小時(shí))。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以按照本文表1所述的給藥方案，聯(lián)合施用抗-PSMA抗體與抗胂瘤劑。藥盒本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括含有本發(fā)明的抗體和使用說明的藥盒。該藥盒可以進(jìn)一步含有一種或多種另外的藥物，如免疫刺激劑、細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，或一種或多種本發(fā)明的其他抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的人抗體，它與PSMA抗原上與第一人抗體不同的表位結(jié)合)。藥盒一般包括標(biāo)明該藥盒內(nèi)容物目標(biāo)用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括在藥盒上提供或與藥盒一起提供或以其他方式隨藥盒提供的任何書面或記錄材料。本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請(qǐng)中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此引用作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:抗PSMA人單克隆抗體的制備抗原免疫方案使用表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP(ATCCCRL-1740)的細(xì)胞作為抗原。轉(zhuǎn)基因HuMAb小鼠用表達(dá)人抗體基因的HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠的HCo12系制備抗PSMA的完全人單克隆抗體。在該小鼠系中，已經(jīng)如Chen等(19")EMB0J.12:815-5120所述將內(nèi)源小鼠K輕鏈基因純合地破壞，并且已經(jīng)如PCT公布W001/09187的實(shí)施例1所述將內(nèi)源小鼠重鏈基因純合地破壞。而且該小鼠系攜帶如Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851所述的人K輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5,和如PCT/>開WO01/09187的實(shí)施例2所述的人重鏈轉(zhuǎn)基因HCo12。HuMab的免疫為了產(chǎn)生抗PSMA的完全人單克隆抗體，用表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞作為抗原免疫HuMAb小鼠。對(duì)于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474):856—859;Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851和PCT公開WO98/24884中描述。在第一次輸注抗原時(shí)小鼠為6-16周齡。用5-10xl(T細(xì)胞腹膜內(nèi)(IP)、皮下(Sc)或通過足墊注射免疫HuMAb小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠用在完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫兩次，然后用在不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原IP免疫3-21天(最多總共11次免疫)。通過眼眶后采血監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過ELISA對(duì)血漿進(jìn)行篩選(如下文所述)，用具有足夠的抗-PSMA人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后處死并取出脾臟。典型地，每種抗原進(jìn)行10-35個(gè)融合。每種抗原免疫幾十只小鼠。產(chǎn)生抗-PSMA抗體的HuMab小鼠的選拷為了選擇產(chǎn)生可與PSMA結(jié)合的抗體的HuMab小鼠，通過流式細(xì)胞術(shù)針對(duì)與表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP結(jié)合而不與陰性前列腺癌細(xì)胞系結(jié)合，篩查來自被免疫小鼠的血清。簡(jiǎn)要地說，通過LNCaP細(xì)胞與20(ag/ml的抗PSMA抗體一起溫育，評(píng)價(jià)抗PSMA抗體的結(jié)合。洗滌細(xì)胞，用FITC-標(biāo)記的抗人IgGAb檢測(cè)結(jié)合。使用FACScan;危式纟田月包4義(BectonDickinson,SanJose,CA)進(jìn)4亍;充式纟田胞分析。進(jìn)一步如Fishwild,D.等(1996)所述，通過ELISA檢測(cè)與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞結(jié)合而不與不表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞結(jié)合的抗體與PSMA的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說，用在PBS中濃度為l-2)ug/ml的純化PSMA以lOOiul/孔的量包被微量滴定板，4。C下溫育過夜，然后用PBS/Tween(0.05%)中的5%胎牛血清以200^1/孔封閉。將來自PSMA免疫的小鼠的血清稀釋液加入各孔中，在室溫下溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗板，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgG多克隆抗體在室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用ABTS底物(Sigma,A-1888，0.22mg/ml)顯色,并用分光光度計(jì)在0D415-495下分析。用顯示最高抗-PSMA抗體效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。融合如下文所述進(jìn)行，通過ELISA纟企測(cè)雜交瘤上清液的抗-PSMA活性。產(chǎn)生抗PSMA人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，用PEG將從HuMab小鼠中分離的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。使用50%PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液與1/4數(shù)量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCCCRL1581)融合。將細(xì)胞以約lxlOV孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基中溫育約兩周，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、10%P388D1(ATCC，CRLTIB-63)條件介質(zhì)、在DMEM(Mediatech，CRL10013，含有高濃度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)中的3-5%origen(IGEN)+5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigraa，CRLP-7185)。