基于聯(lián)合檢測fgf1、fgf10和il6的乳腺癌診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于聯(lián)合檢測成纖維細(xì)胞生長因子FGF1、FGF10和白介素IL6的乳腺癌診斷試劑盒，屬于蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域。所述乳腺癌診斷試劑盒包括定量檢測FGF1、FGF10和白介素IL6的試劑。本發(fā)明還請求保護(hù)所述試劑盒的制備方法。采用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行乳腺癌臨床診斷，具有操作方便、成本較低、特異性和準(zhǔn)確性好等優(yōu)點。
【專利說明】
基于聯(lián)合檢測FGF1、FGF10和IL6的乳腺癌診斷試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于蛋白檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于聯(lián)合檢測FGF1、FGF10和IL6的乳腺癌診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]女性乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生中就會有I人患乳腺癌。中國不是乳腺癌的高發(fā)國家，但不宜樂觀，近年我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度卻高出高發(fā)國家I?2個百分點。據(jù)國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示:全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第I位，女性乳腺癌發(fā)病率(粗率)全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬。乳腺癌已成為當(dāng)前社會的重大公共衛(wèi)生問題。
[0003]成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowth factor 1，F(xiàn)GF1)是一個 16.0KD的蛋白，F(xiàn)GFl與FGFs家族中其他成員不同，是在應(yīng)激條件下分泌的。它的生物學(xué)功能相當(dāng)廣泛，在腫瘤的發(fā)生、血管生成、組織和器官發(fā)育、傷口愈合和血細(xì)胞生成等方面都有著重要的作用。在細(xì)胞的層次上，可以調(diào)控細(xì)胞的分化、生長、迀移、增殖和不同細(xì)胞的存活率。而且FGFl不只是可以通過細(xì)胞表面的受體傳遞信號進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，還可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。
[0004]成纖維細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factor 10，F(xiàn)GF10)是一種喊性蛋白，是FGF7亞家族中的一員，與FGF7具有高度的同源性，又被稱作角化細(xì)胞生長因子2(KGF2) ο最開始在鼠的肺間質(zhì)中分離出來，被叫做源于間質(zhì)的生長因子。人體的FGF1含有84-246個氨基酸殘基，是細(xì)胞外區(qū)域蛋白，重組的FGF10含有170個氨基酸殘基，大小在19.3KD。體內(nèi)表達(dá)FGF10的地方主要有:成年肝、腸、肺等器官以及胚胎間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。它的作用主要是:組織器官的形成發(fā)育；組織的修復(fù);傷口愈合;胚胎發(fā)育；血管生成等方面。有過的它與乳腺癌的關(guān)系也只是在細(xì)胞的層面上，并沒有證據(jù)表明其與臨床病情有關(guān)。
[0005]白介素-6(interleukin-6，IL6)是一個30KD的多功能性的糖蛋白。主要是由T細(xì)胞，B細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生。它參與到與受傷和炎癥相關(guān)的急性反應(yīng)調(diào)控。白介素6是免疫反應(yīng)，造血系統(tǒng)，和急性反應(yīng)的一個多功能調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)有報道其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。IL6促進(jìn)造血細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤，和卡波西肉瘤細(xì)胞的增殖，然而它卻抑制Ml骨髓白血病細(xì)胞，早期的黑素瘤細(xì)胞和肺癌、乳腺癌細(xì)胞的增值。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中常用的乳腺癌診斷標(biāo)志物有CEA(癌胚抗原)、CA153等，這些都不是乳腺癌特異性標(biāo)志物，在乳腺癌診斷中缺乏特異性。本發(fā)明基于聯(lián)合檢測FGF1、FGF10和白介素IL6，提高乳腺癌診斷的特異性和準(zhǔn)確率，本領(lǐng)域尚未見此類報道。
[0007]本領(lǐng)域尚需開發(fā)出CEA、CA153以外的，更多可用于診斷乳腺癌的標(biāo)志物及試劑盒， 以豐富乳腺癌臨床診斷指標(biāo)，增加可選擇空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]基于本領(lǐng)域如上所述的乳腺癌診斷可用指標(biāo)少的局限和不足，本發(fā)明提供一種全新的乳腺癌診斷方法:同時以FGFUFGF10和IL6為檢測標(biāo)志物的乳腺癌診斷試劑盒。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，包括定量聯(lián)合檢測FGFl、FGF10和IL6的試劑。
[0011]所述試劑指，F(xiàn)GF1、FGF1和IL6的抗體。
[0012]所述抗體為FGF1、FGF1和IL6的鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
[0013]所述抗體的工作濃度范圍:0.lyg/ml-l.0yg/ml。
[0014]所述乳腺癌診斷試劑盒，還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。
[0015]FGF1、FGF1和IL6的抗體在制備乳腺癌診斷試劑盒方面的用途。
[0016]—種乳腺癌診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中包括FGFl、FGF10和IL6的抗體；和/或
[0017]在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)放置有FGF1、FGF1和IL6的抗體。
