載脂蛋白aⅰ抗血清的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）抗血清的制備方法，其技術(shù)方案要點是：1)將用于制備ApoAⅠ的血清通過化學(xué)試劑處理提純獲得高密度酯蛋白（HDL）；2)將獲得的HDL通過鹽酸胍和化學(xué)試劑處理后經(jīng)過離心、提純，獲得ApoAⅠ；3)將ApoAⅠ作為抗原，免疫動物，制備ApoAⅠ抗血清，該發(fā)明的優(yōu)勢在于1)用化學(xué)試劑處理血清制得濃縮的HDL粗品，使后續(xù)的超速離心次數(shù)和時間大大節(jié)省，為大批量提取ApoAⅠ提供了條件；2)用鹽酸胍處理代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機溶劑低溫脫脂步驟，方法簡便，省時，透析后用凝膠柱層析，收集主峰為高純度的ApoAⅠ得率提高；3)合理提高抗原劑量免疫動物，通過改變劑量，可縮短抗血清的制備時間，而且免疫的成功率亦比傳統(tǒng)方法高。
【專利說明】載脂蛋白A I抗血清的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種載脂蛋白A I抗血清的制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]載脂蛋白A I (ApoA I )是人血清中高密度脂蛋白(HDL)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占HDL質(zhì)量的32.5-35.0%，因此，ApoA I含量可以代表HDL水平，并與HDL中的膽固醇呈明顯正相關(guān)。臨床上ApoA I測定常作為心腦血管病的風(fēng)險度估計和ApoA I缺乏癥(如Tangier病:是一種罕見的遺傳性疾病)的診斷。所有ApoAI的免疫測定技術(shù)均需用ApoA I抗血清，目前國際和國內(nèi)通用的ApoA I測定試劑盒均采用免疫透射比池法(Immunoturbidimetricassay, ITA)，因其快速、準(zhǔn)確、精密并適用于各種類型的自動生化分析儀，特別適用大批量標(biāo)本的測定。為了滿足臨床檢驗需要，大批量制備高純度ApoA I抗血清顯得非常重要。
[0003]傳統(tǒng)技術(shù)制備載脂蛋白Al抗血清，是直接用人血清通過二次超速離心制備獲得HDL,然后使用S印hsrose 4B柱層析，收集主峰為HDL組份，再用醇和醚作為溶劑，醇和醚的體積比例為2:3，在-20°C下連續(xù)攪拌12-16小時進行在脫脂，經(jīng)過濾，將濾紙上的去脂HDL (ApoHDL)烘干，然后將其溶解經(jīng)S印hadex G-150柱層析，收集主峰II為ApoAl組份，再經(jīng)DEAE纖維素離子交換層析得純品。再把制得的ApoAl免疫動物，以每次3mg/每只免疫動物的劑量進行免疫，免疫4- 5次，甚至更多，制備獲得ApoAl的抗血清。
[0004]傳統(tǒng)方法直接從血漿中超速離心獲得HDL需要的離心次數(shù)多，且耗時長，而且用有機溶劑對HDL進行脫脂的工藝要求嚴格，步驟控制難，如脫脂不完全，會影響ApoA I的產(chǎn)率，甚至完全失敗，而且在進行動物的免疫過程時，耗費的時間過長，制備時間緩慢，而且免疫動物時，免疫次數(shù)多、免疫的效價和成功率也極低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種載脂蛋白A I抗血清的制備方法，該制備方法的優(yōu)點有:
1).用多陰離子和二價金屬離子制備濃縮的HDL粗品，使后續(xù)的超速離心次數(shù)和時間大大節(jié)省，為大批量提取ApoA I提供了條件；
2)用鹽酸胍處理代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機溶劑低溫脫脂步驟，方法簡便，省時、透析后用凝膠柱層析，收集主峰為高純度的ApoA I且得率提高；
3)合理提高抗原劑量免疫動物，可縮短抗血清的制備時間，只須傳統(tǒng)方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的載脂蛋白A I抗血清的制備方法，包括如下步驟:
1)高密度脂蛋白的提取:將用于制備載脂蛋白AI的血清通過濃度為6%-22%的多陰離子化合物和濃度為2-6mol/L的二價金屬離子處理后提純獲得高密度脂蛋白；
2)載脂蛋白AI的提取:將獲得的高密度脂蛋白通過濃度為4-lOmol/L鹽酸胍處理后經(jīng)過超速離心、梯度層析，獲得載脂蛋白A I ；3)載脂蛋白A I抗血清的制備:將載脂蛋白A I作為抗原，對免疫動物進行免疫反應(yīng)，制備載脂蛋白A I抗血清。
[0007]通過采用上述方案，將血清先通過低濃度的多陰離子化合物和二價金屬離子處理后能夠使血清中的低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白沉淀，然后再加大二者濃度沉淀高密度脂蛋白，能夠減少傳統(tǒng)工藝當(dāng)中的離心所花的時間和材料，使ApoA I抗血清制備的效率大大提升，為大批量提取ApoA I提供了條件；然后通過超速離心(密度范圍用d=1.075-1.190)，目的是去掉低端富含ApoC和高端富含ApoE的HDL顆粒，有利于后繼的載脂蛋白Al的提純，同時將HDL用鹽酸胍處理，相比傳統(tǒng)的醇醚脫脂(在低溫下連續(xù)拌)，無機試劑的反應(yīng)條件更加容易控制，而且工藝要求簡單，避免了 HDL脫脂時出現(xiàn)問題而影響ApoA I的產(chǎn)率的情況發(fā)生，方法簡便，省時、透析后用凝膠柱層析，收集主峰為高純度的ApoA I且得率提高；最后通過用將ApoA I作為抗原注射到免疫動物身上，通過免疫動物本身的免疫反應(yīng)產(chǎn)生ApoA I抗血清，通過合理的加大劑量，可縮短抗血清的制備時間，而且免疫的成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