1-2周后，將細(xì)胞在用HT替代了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過ELISA(如上所述)針對(duì)人抗PSMA單克隆IgG抗體篩查各個(gè)孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天后監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果對(duì)于人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將抗PSMA單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生小量的抗體用于進(jìn)一步表征。選擇雜交瘤克隆1C3、2A10、2F5、2C6進(jìn)一步分析。實(shí)施例2:人單克隆抗體1C3、2A10、2F5和2C6的結(jié)構(gòu)表征利用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)分別從1C3、2A10、2F5和2C6雜交瘤中獲得編碼1C3、2A10、2F5和2C6單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，并利用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序^t術(shù)進(jìn)^f亍測(cè)序。1C3的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQIDNO:33和1中。1C3的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖IB和SEQIDNO:37和5中。1C3重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，1C3重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-30.3的Vh區(qū)段、未確定的D區(qū)革殳和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。1C3Vh序列與神系VH3-30.3序列的比對(duì)顯示在圖5中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)1C3VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖1A和5以及SEQIDNO:9、13和17所示。1C3輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，1C3輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL18的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)段。1C3VL序列與種系VKL18序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)1C3VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖IB和7以及SEQIDNO:21、25和29所示。2A10的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQIDNO:34和2中。2A10的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQIDNO:38和6中。2A10重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，2A10重鏈應(yīng)用了來自人種系VH5-51的Vh區(qū)段、來自人種系7-27的D區(qū)段和來自人種系JH2的JH區(qū)段。2A10Vh序列與神系Vh5-51序列的比對(duì)顯示于圖6中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2A10VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDIU和CDR3區(qū)，分別如圖2A和6以及SEQIDNO:10、14和18所示。2A10輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，2A1G輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL18的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)段。2A10VL序列與種系VKL18序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2A10VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2B和7以及SEQIDNO:22、26和30所示。2F5的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3A和SEQIDNO:35和3中。2F5的輕鏈可變區(qū)的核苦酸和氨基酸序列分別顯示于圖3B和SEQIDNO:39和7中。2F5重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，2F5重鏈應(yīng)用了來自人種系VH5-51的Vk區(qū)段、來自人種系7-27的D區(qū)段和來自人種系JH2的JH區(qū)段。2F5Vh序列與神系Vh5-51序列的比對(duì)顯示于圖6中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2F5VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3A和6以及SEQIDNO:11、15和19所示。2F5輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，2F5輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKLI8的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)段。2F5VL序列與種系VKL18序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2F5VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3B和7以及SEQIDNO:23、27和31所示。2C6的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQIDNO:36和4中。2C6的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQIDNO:40和8中。2C6重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，2C6重鏈應(yīng)用了來自人種系VH5-51的Vh區(qū)段、來自人種系6-13的D區(qū)段和來自人種系JH4b的JH區(qū)段。2C6Vw序列與種系VH5-51序列的比對(duì)顯示于圖6中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2C6VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4A和6以及SEQIDN0:12、16和20所示。