一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法以及該方法所用的核酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法以及該方法所用的核酸序列，測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法大致為：在聚乙烯微孔上，形成VEGF與適配體和抗體形成抗體?蛋白?適配體的夾心結(jié)構(gòu)，同時(shí)在適配體的末端包含有一段18堿基的延長(zhǎng)序列，然后利用合成的兩段蔗糖轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記的輔助探針，這兩段酶標(biāo)探針以18堿基的延長(zhǎng)序列為模板，引發(fā)鏈雜交擴(kuò)增反應(yīng)，從而在微孔中固定上大量的蔗糖轉(zhuǎn)移酶，這些酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，利用血糖儀指示產(chǎn)生的葡萄糖的濃度，本發(fā)明的檢測(cè)方法便攜、簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、選擇性高，且能有效的測(cè)出待分析目標(biāo)物白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量。
【專利說明】
一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法以及該方法所用的核酸序列
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)分析領(lǐng)域，特別涉及一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法以及該方法所用的核酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一類在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新型信號(hào)蛋白，它能增加微血管與小靜脈血管的通透性，是促進(jìn)血管再生的重要調(diào)控因子。VEGF的過表達(dá)也與許多疾病密切相關(guān)，如肺癌，乳腺癌，直腸癌，銀肩病，增殖性視網(wǎng)膜病變和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。因此，VEGF常常作為一種重要的生物標(biāo)記物應(yīng)用于臨床疾病的診斷或作為愈后指標(biāo)。
[0003]目前，常規(guī)的VEGF檢測(cè)手段主要是基于免疫分析法，包括免疫組織化學(xué)，放射免疫分析法等。這類方法不僅耗時(shí)，更重要的是，在檢測(cè)過程中需要復(fù)雜的試劑及精密的儀器，無法讓普通人在日常生活中能隨時(shí)隨地地對(duì)VEGF的檢測(cè)。同時(shí)，在這種免疫分析中，需要用到對(duì)VEGF識(shí)別的抗體，而抗體具有獲得手段復(fù)雜，易失活，難修飾等缺點(diǎn)，不利于長(zhǎng)期保存。
[0004]適配體是通過指數(shù)富集技術(shù)(SELEX)獲得的特定序列的核酸分子，能識(shí)別各種目標(biāo)物，如金屬離子，小分子，蛋白質(zhì)等。它與目標(biāo)物的結(jié)合能力可以與抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體，同時(shí)，具有易合成，易修飾和易保存的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐漸取代抗體并廣泛應(yīng)用在分析檢測(cè)領(lǐng)域。VEGF有一段特異性的適配體，能與VEGF的肝素結(jié)合域進(jìn)行結(jié)合(解離常數(shù)Kd =315nM)，利用這段適配體，研究者構(gòu)建了各種的適配體傳感器用于VEGF的檢測(cè)，如熒光，電化學(xué)，表面等離子體共振等。在檢測(cè)過程中，研究者引入各種酶來實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大來改善檢測(cè)靈敏度，如DNA聚合酶或DNA外切酶等。雖然這一系列的適配體傳感器能夠成功地在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)VEGF的檢測(cè)，但是，酶的儲(chǔ)存需要嚴(yán)格的控溫，酶的使用過程中繁瑣的操作，以及需要大型昂貴的檢測(cè)儀器和專業(yè)的操作人員，使得這些方法的應(yīng)用常常局限在實(shí)驗(yàn)室中，難以應(yīng)用到普通人家的日常檢測(cè)中。因此，開發(fā)一種快速，高靈敏，便攜式VEGF適配體傳感器仍然是一種挑戰(zhàn)。
[0005]近年來，利用便攜式裝置，如血糖儀，pH計(jì)等，研究者開發(fā)了一系列傳感器，不僅拓展了這些商品化裝置的使用范圍，而且為實(shí)驗(yàn)室中傳感器便攜式地開發(fā)提供了一個(gè)新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)靈敏、快速且便捷的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，另外還提供了用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸適配體、核酸Al和核酸A2。
[0007]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，它包括以下步驟:
[0008]I)將VEGF抗體在聚苯乙烯微孔板中固定并封閉；在聚苯乙烯微孔板中固定的VEGF抗體，用于特異性地結(jié)合VEGF蛋白。
[0009]2)目標(biāo)物VEGF與VEGF抗體的結(jié)合:將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，進(jìn)行孵育反應(yīng)；
[0010]3)核酸適配體-VEGF-VEGF抗體夾心結(jié)構(gòu)的形成:將一定濃度的核酸適配體緩沖溶液加入到步驟2)所得的聚苯乙烯微孔板中，進(jìn)行孵育反應(yīng);所述的夾心結(jié)構(gòu)是通過核酸適配體同被抗體捕獲的VEGF特異性結(jié)合得到的。
[0011]4)制備活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液；
[0012]5)制備sulf O-SMCC活化的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液;所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶來自面包酵母(釀酒酵母)
[0013]6)制備蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液:將步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液分別與步驟5)所得的sulfo-SMCC活化的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液進(jìn)行混合、反應(yīng)得到蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液;本發(fā)明在制備蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液時(shí)，利用sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑將巰基化的DNA與蔗糖轉(zhuǎn)移酶通過化學(xué)交聯(lián)的方法結(jié)合起來。其中蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2通過變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行表征。