[0008]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述第I)步驟中，所述用于制備載脂蛋白A I的血清通過多陰離子化合物和二價金屬離子處理后，需再經(jīng)過濃度為0.3-lmol/L的草酸鉀獲得高密度脂蛋白粗品。
[0009]通過采用上述方案，將通過多陰離子化合物和二價金屬離子處理后的血清用
0.3-lmol/L的草酸鉀進行處理，能夠除去其中多余的多陰離子和二價金屬離子，確保二者不會對后續(xù)的制備產(chǎn)生影響。
[0010]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述獲得的高密度脂蛋白粗品，需進一步用超速離心提純時將密度范圍縮小到1 .075-1.190 do
[0011]通過采用上述方案，將載脂蛋白粗品進一步用超速離心提純將密度范圍縮小到
1.075-1.190 d,目的是將含ApoC和ApoE較多的HDL顆粒去掉，為后繼的提純打好基礎(chǔ)。
[0012]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述獲得的高密度脂蛋白需依次經(jīng)過溴化鉀進行密度調(diào)節(jié)，然后用生理鹽水透析后，離心，提純，獲得高密度脂蛋白純品。
[0013]通過采用上述方案，將HDL用溴化鉀調(diào)節(jié)密度，然后離心機進行離心，離心后收集下層液體，用溴化鉀再次調(diào)節(jié)密度，獲得的高密度脂蛋白粗品，收集上層液，用生理鹽水透析即可獲得較高純度的HDL，能夠使離心的次數(shù)和時間大大減少，同時將高密度脂蛋白進行提純，也能夠避免在進行載脂蛋白A I提取時，引入其他的雜蛋白，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。
[0014]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述血清中多陰離子化合物、二價金屬離子和草酸鉀殘留的濃度依次分別為6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
[0015]通過采用上述方案，通過草酸鉀與多陰離子化合物和二價金屬離子反應(yīng)，將三者的濃度控制到多陰離子化合物6%、二價金屬離子0.3mol/L和草酸鉀0.03mol/L，可以避免引入的三種試劑對制備造成影響。
[0016]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述第2)步驟所述的鹽酸胍處理包括將高密度脂蛋白依次通過鹽酸胍、溴化鉀、生理鹽水和濃度為5-llmol/L的尿素進行處理。
[0017]通過采用上述方案，將HDL純品中加入鹽酸胍，將HDL中的載脂蛋白(主要為ApoA I ,以及ApoA I1、ApoC, ApoE等)分離出來,免去了有機溶劑低溫脫脂的繁瑣步驟,用生理鹽水除去鹽酸胍，用溴化鉀調(diào)節(jié)其密度，然后再次離心，收集離心管下層溶液，用生理鹽水除去溴化鉀，再用尿素透析，通過采用上述方法，改變傳統(tǒng)的用醇醚脫脂，避免了傳統(tǒng)工藝制備時失敗而使HDL的浪費。
[0018]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述經(jīng)過鹽酸胍處理的高密度脂蛋白通過凝膠柱層析純化獲取載脂蛋白A I，并將載脂蛋白A I進行冰凍保存。
[0019]通過采用上述方案，將處理過的HDL純品通過凝膠柱層析層析，收集主峰的樣品即為ApoAl純品，這樣獲取的ApoAl純品相比傳統(tǒng)方式，含量大大提高，同時將ApoAl進行冰凍保存，達到一次提純多次免疫動物的目的。
[0020]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述冰凍保存的溫度為零下20°C至零下80°C。
[0021]通過采用上述方案，將冰凍保存的溫度設(shè)置為零下20°C至零下80°C，能夠保證ApoAl的抗原性不會變化，能夠?qū)poAl進行較長期保存。
[0022]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述作用在免疫動物上的ApoA I為每次8_14mg/每只免疫動物。
[0023]通過采用上述方案，用在免疫動物上的ApoA I為每次8-14/mg每只免疫動物，在免疫動物時只需要免疫2次，大多數(shù)綿羊的抗體效價即可達到要求，剩下的少數(shù)綿羊再追加免疫注射一次，抗體效價即可達到要求。不但免疫時間上只是傳統(tǒng)方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
[0024]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述免疫動物時采用的注射方式采用背部多點皮下注射。
[0025]通過采用上述方案，采用背部多點注射，能夠避免一次性大劑量注射對免疫動物造成的免疫反應(yīng)過于激烈，使免疫動物死亡。