2C6輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，2C6輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL6的VL區(qū)段和來自人種系JK3的JK區(qū)4爻。2C6VL序列與種系VKL6序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)確定系統(tǒng)對(duì)2C6VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4B和8以及SEQIDNO:24、28和32所示。實(shí)施例3:抗-PSMA人單克隆抗體的結(jié)合特異性表征在該實(shí)施例中，通過利用表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)以及通過使用純化的PSMA的ELISA檢測(cè)了結(jié)合特異性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)合特異性利用表達(dá)人PSMA的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP通過流式細(xì)胞術(shù)4企測(cè)了抗-PSMA人單克隆抗體的特異性。2F5、2A10和2C6抗-PSMA人單克隆抗體的結(jié)合如下評(píng)價(jià)將LNCaP細(xì)胞與不同濃度的抗-PSMA人單克隆抗體一起溫育。洗滌細(xì)胞，用FITC-標(biāo)記的抗-人IgGAb檢測(cè)結(jié)合。4吏用FACScan力充式纟田月包4義(BectonDickinson,SanJose,CA)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。人抗-PSMA單克隆抗體7F12(如PCT公開W003/064606所述)作為陽性對(duì)照，非-PSMA特異性同種型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示在圖9中?？?PSMA人單克隆抗體2F5、2A10和2C6與表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞特異性結(jié)合。通過ELISA^r測(cè)結(jié)合特異性抗-PSMA抗體與免疫純化的PSMA結(jié)合的比較通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA進(jìn)行，以檢查對(duì)于PSMA結(jié)合的特異性。從LNCaP細(xì)胞免疫純化PSMA,檢測(cè)與抗-PSMA人單克隆抗體1C3、2A10、2F5和2C6的結(jié)合。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序。以5jug/ml的濃度加入抗-PSMA人單克隆抗體，以1:2連續(xù)稀釋向下滴定。與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊-抗-人IgG(K鏈特異性)多克隆抗體作為第二抗體。人抗-PSMA單克隆抗體7F12作為陽性對(duì)照，空白作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示在圖10中?？?PSMA人單克隆抗體2A10和2F5與PSMA高特異性結(jié)合。在ELISA測(cè)定中，抗-PSMA人單克隆抗體1C3和2C6顯示為可檢測(cè)到，但是只與PSMA低水平結(jié)合，提示在ELISA測(cè)定中這些抗體與受阻的表位結(jié)合。實(shí)施例4:抗-PSMA單克隆抗體的結(jié)合親和力的Scatchard分析采用Scatchard分析檢測(cè)了2A10抗體對(duì)表達(dá)PSMA的前列腺癌LNCaP細(xì)^^系的結(jié)合親和力。LNCaP細(xì)胞從ATCC獲得(CRL-1740)并在含有10。/。胎牛血清(FBS)的RPMI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。胰蛋白酶消化該細(xì)胞，用基于Tris的結(jié)合緩沖液(24mMTrispH7.2，137mMNaCl,2.7mMKC1，2mM葡萄糖，lmMCaCl2,lmMMgCh，0.1%BSA)洗一次，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞調(diào)節(jié)至2xl(^細(xì)胞/ml。微孔板(MAFBNOB)用1°/。脫脂奶粉水溶液包被，并在4。C下貯存過夜。用0.2ml結(jié)合緩沖液洗板三次。向最大結(jié)合孔中加入單獨(dú)50微升緩沖液(總結(jié)合)。向?qū)φ湛字屑尤雴为?dú)25微升緩沖液(非特異性結(jié)合)。向所有孔中加入體積為25"1的不同濃度的^I-抗-PSMA抗體。向?qū)φ湛字屑尤塍w積為25ial的100倍過量的不同濃度的未標(biāo)記的抗體，并向所有孔中加入在結(jié)合緩沖液中的25plLNCaP細(xì)胞(2X1()6細(xì)胞/ml)。將板在4。C搖床上以200RPM溫育2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，用0.2ml冷洗滌緩沖液(24mMTrispH7.2,500mMNaCl,2.7mMKC1,2mM葡萄糖，lmMCaCh，lmMMgCl2,0.1%BSA)洗微孔板三次。取出濾膜，用Y計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。使用Prism軟件(SanDiego，CA)用單位點(diǎn)結(jié)合參數(shù)進(jìn)行平衡結(jié)合的評(píng)價(jià)。才艮據(jù)上述Scatchard結(jié)合測(cè)定，2A10抗體對(duì)于LNCaP細(xì)月包的KD接近0.8nM。實(shí)施例5:表位竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定利用竟?fàn)帨y(cè)定比較抗-PSMA單克隆抗體2A10與已知的抗-PSMA抗體7F12(在PCT/>開W003/064606中描述)，以才全測(cè)兩種抗體是否與相同的表位區(qū)結(jié)合。LNCaP細(xì)胞從ATCC獲得(CRL-1740)，并在含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。胰蛋白酶消化該細(xì)胞，用基于Tris的結(jié)合緩沖液(24mMTrispH7.2,137mMNaCl，2.7mMKC1，2mM葡萄糖，lmMCaCl2,lmMMgCh,0.1°/。BSA)洗滌一次,將細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中調(diào)節(jié)至2xl(^細(xì)胞/ml。微孔板(MAFBN0B)用1%脫脂奶粉水溶液包被，并在4。C下貯存過夜。用0.2ml結(jié)合緩沖液洗板三次。向孔中加入25微升單獨(dú)的緩沖液(非特異性結(jié)合)。向所有孔中加入體積為25pl的固定濃度的U5I-抗-PSMA抗體。向孔中加入體積為25nl的不同濃度的未標(biāo)記的抗體，并向所有孔中加入在結(jié)合緩沖液中的LNCaP細(xì)胞(2xl()6細(xì)胞/ml)。將板在4。