[0018]所述抗體為FGF1、FGF1和IL6鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
[0019]所述抗體的濃度范圍:0.lyg/ml-l.0yg/ml。
[0020]組裝所述試劑盒的試劑中還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑;和/或
[0021]在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)還放置有酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。
[0022]本發(fā)明請求保護(hù)一種乳腺癌診斷試劑盒，其特點是，包括聯(lián)合定量檢測FG F1、FGFlO和IL6的試劑。本發(fā)明開創(chuàng)性地同時以FGFl、FGF10和IL6做為乳腺癌診斷的標(biāo)志物，并且通過大量臨床血樣檢測，驗證了FGFl、FGF10和IL6在血液中的濃度在表征乳腺癌發(fā)生方面的相關(guān)性，并進(jìn)一步通過與現(xiàn)有常用標(biāo)志物CEA進(jìn)行對比，證實了FGFl、FGF10和IL6聯(lián)用在臨床診斷乳腺癌方面的準(zhǔn)確性可高達(dá)90%。
[0023]在本發(fā)明一些具體的實施例中，所述試劑為FGFl、FGF10和IL6的抗體。本領(lǐng)域可用于定量檢測FGFl、FGF10和IL6的方法和試劑有很多，并不僅限于本發(fā)明實施例中采用的ELISA方法及其所采用的試劑，還可以是蛋白免疫印跡法及其采用的試劑，或其它常用蛋白檢測方法。在本發(fā)明的啟示下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用其它手段對血樣中的FGF1、FGF10和IL6濃度進(jìn)行定量檢測。因此，在用于診斷乳腺癌的試劑盒中包括了任何定量檢測FGFl、FGFlO和IL6的試劑，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]在本發(fā)明進(jìn)一步的實施例中，所述抗體為FGFl、FGF10和IL6的鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體，均可從商業(yè)途徑獲得。采用該抗體的好處在于:特異性強(qiáng)、吸附性好，結(jié)合率尚O
[0025]在本發(fā)明一些優(yōu)選的實施例中，所述抗體的工作濃度為:0.1yg/ml-1.0yg/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，抗體抗原結(jié)合時，無論是抗體還是抗原，分子的空間構(gòu)象都會發(fā)生一定程度的改變，從而影響分子間的進(jìn)一步結(jié)合、偶聯(lián)或吸附，因此，在樣品中抗原濃度穩(wěn)定的情況下，控制好抗體的工作濃度顯得尤為重要，抗體濃度太高，可能會造成非特異性結(jié)合；抗體濃度太低，可能會造成結(jié)合效率低下;太高或太低都會影響FGFlO濃度檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了保證抗原抗體結(jié)合的特異性、結(jié)合效率、以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明特地探究了FGFlO抗體的工作濃度，發(fā)現(xiàn)濃度處于0.lyg/ml-l.0yg/ml這個范圍時，結(jié)合效率最高，結(jié)果也最準(zhǔn)確。
[0026]為保證試劑盒的完整度，本發(fā)明的另一些優(yōu)選的實施例中的所述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。所述常規(guī)試劑包括:96/48孔板酶標(biāo)檢測板或8孔/12孔微孔板條、TMB底物顯色液、洗滌液、終止液、稀釋液。采用這些常規(guī)試劑，與上述濃度的抗體一起對血液樣品中的FGFl、FGF10和IL6濃度進(jìn)行檢測，進(jìn)而診斷出樣品對應(yīng)的臨床個體是否患有乳腺癌。
[0027]本發(fā)明還請求保護(hù)FGFl、FGF10和IL6在制備乳腺癌診斷試劑盒方面的用途。
[0028]在一些國家專利法允許的情形下，本發(fā)明還請求保護(hù):FGF1、FGF10和IL6和/或所述試劑盒在乳腺癌臨床診斷方面的用途。當(dāng)某血樣中檢出的FGFl的濃度高于100pg/mL，而FGFlO和IL6的濃度均高于300pg/mL時，說明該血樣對應(yīng)的臨床個體患有乳腺癌，反之則為良性或健康。
[0029]本發(fā)明還請求保護(hù)一種乳腺癌診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中包括FGFl、FGF10和IL6的抗體;和/或，在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)放置有FGFl、FGF10和IL6的抗體。
[0030]進(jìn)一步地，組裝所述試劑盒的試劑中還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑；和/或，在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)還放置有酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。本領(lǐng)域可用于定量檢測FGFl、FGF10和IL6的方法和試劑有很多，并僅限于本發(fā)明實施例中采用的ELISA方法及其所采用的試劑。在本發(fā)明的啟示下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用其它手段對血樣中的FGFl、FGF10和IL6濃度進(jìn)行定量檢測。因此，在乳腺癌診斷試劑盒制備過程中采用任何定量檢測FGFl、FGF10和IL6的試劑，或在任何標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)放入任何定量檢測FGFl、FGF10和IL6的試劑，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]采用FGFl、FGF10和IL6和/或本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行乳腺癌診斷，具有操作方便、成本較低、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點。同時，本發(fā)明的建立也為乳腺癌診斷領(lǐng)域提供了新的診斷標(biāo)志物，拓寬了診斷指標(biāo)的可選擇空間。
【附圖說明】
[0032]圖1血清樣本中檢測FGFlO的濃度。
[0033]圖2血清樣本中檢測FGFl。
[0034]圖3血清樣本中檢測IL6。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實施例中所用的試劑和材料，如無特殊說明，均可商購獲得;實驗步驟如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。
[0036]生物材料來源