[0014]7)雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)的引發(fā):將步驟6)所得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液分別用雜交緩沖液調(diào)至濃度為0.4-2μΜ，以30-50yL/孔的添加量分別將濃度為0.4-2μΜ的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2溶液加入到步驟3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2的摩爾比為1:1，之后在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3_5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL;
[0015]所述的雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)是利用核酸適配體序列中的引發(fā)鏈，以步驟6)中得到的兩段蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針為原料，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式進(jìn)行雜交來實(shí)現(xiàn)的。所述的擴(kuò)增產(chǎn)物包含長(zhǎng)的DNA鏈及蔗糖轉(zhuǎn)移酶。蔗糖轉(zhuǎn)移酶能夠催化蔗糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖，血糖儀能夠檢測(cè)出生成的葡萄糖的濃度。
[0016]8)利用血糖儀進(jìn)行檢測(cè):以30?40yL/孔的添加量，將I?2M的蔗糖溶液加入步驟
7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)10?60分鐘，之后取10?20yL的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到與不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)應(yīng)的不同血糖儀讀數(shù)；
[0017]所述的血糖儀包括各種品牌的商品化血糖儀。
[0018]9)繪制VEGF檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程:根據(jù)步驟8)所得的血糖儀讀數(shù)，繪制血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程；
[0019]10)VEGF待測(cè)樣的檢測(cè):
[0020]以30-100μ!7孔的添加量，將未知濃度的VEGF待測(cè)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL，接著重復(fù)步驟3)、步驟7)后，以30?40yL/孔的添加量，將I?2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)15?20分鐘后，取10?20yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)，將該血糖儀讀數(shù)代入步驟9)所得的線性回歸方程中即得VEGF待測(cè)樣中VEGF的濃度；
[0021 ]其中，所述核酸適配體的序列為:
[0022]5 ’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3，。
[0023]該適配體中“5’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA”這一段序列能夠快速識(shí)別并與目標(biāo)蛋白VEGF特異性結(jié)合；
[0024]另一端段延長(zhǎng)序列“ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’”中的這18個(gè)堿基能夠作為雜交鏈擴(kuò)增的引發(fā)鏈。該適配體序列與目標(biāo)蛋白VEGF和VEGF抗體在微孔板表面形成適配體-VEGF-抗體的夾心結(jié)構(gòu)，從而利用適配體序列中的引發(fā)鏈與核酸探針Al以及核酸探針A2相互作用引發(fā)雜交鏈擴(kuò)增過程，從而在聚苯乙烯微孔板的微孔中固定大量的蔗糖轉(zhuǎn)移酶，這些酶能夠快速的催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而放大檢測(cè)信號(hào)，改善了血糖儀自身檢測(cè)靈敏度不高的缺陷。
[0025]其中，所述核酸Al的序列為:
[0026]5’-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0027]所述核酸探針Al的序列為:
[0028]5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3，
[0029]所述的核酸A2的序列為:
[0030]5 ’-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0031 ]所述核酸探針A2的序列為:
[0032]5’-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’
[0033]所述的雜交緩沖液以及沖洗緩沖液均為含有0.05?0.2M氯化鈉和0.007?0.02M氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0?7.6，濃度為0.05?0.2M。
[0034]本發(fā)明所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法的檢出限為12pg/mL。
[0035]所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，步驟I)的具體操作方法為:以30?50uL/孔的添加量，將10-20yg/mL的VEGF抗體溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0-37.5°C溫育0.5-3小時(shí)，用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2_4次，每次3_5分鐘，之后以30?50uL/孔的添加量將I 牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下振蕩1-2小時(shí)，之后，再次用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5分鐘。
[0036]步驟2)的具體操作方法為:VEGF溶于濃度為0.05?0.2M，pH為7.0?7.6的PBS緩沖液中，并配制成不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以30-100μ!7孔的添加量，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育30-60分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200μL0
[0037]步驟3)的具體操作方法為:將核酸適配體溶于含有0.05?0.2Μ NaCl的I3BS緩沖溶液中，制成濃度為0.1-1μΜ的核酸適配體緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0?7.6，濃度為0.05?0.21，之后以30-10(^17孔的添加量，將濃度為0.1-仏1的核酸適配體緩沖溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL。
[0038]步驟4)的具體操作方法為:
[0039]活化的核酸Al溶液的制備:將I?2yL0.5?ImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5?9yL 50?ΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸Al溶液中，再加入2?5yL 0.1?IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1-1.5小時(shí)，得到活化的核酸Al溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5?7.0;
[0040]活化的核酸A2溶液的制備:將I?2yL0.5?ImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5?9yL 50?ΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸A2溶液中，再加入2?5yL 0.1?IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1-1.5小時(shí)，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5?7.0;
[0041 ] 步驟5)的具體操作方法為:將300-400yL 15_20mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液與0.5_Img的sulfo-SMCC混合后，在室溫下振蕩1-1.5小時(shí)后，用100K的超濾離心管離心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液，其中所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液采用含有0.2?0.4MNaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行配置，磷酸鹽緩沖液濃度為0.1-1M，pH為4.5?7.0。
[0042]步驟6)的具體操作方法為:將步驟5)所得的上清液加入到步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液中，室溫反應(yīng)48-50小時(shí)后，用100K的超濾離心管進(jìn)行分離純化，即得蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液。
[0043]本發(fā)明的發(fā)明人還嘗試了以下檢測(cè)方法:將核酸適配體先與蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2進(jìn)行雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)，之后將所得的雜交鏈產(chǎn)物加入步驟2)所得的聚苯乙烯微孔板中進(jìn)行孵育反應(yīng)，最后在聚苯乙烯微孔板中加入蔗糖溶液反應(yīng)60分鐘，取反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)利用這種檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)信號(hào)低。由此可見本發(fā)明檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子操作步驟的先后順序不可以隨意改變，只有將制得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2作用于核酸適配體-VEGF-VEGF抗體的夾心結(jié)構(gòu)，才能得到很高的檢測(cè)信號(hào)。
[0044]本發(fā)明的雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的檢測(cè)原理如圖1所示:在圖中步驟I表示VEGF抗體固定于聚苯乙烯微孔板中；步驟2表示目標(biāo)物VEGF與VEGF抗體結(jié)合；步驟3表示核酸配體-VEGF-VEGF抗體夾心結(jié)構(gòu)的形成；步驟4表示發(fā)生雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物中包含長(zhǎng)的DNA鏈及蔗糖轉(zhuǎn)移酶;步驟5表示蔗糖轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的催化過程，在步驟5中三角形代表葡萄糖，圓形代表蔗糖;步驟6表示血糖儀檢測(cè)過程。
[0045]本發(fā)明的發(fā)明人還利用該方法來檢測(cè)人體中常見的蛋白，人體中常見蛋白的響應(yīng)圖如圖2所示。從圖2可知，只有VEGF蛋白的響應(yīng)最好，其他的蛋白幾乎沒有響應(yīng)。
[0046]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸適配體，其序列為:5 ’ -TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0047]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸A I，其序列為:5 ’ -TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0048]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸A 2，其序列為:5 ’ -TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0049]較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:I)本發(fā)明利用雜交鏈反應(yīng)，與便攜式的商品化血糖儀相結(jié)合，建立一種高靈敏便攜式的傳感器，利用血糖儀間接的測(cè)出待分析目標(biāo)物白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量;2)本發(fā)明提供了一種新穎的信號(hào)獲取方式，其不需要大型、復(fù)雜、昂貴的檢測(cè)儀器和設(shè)備，利用簡(jiǎn)單、低成本的血糖儀即可實(shí)現(xiàn)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的有效檢測(cè)，具有便攜、簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)；3)本發(fā)明利用了雜交鏈反應(yīng)，雜交鏈反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了無酶化的鏈擴(kuò)增過程，并且使得蔗糖轉(zhuǎn)移酶大量地富集在擴(kuò)增產(chǎn)物鏈上，催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時(shí)結(jié)合商品化血糖儀，對(duì)產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了雙重放大過程，即雜交鏈擴(kuò)增放大與酶放大，大大改善了血糖儀自身檢測(cè)靈敏度不高的缺陷;4)另外本發(fā)明的核酸適配體能夠快速、有效的與目標(biāo)蛋白VEGF結(jié)合，同時(shí)在該核酸適配體的末端包含有一段18堿基的延長(zhǎng)序列，該延長(zhǎng)序列能夠與本發(fā)明合成的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2相互作用實(shí)現(xiàn)雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)，從而在聚苯乙烯微孔板的微孔中固定大量的蔗糖轉(zhuǎn)移酶，這些酶能夠快速的催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而放大檢測(cè)信號(hào)，改善了血糖儀自身檢測(cè)靈敏度不高的缺陷。
【附圖說明】
[0050]圖1是本發(fā)明的交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的檢測(cè)原理圖。
[0051]圖2是利用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)人體中常見蛋白的響應(yīng)圖。