C搖床上以200RPM溫育2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，用0.2ml冷洗滌緩沖液(2411^TrispH7.2,500mMNaCl，2.7mMKC1，2mM葡萄糖，lmMCaCl2，lmMMgCl2，0.1%BSA)洗微孔板三次。取出濾膜，用Y計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。使用Prism軟件(SanDiego,CA)用單位點(diǎn)結(jié)合參數(shù)進(jìn)行平衡結(jié)合的評(píng)價(jià)。同種型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。針對(duì)mI-2A10的竟?fàn)幗Y(jié)合的結(jié)果顯示在圖11A中，針對(duì)125I-7F12的竟?fàn)幗Y(jié)果顯示在圖11B中。結(jié)果表明，加入未標(biāo)記的7F12抗體抑制了標(biāo)記的2A10與LNCaP細(xì)胞的結(jié)合，加入未標(biāo)記的2A10抗體抑制了標(biāo)記的7F12與LNCaP細(xì)胞的結(jié)合。這證明2A10和7F12抗-PSMA抗體與PSMA上相同或非常類似的表位結(jié)合。實(shí)施例6:抗-PSMA單克隆抗體的內(nèi)化4吏用Hum-Zap內(nèi)化試馬全4企測(cè)了抗-PSMAHuMAb向表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞中內(nèi)化的能力。Hum-Zap通過第二抗體的結(jié)合檢測(cè)第一人抗體的內(nèi)化，該第二抗體具有對(duì)偶聯(lián)到毒素肥急草毒蛋白(saporin)上的入IgG的親和性。表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP以2.5xl04細(xì)胞/孔接種到100pi孔中過夜或在次日兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間。向孔中加入初始濃度為30nM的抗-PSMA抗體2A10或7F12,以1:3連續(xù)稀釋向下滴定。對(duì)于PSMA非特異性的同種型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。以11nM的濃度力口入Hum-Zap(AdvancedTargetingSystems,IT-22-25),將板溫育48小時(shí)。然后用1.0pCi3H-胸苷對(duì)板進(jìn)行脈沖24小時(shí)，收獲，用TopCount閃爍計(jì)數(shù)儀(PackardInstruments)讀數(shù)。結(jié)果顯示在圖12中?？?PSMA抗體2A10顯示在表達(dá)PSMA的LNCap前列腺癌細(xì)胞中力-胸苷摻入依賴于抗體濃度地降低。該數(shù)據(jù)證明抗-PSMA抗體2Al0內(nèi)化到前列腺癌細(xì)胞系中。實(shí)施例7:通過差示掃描量熱法測(cè)定抗-PSMA單克隆抗體的熱穩(wěn)定性使用對(duì)抗體熔解溫度的量熱分析，將抗-PSMA單克隆抗體2A10與7F12抗體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較。在與自動(dòng)采樣器(MicroCalLLC,Northampton,MA，USA)組合的VP-毛細(xì)管DSC差示掃描微熱量計(jì)平臺(tái)上進(jìn)行熔解溫度的量熱學(xué)測(cè)量。樣品細(xì)胞體積為0.144mL。關(guān)于糖基化和脫糖基化形式的抗體的變性數(shù)據(jù)如下獲得將濃度為2.3|oM的樣品以rC/min的速度從30。C加熱到95°C。蛋白質(zhì)樣品存在于pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在參照細(xì)胞中使用相同的緩沖液，通過比較獲得摩爾熱容。對(duì)觀察到的熱解曲線進(jìn)行基線校正，使用Originv7.0軟件基于2步模型分析標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)?？寺?A10具有較高的熱穩(wěn)定性，Tm為71.43'C,與之相比，克隆7F12為63.05°C。實(shí)施例8:泰索帝⑧和7F12抗體聯(lián)合對(duì)體內(nèi)肺瘤異種移植物的治療應(yīng)用在CB17.SCID雄性小鼠中生長(zhǎng)的LNCaP人前列腺癌異種移植物，檢測(cè)了抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝⑧(多西紫杉醇)的抗腫瘤效果。表達(dá)高水平PSMA的LNCaP前列腺癌細(xì)胞從ATCC獲得(Cat#CRL-1740)，并按照ATCC的說明在體外擴(kuò)增。來自于Taconic的8周大的雄性CB17.SCID小鼠每只在右脅皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1:1)中的2.5x106LNCaP細(xì)胞。從植入后三周開始，每周兩次對(duì)小鼠稱重，并使用電子測(cè)徑器測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積以高度x寬度x長(zhǎng)度計(jì)算。將具有180mm3的血管化腫瘤(根據(jù)腫瘤外觀來確定)的小鼠隨機(jī)分配到治療組中，并且在第0天按照個(gè)體體重給藥。在給藥后約60天時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，并在研究結(jié)束時(shí)終止。當(dāng)腫瘤達(dá)到腫瘤終點(diǎn)(1500mm"時(shí)，對(duì)小鼠施以安樂死。給藥信息總結(jié)在表1中。泰索帝⑧通過尾靜脈以Q3Dx5靜脈(iv)給藥。同種型對(duì)照抗體利妥昔單抗⑧和抗-PSMA7F12抗體以Q3Dx5腹膜內(nèi)(ip)給藥，然后以Q7Dx6給藥。表l:給藥信息<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>上述實(shí)-驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖13-16中。如圖13A-13B和圖14A-14B所示，單獨(dú)的30mg/kg抗-PSMA7F12抗體適度地降低了LNCaP肺瘤的生長(zhǎng)。泰索帝⑧在檢測(cè)的兩種劑量(即2和4mg/kg)下顯示劑量依賴的抗腫瘤生長(zhǎng)效果。30mg/kg抗-PSMA7F12抗體和4mg/kg泰索帝⑧聯(lián)合治療顯示出優(yōu)于每個(gè)單獨(dú)治療的效果，并且導(dǎo)致LNCaP肺瘤生長(zhǎng)接近完全抑制(見圖13A-13B和圖15A-15B)。如圖13C-13D和圖15C-15D所示，這種聯(lián)合方案也治愈了LNCaP腫瘤相關(guān)惡病質(zhì)的小鼠。30mg/kg抗-PSMA7F12抗體和2mg/kg泰索帝⑧聯(lián)合治療也顯示出優(yōu)于每個(gè)單獨(dú)治療的效果(見圖13A-13D和圖16A-16D)。上述數(shù)據(jù)證明了抗-PSMA7F12抗體聯(lián)合泰索帝⑧化療在治療如前列腺腫瘤等肺瘤中具有加成和可能協(xié)同的效應(yīng)。實(shí)施例8:毒素偶聯(lián)的抗-PSMA抗體對(duì)前列腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞殺傷的評(píng)價(jià)在該實(shí)施例中，利用細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)了與毒素偶聯(lián)的抗-PSMA單克隆抗體殺傷PSMA+前列腺癌細(xì)胞系的能力。