[0037]本發(fā)明實施例所用到的人血樣來自于廈門大學(xué)第一附屬醫(yī)院。
[0038]實施例1、本發(fā)明所述標(biāo)志物的選擇與驗證[0039 ] FGF1的檢測用到的是Uscn公司的ELISA試劑盒。從圖1我們可以很明顯的看出三組樣本之間存在的差異，健康者的血清FGFlO濃度在104-135pg/ml，良性腫瘤的血清中的濃度在158-208pg/ml之間，惡性腫瘤的血清中的濃度在318-575pg/ml。統(tǒng)計分析顯示良性vs惡性P = 0.004<0.05，惡性vs健康P = 0.0121〈0.05都有顯著性差異。
[0040]實施例2、本發(fā)明所述的試劑盒及其制備
[0041]本實施例提供一種乳腺癌診斷試劑盒，其包括定量檢測纖維母細(xì)胞生長因子10的試劑。
[0042]具體地，所述試劑為纖維母細(xì)胞生長因子10的抗體。
[0043]進(jìn)一步地，所述乳腺癌診斷試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。
[0044]本實施例還提供一種乳腺診斷試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將纖維母細(xì)胞生長因子10的抗體組裝至所述試劑盒中；和/或
[0045]在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)放置有纖維母細(xì)胞生長因子10的抗體。
[0046]所述步驟進(jìn)一步包括:組裝所述試劑盒的試劑中還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑;和/或
[0047]在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)還放置有酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。
[0048]具體地，上面所述的抗體優(yōu)選為FGF1、FGF1和IL6的鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
[0049]所述抗體的工作濃度優(yōu)選采用如下范圍:0.lyg/ml-l.0yg/ml。
[0050]實施例3、采用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行乳腺癌診斷
[0051 ] 如圖1-圖3所示，通過檢測健康、良性、惡性三組的血清樣本中11^6，幾9，11^1，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF14的濃度，最終我們選取了在大部分樣本中都能檢測到并且在惡性患者與健康對照組之間有顯著性差異的IL6，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF10作為診斷乳腺癌的標(biāo)志物。另外我們還在血清中檢測了現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)可的腫瘤標(biāo)志物CEA作為陽性對照，數(shù)據(jù)表明，在檢測CEA被確定為乳腺癌的I號、545400號、50號、48號的樣本中，其FGFl，F(xiàn)GF10或者IL6濃度也是相當(dāng)高的。并且在CEA濃度顯示為正常范圍內(nèi)的39號，45號，494969號，349922號樣本，通過我們檢測IL6，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF10其中的一項或兩項也是高于正常人的。文章報道的乳腺癌病人中有60 %的樣本CEA濃度高于正常值。我們把三種分泌蛋白的檢測結(jié)果中濃度值高于健康和良性組非常明顯的作為陽性計算，結(jié)果顯示符合率至少在73.3%以上。我們還通過對分泌蛋白IL6，F(xiàn)GFI和FGF1進(jìn)行聯(lián)合檢測，比較了與CEA診斷的符合率，發(fā)現(xiàn)IL6，F(xiàn)GFI和FGF1三者聯(lián)合檢測，可獲得更高的乳腺癌診斷的準(zhǔn)確率，高達(dá)90 %。進(jìn)而也提供一種基于IL6，F(xiàn)GF1和FGFlO三者聯(lián)合檢測的乳腺癌診斷方法，特征是，如果血樣中FGFl的濃度高于100pg/mL，而FGFlO和IL6的濃度均高于300pg/mL時，則該血樣對應(yīng)的臨床個體可被診斷為乳腺癌，反之則為良性或健康。
【主權(quán)項】
1.一種乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，包括定量聯(lián)合檢測FGFl、FGF10和IL6的試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑指，F(xiàn)GF1、FGF10和IL6的抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，所述抗體為FGFl、FGF10和IL6的鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，所述抗體的工作濃度范圍:0.lyg/ml-l.0yg/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于，還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。6.?6?1、?6?10和11^6的抗體在制備乳腺癌診斷試劑盒方面的用途。7.—種乳腺癌診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中包括?6?1、？6?10和11^6的抗體;和/或在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)放置有?6?1、？6?10和IL6的抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述抗體為FGF1、FGF1和IL6鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述抗體的濃度范圍:0.lyg/ml-l.Ομg/ml ο10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中還包括酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑;和/或在標(biāo)有乳腺癌診斷用途的包裝盒內(nèi)還放置有酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的常規(guī)試劑。
【文檔編號】G01N33/574GK106093432SQ201610412943
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610412943.4, CN 106093432 A, CN 106093432A, CN 201610412943, CN-A-106093432, CN106093432 A, CN106093432A, CN201610412943, CN201610412943.4
【發(fā)明人】王團(tuán)老, 胡修永, 洪萬進(jìn)
【申請人】廈門大學(xué)