[0052]圖3是本發(fā)明對(duì)不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)后所得的VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行詳細(xì)說明:
[0054]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸適配體，其序列為:5 ’ _TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0055]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸A I，其序列為:5 ’ -TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0056]—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸A 2，其序列為:5 ’ -TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0057]在以下實(shí)施例一至實(shí)施例八中，利用了所述的用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸適配體、核酸Al以及核酸A2。
[0058]實(shí)施例一:測(cè)定當(dāng)VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為50pg/mL時(shí)，所對(duì)應(yīng)的血糖儀讀數(shù)一a
[0059]步驟I):以50uL/孔的添加量，將10yg/mL的VEGF抗體溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0°C溫育I小時(shí)，用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板3次，每次3分鐘，之后以50uL/孔的添加量將I %-5 %牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0 °C下振蕩I小時(shí)，之后，再次用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板3次，每次3分鐘。
[0060]步驟2):VEGF溶于濃度為0.1M，pH為7.5的PBS緩沖液中，并配制成濃度為50pg/mL的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50yL/孔的添加量，將該VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.(TC下孵育30分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為200yL。
[0061 ]步驟3):將核酸適配體溶于含有0.1M NaCl的PBS緩沖溶液中，制成濃度為ΙμΜ的核酸適配體緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M，之后以50yL/孔的添加量，將濃度為ΙμΜ的核酸適配體緩沖溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.(TC下孵育I小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為200yL。
[0062]步驟4):
[0063]活化的核酸Al溶液的制備:將2yLImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到9yLΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸Al溶液中，再加入2yL IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)I小時(shí)，得到活化的核酸Al溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為5.5;
[0064]活化的核酸A2溶液的制備:將2yLImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到9yLΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸A2溶液中，再加入2yL IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)I小時(shí)，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為5.5;
[0065]步驟5)的具體操作方法為:將400yL20mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液與Img的sulfo-SMCC混合后，在室溫下振蕩I小時(shí)后，用100K的超濾離心管離心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液，其中所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液采用含有0.3M NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行配置，磷酸鹽緩沖液濃度為0.1M，pH為7.0。
[0066]步驟6)的具體操作方法為:將步驟5)所得的上清液加入到步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液中，室溫反應(yīng)48小時(shí)后，用100K的超濾離心管進(jìn)行分離純化，即得蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液。
[0067]步驟7):將步驟6)所得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液分別用雜交緩沖液調(diào)至濃度為ΙμΜ，以50yL/孔的添加量分別將濃度為ΙμΜ的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2溶液加入到步驟3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2的摩爾比為1:1，之后在37.(TC下孵育I小時(shí)，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為200yL;
[0068]步驟8)以30μ!7孔的添加量，將2M的蔗糖溶液加入步驟7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)60分鐘，之后取20yL的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)為7.7。
[0069]其中，所述核酸適配體的序列為:
[0070]5，-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3，。
[0071]所述核酸Al的序列為:
[0072]5 ’-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0073]所述核酸探針Al的序列為:
[0074]5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3，
[0075]所述的核酸A2的序列為:
[0076]5’-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0077]所述核酸探針A2的序列為:
[0078]5’-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’
[0079]所述的雜交緩沖液以及沖洗緩沖液均為含有0.1M氯化鈉和0.0lM氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M。