抗-PSMAHuMAb抗體2A10與毒素通過連4妄體如肽、腙或二碌u化物連接體偶聯(lián)?？梢耘c本發(fā)明抗體偶聯(lián)的毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的代理人案巻號(hào)為04280/100M629US3的申請(qǐng)中描述。將表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP以2.5xl04細(xì)胞/孔接種在100Jul孑L中3小時(shí)。向孔中加入初始濃度為30nM的抗-PSMA抗體-毒素偶聯(lián)物，并以1:3連續(xù)稀釋向下滴定。對(duì)于PSMA非特異性的同種型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。使板在3小時(shí)時(shí)洗滌一次或連續(xù)洗滌下溫育72小時(shí)。然后用1.0pCi力-胸苷對(duì)板進(jìn)行脈沖24小時(shí)，收獲，并用TopCount閃爍計(jì)數(shù)器(PackardInstruments,Meriden，CT)讀數(shù)。結(jié)果顯示在圖17A(3小時(shí)洗滌)和17B(連續(xù)洗滌)中。在表達(dá)PSMA的LNCaP前列腺癌細(xì)胞中，抗-PSMA抗體2A10顯示抗體-毒素濃度依賴性的3}1-胸苷摻入減少。抗-PSMA抗體2A10的EC5fl值對(duì)于洗滌測(cè)定為0.157nM，對(duì)于連續(xù)洗滌測(cè)定為0.0643nM。該數(shù)據(jù)證明抗-PSMA當(dāng)與毒素偶聯(lián)時(shí)對(duì)于前列腺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。實(shí)施例9:體內(nèi)研究在該實(shí)施例中，檢測(cè)與毒素偶聯(lián)的抗-PSMA單克隆抗體在體內(nèi)殺傷PSMA+前列腺癌細(xì)胞系的能力A.體內(nèi)腫瘤異種移植物的治療抗-PSMAHuMAb2A10和同種型對(duì)照抗體均更換緩沖液為含有50mMNaCl和2mMDTPA的0.1M磷酸鹽緩沖液pH8.0,并濃縮至6mg/ml。然后通過以下步驟將這兩種抗體硫醇化與25倍摩爾過量的2-亞氨碌b醇(iminothiolane)室溫溫育1小時(shí)，然后使用SephadexG-25柱脫鹽到含有50mMNaCl和2mMDTPA的0.1M磷酸鹽緩沖液pH6.0中。硫醇化抗體然后保持在冰上，測(cè)定導(dǎo)入的硫醇基團(tuán)的數(shù)量。這通過硫醇化抗體樣品與二硫雙吡啶(DTDP)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。測(cè)量在280nm處的吸光度，以確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度，然后將每個(gè)樣品的一等份(O.9ml)與0.1mlDTDP(在乙醇中的5mM貯存溶液)在室溫下溫育10分鐘。單獨(dú)緩沖液+DTDP的空白樣品在旁邊溫育。測(cè)量在324nm處的吸光度，使用硫代吡啶的消光系數(shù)19800M—1定量每個(gè)抗體中存在的硫醇基團(tuán)數(shù)目。對(duì)于抗-PSMA,每個(gè)抗體導(dǎo)入5.3個(gè)硫醇基團(tuán)，對(duì)于同種型對(duì)照為6.0個(gè)。硫醇化抗體然后與相對(duì)于硫醇基團(tuán)摩爾濃度3倍摩爾過量的化合物A—起溫育?；衔顰向硫醇化抗體中加入化合物A在DMS0中的5mM貯存溶液以及足以使DMSO終濃度為10%(v/v)的DMSO。在室溫下溫育3小時(shí)后，使用三乙醇胺將溫育混合物的pH升高到7.0。然后在用含50mMNaCl和5%(v/v)DMSO的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7，2)預(yù)平衡的SephacrylS200柱上通過大小排阻層析純化抗體-化合物A偶聯(lián)物。收集并合并含有單體偶聯(lián)物的級(jí)分。然后在氮?dú)庀略跀嚢鑶卧惺褂?0kDa截止膜濃縮獲得的純化的偶聯(lián)物。參照以前測(cè)量的抗體和化合物A在每一波長(zhǎng)下的消光系數(shù)，利用在280nm和340nm處的吸光度確定偶聯(lián)物的濃度和取代比(每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子的數(shù)目)。可以與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的其他毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的代理人案巻號(hào)為04280/100M629US3的共同擁有的美國專利申請(qǐng)中描述。用LNCaP檢測(cè)了與化合物A偶聯(lián)的抗-PSMA(2A1G克隆)的抗腫瘤效果，LNCaP是在雄性CB17.SCID小鼠(可從Taconic，GermantownNY獲得)中生長(zhǎng)的人前列腺癌異種移植物。表達(dá)高水平的PSMA的LNCaP前列腺癌細(xì)胞從ATCC獲得(Cat井CRL-1740)，并按照ATCC的說明在體外擴(kuò)增。來自于Taconic的8周大的雄性CB17.SCID小鼠每只在右脅皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1:1)中的2.5x106LNCaP細(xì)胞。從植入后三周開始，每周兩次對(duì)小鼠稱重，并使用電子測(cè)徑器肺瘤測(cè)量腫瘤的三維。單個(gè)腫瘤體積以高度x寬度x長(zhǎng)度計(jì)算。將具有適當(dāng)大小的血管化肺瘤(根據(jù)腫瘤外觀來確定)的小鼠隨機(jī)分配到治療組中，并且在第0天按個(gè)體體重給藥。在給藥后約60天時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，并在研究結(jié)束時(shí)終止。當(dāng)肺瘤達(dá)到胂瘤終點(diǎn)(1500mm"時(shí)，對(duì)小鼠施以安樂死。該異種移植物研究的設(shè)計(jì)在表2中概述。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>偶聯(lián)物如圖18所示，0.3)Limole/kg(參照細(xì)胞毒素化合物A的摩爾數(shù))的2A10-化合物A偶聯(lián)物誘導(dǎo)建立的所有三個(gè)小LNCaP腫瘤完全消失。B.劑量-應(yīng)答研究抗-PSMA(2A10)更換緩沖液為含有50mMNaCl和2mMDTPA的0.1M磷酸鹽緩沖液pH8.0，并濃縮至5.6mg/ml。然后通過以下步驟將該抗體硫醇化與7.5倍摩爾過量的2-亞氨硫醇在室溫下溫育1小時(shí)，然后使用SephadexG-25柱脫鹽到含有5mM甘氨酸、2mMDTPA和3%(v/v)甘油的50mMHEPES緩沖液pH6.0中。碌u醇化抗體然后保持在冰上，同時(shí)測(cè)定導(dǎo)入的硫醇基團(tuán)的數(shù)目。這通過硫醇化抗體樣品與二錄L雙吡p定(DTDP)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。測(cè)量在280nm處的吸光度，以確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度，然后將每個(gè)樣品的一等份(O.9ml)與0.lmlDTDP(在乙醇中的5mM貯存溶液)在室溫下溫育10分鐘。單獨(dú)i爰沖液+DTDP的空白樣品在旁邊溫育。測(cè)量在324nm處的吸光度，使用石克代吡啶的消光系數(shù)19800M—'定量每個(gè)抗體中存在的硫醇基團(tuán)數(shù)目。硫醇化抗體然后與相對(duì)于硫醇基團(tuán)摩爾濃度2倍摩爾過量的化合物A—起溫育。向碌u醇化抗體中加入化合物A在10%(v/v)DMSO/90%(v/v)乙二醇二曱醚中的5mM貯存溶液以及足以^吏終濃度為10%(v/v)的乙二醇二甲醚。在室溫下溫育2小時(shí)后，通過離子交換層析純化抗體-化合物A偶聯(lián)物。將反應(yīng)混合物加到用緩沖液A(50mMHEPES，5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH6.0)預(yù)平衡的SP-Sepharose柱上。用緩沖液A洗柱，然后用95%緩沖液A，5%緩沖液B(50mMHEPES，1MNaCl，5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH7.2)洗柱，然后用10%緩沖液B，90%緩沖液A洗脫抗體-化合物A偶聯(lián)物。收集并合并含有單體偶聯(lián)物的級(jí)分，并加入乙醇胺將pH調(diào)節(jié)至7.2。然后將獲得的純化的偶聯(lián)物透析到50mMHEPES，100mMNaCl,5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH7.2中，然后在氮?dú)庀略跀嚢鑶卧惺褂?0kDa截止膜濃縮。參照以前測(cè)量的抗體和化合物A在每一波長(zhǎng)下的消光系數(shù)，利用在280nm和340nm處的吸光度確定偶聯(lián)物的濃度和取代比(每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子的數(shù)目)。除了用15%緩沖液B，85%緩沖液A從離子交換柱上洗脫偶聯(lián)物以外，用相同的方法制備同種型對(duì)照(抗-CD7G2H5)偶聯(lián)物。如上所述使用在雄性CB17.SCID小鼠中生長(zhǎng)的LNCaP人前列腺癌異種移植物測(cè)定偶聯(lián)物的效果和選擇性。該異種移植物研究的設(shè)計(jì)在表3中概述。表3.LNCaP異種移纟直物研究概述<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>如表3和圖19-20所示，0.15|umole/kg抗-PSMA-化合物A(圖19)具有優(yōu)于0.90pmole/kg同種型對(duì)照-化合物A的抗腫瘤效果，表示出至少>6倍的選4奪性(圖20)。0.90pmole/kg抗-PSMA-化合物A僅顯示短暫的毒性(圖21-22)，低于最大耐受劑量。因此，在LNCaP-荷瘤小鼠中鑒定到抗-PSMA-化合物A具有大于6倍的治療指數(shù)。C.對(duì)大肺瘤的效果抗-PSMA(2A10)更換緩沖液為含有50mMNaCl和2mMDTPA的0.1M磷酸鹽緩沖液pH8.0，并濃縮至5.6mg/ml。然后通過以下步驟將該抗體硫醇化與9倍摩爾過量的2-亞氨硫醇在室溫下溫育1小時(shí)，然后使用SephadexG-25柱脫鹽到含有5mM甘氨酸、2mMDTPA和3%(v/v)甘油的50mMHEPES緩沖液pH6.0中。硫醇化抗體然后保持在冰上，同時(shí)測(cè)定導(dǎo)入的硫醇基團(tuán)的數(shù)目。這通過硫醇化抗體樣品與二碌u雙吡啶(DTDP)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。測(cè)量在280nm處的吸光度，以確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度，然后將每個(gè)樣品的一等份(O.9ml)與0.lmlDTDP(在乙醇中的5mM貯存溶液)在室溫下溫育10分鐘。單獨(dú)緩沖液+DTDP的空白樣品在旁邊溫育。測(cè)量在324nm處的吸光度，使用硫代吡啶的消光系數(shù)19800M—1定量每個(gè)抗體中存在的硫醇基團(tuán)的數(shù)目。硫醇化抗體然后與相對(duì)于硫醇基團(tuán)摩爾濃度2倍摩爾過量的化合物A—起溫育。向硫醇化抗體中加入化合物A在10%(v/v)DMSO/90°/。(v/v)乙二醇二曱醚中的5mM貯存溶液以及足以4吏終濃度為10%(v/v)的乙二醇二曱醚。在室溫下溫育2小時(shí)后，通過離子交換層析純化抗體-化合物A偶聯(lián)物。將反應(yīng)混合物加到用50mMHEPES，5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH6.0(緩沖液A)預(yù)平衡的SP-Sepharose柱上。用緩沖液A洗柱，然后用95%緩沖液A，5%緩沖液B(50mMHEPES，1MNaCl，5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH7.2)洗柱，然后用10%緩沖液B,90%緩沖液A洗脫抗體-化合物A偶聯(lián)物。收集并合并含有單體偶聯(lián)物的級(jí)分，加入乙醇胺將pH調(diào)節(jié)至7.2。然后將獲得的純化的偶聯(lián)物透析到50mMHEPES,lOOmMNaCl,5mM甘氨酸，3%(v/v)甘油，pH7.2中，在氮?dú)庀略跀嚢鑶卧惺褂?0kDa截止膜濃縮。參照以前測(cè)量的抗體和化合物A在每一波長(zhǎng)下的消光系數(shù)，利用在280nm和340nm處的吸光度確定偶聯(lián)物的濃度和取代比(每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子的數(shù)目)。除了用15%緩沖液B,85%緩沖液A從離子交換柱上洗脫偶聯(lián)物以外，用相同的方法制備同種型對(duì)照(抗-CD702H5)偶聯(lián)物。如上所述使用在雄性CB17.SCID小鼠中生長(zhǎng)的LNCaP人前列腺癌異種移植物測(cè)定偶聯(lián)物的效果和選擇性。該異種移植物研究的設(shè)計(jì)在表4和5中概述。表4.LNCaP異種移植物研究概述<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>如表4和圖23所示，單次低劑量的0.15^mole/kg抗-PSMA-化合物A大大抑制了已建立的平均大小為240mi^的大LNCaP腫瘤的生長(zhǎng)。相反，0.15jnmole/kg同種型對(duì)照-化合物A具有最低的抗-腫瘤效果。如表5和圖24所示，單次劑量的0.30|umole/kg抗-PSMA-化合物A誘導(dǎo)了平均大小為430mm3的極大腫瘤的消退并抑制了其生長(zhǎng)。表5.LNCaP異種移植物研究概述<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>在本說明書中提到的或參考的每個(gè)專利申請(qǐng)、專利、出版物和其他公開文件都完整引入本文作為參考，如同每個(gè)專利申請(qǐng)、專利、出版物和其他公開文件均單獨(dú)地引入作為參考。盡管已經(jīng)參照具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明和所附權(quán)利要求書的真實(shí)精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種變化和等同替代。另外，也可以進(jìn)行修改以使具體情況、材料、物質(zhì)組成、方法、方法步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有這些修改預(yù)期在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。