[0080]實(shí)施例二:測(cè)定當(dāng)VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為50pg/mL時(shí)，所對(duì)應(yīng)的血糖儀讀數(shù)一b[0081 ]步驟I):以30uL/孔的添加量，將20yg/mL的VEGF抗體溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.5°C溫育0.5小時(shí)，用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2次，每次5分鐘，之后以30uL/孔的添加量將I %-5 %牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.5°C下振蕩1.5小時(shí)，之后，再次用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2次，每次5分鐘。
[0082]步驟2):VEGF溶于濃度為0.2M，pH為7.0的？85緩沖液中，并配制成濃度為5(^/11^的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以30yL/孔的添加量，將該VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.5°C下孵育60分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150yL。
[0083]步驟3):將核酸適配體溶于含有0.05M NaCl的I3BS緩沖溶液中，制成濃度為0.ΙμΜ的核酸適配體緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0，濃度為0.2M，之后以30yL/孔的添加量，將濃度為0.1yM的核酸適配體緩沖溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.5°C下孵育0.5小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150yL0
[0084]步驟4):
[0085]活化的核酸Al溶液的制備:將IyL 0.5mM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5yL50μΜ的巰基修飾的核酸Al溶液中，再加入5yL 0.1M磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，得到活化的核酸Al溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5;
[0086]活化的核酸A2溶液的制備:將IyL 0.5mM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5yL50μΜ的巰基修飾的核酸A2溶液中，再加入5yL 0.1M磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5;
[0087]步驟5)的具體操作方法為:將300yL15mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液與0.5mg的sulfo-SMCC混合后，在室溫下振蕩1.5小時(shí)后，用100K的超濾離心管離心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液，其中所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液采用含有0.2M NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行配置，磷酸鹽緩沖液濃度為IM，pH為4.5。
[0088]步驟6)的具體操作方法為:將步驟5)所得的上清液加入到步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液中，室溫反應(yīng)50小時(shí)后，用100K的超濾離心管進(jìn)行分離純化，即得蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液。
[0089]步驟7):將步驟6)所得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液分別用雜交緩沖液調(diào)至濃度為2μΜ，以30yL/孔的添加量分別將濃度為2μΜ的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2溶液加入到步驟3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2的摩爾比為1:1，之后在37.5°C下孵育0.5小時(shí)，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150yL;
[0090]步驟8)以40μ!7孔的添加量，將IM的蔗糖溶液加入步驟7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)10分鐘，之后取1yL的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)為7.6。
[0091 ]其中，所述核酸適配體的序列為:
[0092]5 ’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3，。
[0093]所述核酸Al的序列為:
[0094]5’-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0095]所述核酸探針Al的序列為:
[0096]5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3，
[0097]所述的核酸A2的序列為:
[0098]5’-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0099]所述核酸探針A2的序列為:
[0100]5，-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’
[0101 ]所述的雜交緩沖液以及沖洗緩沖液均為含有0.2M氯化鈉和0.02M氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0，濃度為0.2M。
[0102]實(shí)施例三測(cè)定當(dāng)VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為50pg/mL時(shí)，所對(duì)應(yīng)的血糖儀讀數(shù)一c
[0103]步驟I):以40uL/孔的添加量，將15yg/mL的VEGF抗體溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.3°C溫育3小時(shí)，用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板4次，每次4分鐘，之后以40uL/孔的添加量將I %~5%牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.3°C下振蕩2小時(shí)，之后，再次用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板4次，每次4分鐘。
[0104]步驟2) 16?溶于濃度為0.051，？!1為7.6的?85緩沖液中，并配制成濃度為5(^/1^的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10yL/孔的添加量，將該VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.3°C下孵育50分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗4次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為180yL。
[0105]步驟3):將核酸適配體溶于含有0.2M NaCl的PBS緩沖溶液中，制成濃度為0.5μΜ的核酸適配體緩沖溶液，其中I3BS緩沖溶液的pH為7.6，濃度為0.05M，之后以10yL/孔的添加量，將濃度為0.5μΜ的核酸適配體緩沖溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.3°C下孵育45分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗4次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為180μ
L0
[0106]步驟4):
[0107]活化的核酸Al溶液的制備:將1.5yL0.8mM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到8UL 60μΜ的巰基修飾的核酸Al溶液中，再加入4yL 0.5M磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1.2小時(shí)，得到活化的核酸Al溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為7.0;
[0108]活化的核酸A2溶液的制備:將1.5yL0.8mM的三(2_羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到8UL 60μΜ的巰基修飾的核酸A2溶液中，再加入4yL 0.5M磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1.2小時(shí)，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為7.0;
[0109]步驟5)的具體操作方法為:將350yL18mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液與0.8mg的sulfo-SMCC混合后，在室溫下振蕩1.2小時(shí)后，用100K的超濾離心管離心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液，其中所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液采用含有0.4M NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行配置，磷酸鹽緩沖液濃度為0.5M，pH為5.5。
[0110]步驟6)的具體操作方法為:將步驟5)所得的上清液加入到步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液中，室溫反應(yīng)49小時(shí)后，用10K的超濾離心管進(jìn)行分離純化，即得蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液。
[0111]步驟7):將步驟6)所得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液分別用雜交緩沖液調(diào)至濃度為0.4μΜ，以40μ!7孔的添加量分別將濃度為0.4μΜ的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2溶液加入到步驟3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2的摩爾比為1:1，之后在37.3°C下孵育45分鐘，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗4次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為ISOyL;
[0112]步驟8)以35μ!7孔的添加量，將1.5M的蔗糖溶液加入步驟7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)30分鐘，之后取15yL的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)為7.1。
[0113]其中，所述核酸適配體的序列為:
[0114]5 ’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3，。
[0115]所述核酸Al的序列為:
[0116]5 ’-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’；
[0117]所述核酸探針Al的序列為:
[0118]5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3，
[0119]所述的核酸A2的序列為:
[0120]5 ’-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’；
[0121]所述核酸探針A2的序列為:
[0122]5 ’-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’
[0123]所述的雜交緩沖液以及沖洗緩沖液均為含有0.05M氯化鈉和0.007M氯化鎂的I3BS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.6，濃度為0.05M。
[0124]實(shí)施例四:繪制VEGF檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程:
[0125]在實(shí)施例一所述的實(shí)驗(yàn)條件下，分別再測(cè)試其他不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，并獲得相應(yīng)的血糖儀讀數(shù)，其中VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為O，30，80，100，150，200，300，500，750以及1000?8/1^，所得的血糖儀讀數(shù)分別為:0，3.6，10.9，14.3，17.7，21.9，26.5，30.8，32.3,33,根據(jù)實(shí)施例一中50pg/mL的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的血糖儀讀數(shù)、上述VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以及相應(yīng)的血糖儀讀數(shù)繪制血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3所示)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程，方程為y = -27.00+20.83x，R =
0.9859，其中，y是血糖儀讀數(shù)，x是VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值。
[0126]實(shí)施例五:
[0127]VEGF待測(cè)樣的檢測(cè):以30yL/孔的添加量，將一未知濃度的VEGF待測(cè)溶液加入到實(shí)施例一步驟I)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.(TC下孵育I小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為200yL，接著重復(fù)實(shí)施例一中步驟
3)以及實(shí)施例一步驟7)后，以30yL/孔的添加量，將2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)20分鐘后，取1yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)7.5，將該血糖儀讀數(shù)代入實(shí)施例四所得的線性回歸方程中即得VEGF待測(cè)樣中VEGF的濃度為45.3pg/mL;
[0128]計(jì)算方法如下:將y = 7.5代入y = -27.00+20.83x中，得X= 1.656，設(shè)待測(cè)樣中VEGF的濃度為C，即IgC = I.656，得C = 45.3pg/mL
[0129]其中，所述的沖洗緩沖液為含有0.1M氯化鈉和0.0lM氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M。