序列表概述<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>權(quán)利要求1.一種特異性結(jié)合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的分離的人單克隆抗體，其中該抗體的熔解溫度至少為67°C。2.權(quán)利要求1的抗體，其熔解溫度至少為69°C。3.權(quán)利要求1的抗體，其熔解溫度至少為71°C。4.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括產(chǎn)自或來源于人Vh3-30.3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。5.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括a)人Vh3-30.3基因的重鏈可變區(qū)；和b)人VkL18基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。6.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括產(chǎn)自或來源于人VkL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。7.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括a)人Vh5-51基因的重鏈可變區(qū)；和b)人VkL18基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。8.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:13、14、15和16的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:17、18、19和20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:25、26、27和28的氨基酸序列的輕纟連可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:29、30、31和32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。9.權(quán)利要求8的抗體，該抗體包括包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO9的重鏈可變區(qū)CDR1;13的重鏈可變區(qū)CDR217的重鏈可變區(qū)CDR321的輕鏈可變區(qū)CDR125的輕鏈可變區(qū)CDR229的輕鏈可變區(qū)CDR310.權(quán)利要求8的抗體，該抗體包括包含SEQIDNO10的重鏈可變區(qū)CDR1;:b)包含SEQIDNO14的重鏈可變區(qū)CDR2;:c)包含SEQIDNO18的重鏈可變區(qū)CDR3;:d)包含SEQIDNO22的輕鏈可變區(qū)CDR1;包含SEQIDNO26的輕鏈可變區(qū)CDR2;:f)包含SEQIDNO30的輕鏈可變區(qū)CDR3。11.權(quán)利要求8的抗體，該抗體包括包含SEQIDNO11的重鏈可變區(qū)CDR1;:b)包含SEQIDNO15的重鏈可變區(qū)CDR2;包含SEQIDNO19的重鏈可變區(qū)CDR3;:d)包含SEQIDNO23的輕鏈可變區(qū)CDR1;:e)包含SEQIDNO27的輕鏈可變區(qū)CDR2;:f)包含SEQIDNO,31的輕鏈可變區(qū)CDR3。12.權(quán)利要求8的抗體，該抗體包括包含SEQIDNO:12的重鏈可變區(qū)CDR1;:t>)包含SEQIDNO16的重鏈可變區(qū)CDR2;包含SEQIDNO20的重鏈可變區(qū)CDR3;包含SEQIDNO24的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR3。13.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:5、6、7、8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合14.權(quán)利要求13的抗體，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。15.權(quán)利要求13的抗體，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。16.權(quán)利要求13的抗體，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。17.權(quán)利要求13的抗體，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。18.—種組合物，其包含權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可接受的載體。19.一種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。20.—種組合物，其含有權(quán)利要求19的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。21.權(quán)利要求19的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。22.—種組合物，其含有權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。23.權(quán)利要求19的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。24.—種組合物，其含有權(quán)利要求23的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。25.—種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。26.—種組合物，其含有權(quán)利要求25的雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體。27.—種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。28.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求27的核酸分子。29.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求28的表達(dá)載體。30.—種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體。31.由權(quán)利要求30的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。32.—種抑制受試者中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA，該方法包括給該受試者施用有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤是前列腺癌腫瘤。34.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤是選自結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤的癌癥的腫瘤。35.