[0130]實(shí)施例六:[0131 ] VEGF待測(cè)樣的檢測(cè):以50μ?ν孔的添加量，將一未知濃度的VEGF待測(cè)溶液加入到實(shí)施例一步驟I)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.3°C下孵育45分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗4次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為I SOyL，接著重復(fù)實(shí)施例一中步驟3)以及實(shí)施例一步驟7)后，以35yL/孔的添加量，將1.5Μ的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)18分鐘后，取15yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)12.3，將該血糖儀讀數(shù)代入步驟9)所得的線性回歸方程中即得VEGF待測(cè)樣中VEGF的濃度為77.lpg/mL；
[0132]計(jì)算方法如下:將y= 12.3代入y = -27.00+20.83x中，得X= 1.887，設(shè)待測(cè)樣中VEGF 的濃度為 C ,BP IgC= 1.887,得C = 77.lpg/mL
[0133]其中，所述的沖洗緩沖液為含有0.1M氯化鈉和0.0lM氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M。
[0134]實(shí)施例七:
[0135]VEGF待測(cè)樣的檢測(cè):以10yL/孔的添加量，將一未知濃度的VEGF待測(cè)溶液加入到實(shí)施例一步驟I)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.5°C下孵育0.5小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150yL，接著重復(fù)實(shí)施例一中步驟3)以及實(shí)施例一步驟7)后，以40yL/孔的添加量，將IM的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)15分鐘后，取20yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)5.8，將該血糖儀讀數(shù)代入實(shí)施例四所得的線性回歸方程中即得VEGF待測(cè)樣中VEGF的濃度為37.6pg/mL;
[0136]計(jì)算方法如下:將y = 5.8代入y = -27.00+20.83x中，得X= 1.575，設(shè)待測(cè)樣中VEGF的濃度為 C ,BP IgC= 1.575,得C = 37.6pg/mL
[0137]其中，所述的沖洗緩沖液為含有0.1M氯化鈉和0.0lM氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M。
[0138]實(shí)施例八:血清樣品中VEGF的檢測(cè):
[0139]取一份人血清樣品，用濃度為0.1Μ，ρΗ為7.5的I3BS緩沖液稀釋10倍，然后以30yL/孔的添加量，將稀釋后的人血清樣品加入到實(shí)施例一步驟I)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.(TC下孵育I小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為200yL，接著重復(fù)實(shí)施例一中步驟3)以及實(shí)施例一步驟7)后，以30yL/孔的添加量，將2Μ的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)20分鐘后，取1yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)2.6，將該血糖儀讀數(shù)代入實(shí)施例四所得的線性回歸方程中即得稀釋后的人血清樣品中VEGF的濃度26.36pg/mL;最后可知人血清樣品中VEGF 的濃度為 263.6pg/mL;
[0140]計(jì)算方法如下:將7 = 2.6代入7 = -27.00+20.831中，得叉=1.421，設(shè)稀釋后的人血清樣品中VEGF的濃度為C，8卩IgC = 1.421，得C = 26.36pg/mL，則未稀釋的人血清樣品中VEGF的濃度為263.6pg/mLo
[0141]其中，所述的沖洗緩沖液為含有0.1M氯化鈉和0.0lM氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.3，濃度為0.1M。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:它包括以下步驟: 1)將VEGF抗體在聚苯乙烯微孔板中固定并封閉； 2)目標(biāo)物VEGF與VEGF抗體的結(jié)合:將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，進(jìn)行孵育反應(yīng)； 3)核酸適配體-VEGF-VEGF抗體夾心結(jié)構(gòu)的形成:將一定濃度的核酸適配體緩沖溶液加入到步驟2)所得的聚苯乙烯微孔板中，進(jìn)行孵育反應(yīng)， 4)制備活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液； 5)制備sulfo-SMCC活化的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液； 6)制備蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液:將步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液分別與步驟5)所得的sulfo-SMCC活化的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液進(jìn)行混合、反應(yīng)得到蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液； 7)鏈雜交擴(kuò)增反應(yīng)的引發(fā):將步驟6)所得的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液分別用雜交緩沖液調(diào)至濃度為0.4-2μΜ，以30-50μ!7孔的添加量分別將濃度為0.4-2μΜ的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2溶液加入到步驟3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Α2的摩爾比為1:1，之后在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3_5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL; 8)利用血糖儀進(jìn)行檢測(cè):以30?40yL/孔的添加量，將I?2Μ的蔗糖溶液加入步驟7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)10?60分鐘，之后取10?20yL的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到與不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)應(yīng)的不同血糖儀讀數(shù)； 9)繪制VEGF檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程:根據(jù)步驟8)所得的血糖儀讀數(shù)，繪制血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得血糖儀讀數(shù)與VEGF濃度的線性回歸方程； 10)VEGF待測(cè)樣的檢測(cè): 以30-100μ!7孔的添加量，將未知濃度的VEGF待測(cè)溶液加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL，接著重復(fù)步驟3)、步驟7)后，以30?40yL/孔的添加量，將I?2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反應(yīng)15?20分鐘后，取10?20yL的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到血糖儀的試紙表面進(jìn)行檢測(cè)，得到血糖儀讀數(shù)，將該血糖儀讀數(shù)代入步驟9)所得的線性回歸方程中即得VEGF待測(cè)樣中VEGF的濃度； 其中，所述核酸適配體的序列為: 5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’。 