—種制備抗-PSMA抗體的方法，該方法包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:9、10、11和12的CDR1序列、選自SEQIDNO:13、14、15和16的CDR2序列、和選自SEQIDNO:17、18、19和20的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23和24的CDR1序列、選自SEQIDNO:25、26、27和28的CDR2序列、和選自SEQIDNO:29、30、31和32的CDR3序列；(b)改變至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。36.—種抑制或阻止受試者中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA,該方法包括給受試者聯(lián)合施用均為有效抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的量的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗肺瘤劑。37.權(quán)利要求36的方法，其中給所述受試者聯(lián)合施用所述抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和所述抗腫瘤劑導(dǎo)致對(duì)所述腫瘤生長(zhǎng)抑制的協(xié)同效應(yīng)。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗肺瘤劑引起腫瘤塊的損害，由此導(dǎo)致肺瘤的更有效的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。39.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗體是權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體。40.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗體是7F12抗體。41.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗體是2A10抗體。42.權(quán)利要求36的方法，其中所述腫瘤是前列腺癌腫瘤。43.權(quán)利要求36的方法，其中所述腫瘤是選自結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌和黑素瘤的癌癥的腫瘤。44.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗腫瘤劑是化療劑。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述化療劑是泰索帝㊣(多西紫杉醇)。46.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗腫瘤劑是抗血管發(fā)生劑。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑選自制管張素Kl-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-a-二氟甲基鳥氨酸、內(nèi)皮抑制素、煙曲霉素、染料木黃酮、米諾環(huán)素、星形孢菌素、沙利度胺和胂瘤抑素。48.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗腫瘤劑是免疫調(diào)節(jié)劑。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自抗-PDl抗體、抗-CTLA-4抗體、硫代磷酸酯寡脫氧核糖核苦酸(1018ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT9907)、白介素-12和白介素-21。50.—種刺激受試者中腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA，該方法包括給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑，其量均為有效刺激腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的量。51.—種抑制受試者中與腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA,該方法包括給受試者聯(lián)合施用抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合部分和抗腫瘤劑，其量均為有效抑制受試者中與腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)的量。52.—種組合物，其含有有效抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的量的抗-PSMA抗體和抗胂瘤劑以及藥學(xué)上可接受的載體。53.—種組合物，其含有有效刺激腫瘤的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的量的抗-PSMA抗體和抗腫瘤劑以及藥學(xué)上可接受的載體。54.—種鑒定能夠與抗-PSMA抗體在抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)中協(xié)同作用的抗胂瘤劑的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA,該方法包括使指示成分接觸(a)單獨(dú)的待測(cè)抗腫瘤劑，(b)單獨(dú)的抗-PSMA抗體，和(c)待測(cè)抗腫瘤劑和抗-PSMA抗體，并且將(a)單獨(dú)的待測(cè)抗腫瘤劑和(b)單獨(dú)的抗-PSMA抗體抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的能力與(c)待測(cè)抗腫瘤劑和抗-PSMA抗體抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的能力進(jìn)行比較，其中(c)抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)的程度大于(a)和(b)的加合效應(yīng)將導(dǎo)致鑒定出能夠與抗-PSMA抗體在抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)中協(xié)同作用的抗腫瘤劑。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述指示成分是肺瘤的動(dòng)物模型。全文摘要本發(fā)明提供與PSMA高親和力特異性結(jié)合的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發(fā)明抗體的核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和表達(dá)本發(fā)明抗體的方法。還提供了包含本發(fā)明抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法。文檔編號(hào)A61P13/08GK101124249SQ200680005347公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2006年2月17日優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日發(fā)明者C·潘,D·J·金,J·M·卡達(dá)雷爾利,黃海春申請(qǐng)人:米德列斯公司