所述核酸Al的序列為: 5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’； 所述核酸探針Al的序列為: 5’-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’ 所述的核酸A2的序列為: 5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’； 所述核酸探針A2的序列為: 5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3， 所述的雜交緩沖液以及沖洗緩沖液均為含有0.05?0.2M氯化鈉和0.007?0.02M氯化鎂的PBS緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0?7.6，濃度為0.05?0.2M。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟I)的具體操作方法為:以30?50uL/孔的添加量，將10-20yg/ml的VEGF抗體溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0-37.5°C溫育0.5-3h，用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5min，之后以30?50uL/孔的添加量將I %-5 %牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下振蕩1-2小時(shí)，之后，再次用蒸餾水沖洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3_5min03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟2)的具體操作方法為:VEGF溶于濃度為0.05?0.2M，pH為7.0?7.6的I3BS緩沖液中，并配制成不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以30-100μ!7孔的添加量，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到步驟I)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育30-60分鐘后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200μL04.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟3)的具體操作方法為:將核酸適配體溶于含有0.05?0.2Μ NaCl的I3BS緩沖溶液中，制成濃度為0.1-1μΜ的核酸適配體緩沖溶液，其中PBS緩沖溶液的pH為7.0?7.6，濃度為0.05?0.21，之后以30-10(^17孔的添加量，將濃度為0.1-仏1的核酸適配體緩沖溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5°C下孵育0.5-1小時(shí)后，用沖洗緩沖液沖洗聚苯乙烯微孔板，沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)沖洗緩沖液的用量為150-200yL。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟4)的具體操作方法為: 活化的核酸Al溶液的制備:將I?2yL 0.5?ImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5?9yL 50?ΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸Al溶液中，再加入2?5yL 0.1?IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1-1.5小時(shí)，得到活化的核酸Al溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5?7.0; 活化的核酸A2溶液的制備:將I?2yL 0.5?ImM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到5?9yL 50?ΙΟΟμΜ的巰基修飾的核酸A2溶液中，再加入2?5yL 0.1?IM磷酸鹽緩沖溶液，混合液放置在暗處，于室溫下反應(yīng)1-1.5小時(shí)，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為4.5?7.0。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟5)的具體操作方法為:將300-400yL 15_20mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液與0.5-lmg的sulf o-SMCC混合后，在室溫下振蕩1-1.5小時(shí)后，用100K的超濾離心管離心取上清液，SP得到sulfo-SMCC活化蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液，其中所述的蔗糖轉(zhuǎn)移酶溶液采用含有0.2?0.4MNaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行配置，磷酸鹽緩沖液濃度為0.1-1M，pH為4.5?7.0。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雜交鏈反應(yīng)便攜式檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于:步驟6)的具體操作方法為:將步驟5)所得的上清液加入到步驟4)所得的活化的核酸Al溶液以及活化的核酸A2溶液中，室溫反應(yīng)48-50小時(shí)后，用100K的超濾離心管進(jìn)行分離純化，即得蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針Al溶液以及蔗糖轉(zhuǎn)移酶功能化的核酸探針A2溶液。8.—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸適配體，其特征在于:其序列為:5’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’。9.一種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸Al，其特征在于:其序列為:5’-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3’。10.—種用于檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的核酸A2，其特征在于:其序列為:5’-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK106093438SQ201610377056
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】朱希, 許惠鳳, 楊桂娣, 寇芳霞
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)