[0026]本發(fā)明的進一步設(shè)置為，所述用于制備ApoA I的血清均通過乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)檢測結(jié)果呈陰性。
[0027]通過采用上述方案，將制備ApoA I的血清通過病毒檢測能夠保證本發(fā)明提供的載脂蛋白A I抗血清的制備方法所制備出的ApoA I抗血清無毒無害，在進行ApoA I測定時不會對被測定者造成損害，提高了生物安全性。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明的制備步驟具體可分為:1)HDL粗品的提??；2)HDL組份的進一步提純；3)ApoA I的提取；4)抗ApoA I血清的制備。
[0029]【具體實施方式】如下:
實施例一:1.HDL粗品的提取:收集混合人血清5L(此處需說明的是，本實施例中所采取的用量只是為了便于本發(fā)明進行步驟的闡述，具體的用量以生產(chǎn)情況為準(zhǔn))，[經(jīng)檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加10%多陰離子25ml和2mol/L氯化鈣250ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為LDL和VLDL，收集作ApoB抗原提取用，收集上層液，追加10%多陰離子250ml和2mol/L氯化鈣250ml，混勻，放置2小時后，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集沉淀物即為HDL組份，加0.5mol/L草酸鉀250ml，使多陰離子沉淀并分離HDL，離心后上層液(HDL組份)用生理鹽水透析，備用。[0030]2.HDL組份的進一步提純:HDL組份的密度范圍為1.063-1.21 g/cm3，用KBr調(diào)節(jié)透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(此處需說明的是，本實施例所采用的離心機型號只是便于實施例說明，任何滿足制備要求的離心機均可使用)，專用離心管(30ml/每管)裝10管，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時，收集離心管下層液，再用溴化鉀(KBr)調(diào)節(jié)密度到1.21g/cm3，按上述離心條件離心，收集上層液，用生理鹽水透析，即為P =1.063-1.21 g/cm3的HDL純品。
[0031]3.ApoA I的提取:HDL純品加鹽酸胍到6mol/L，37°C保溫3小時，使HDL顆粒中的載脂蛋白(主要為ApoA I ,以及ApoA I1、ApoC, ApoE等)分離出來,用生理鹽水透析除去鹽酸胍，用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21 g/cm3，按上述離心條件，再次離心，收集離心管下三分之一段的溶液，用生理鹽水透析除去KBr,再用6mol/L尿素透析,備用，然后用DEAE-SepharoseCL6B柱梯度層析，收集主峰即為ApoA I純品，透析去除尿素，用島津-UV2550型分光光度計280nm波長測定蛋白含量,總計ApoA I含量約2.3g,調(diào)節(jié)ApoA I濃度至2mg/ml, -20°C,冰凍保存，至少可穩(wěn)定二年，此ApoA I抗原量至少可免疫約80只綿羊。
[0032]4.抗ApoA I血清的制備:將ApoA I純品，IOmg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點皮下注射，二周后，用同樣劑量的ApoA I純品，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部多點皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml，分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對人血清作雙向免疫擴散測定，效價達到1:16或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時分離出抗血清，對于效價未達到1:16者以同樣劑量作第三次免疫注射后第十天進行效價測定，達到要求的羊作頸靜脈插管放血，并及時分離出血清，將所有的血清混合后作為一個批次，用雙向免疫擴散法進行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只與ApoA I純 品或提純的HDL產(chǎn)生沉淀線，與ApoB、ApoA I1、ApoC、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達到要求。
[0033]實施例二:1.HDL粗品的提取:收集混合人血清5L (此處需說明的是，本實施例中所采取的用量只是為了便于本發(fā)明進行步驟的闡述，具體的用量以生產(chǎn)情況為準(zhǔn))，[經(jīng)檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加20%多陰離子25ml和4mol/L氯化鈣250ml,混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為LDL和VLDL,收集作ApoB抗原提取用，收集上層液，追加20%多陰離子250ml和4mol/L氯化鈣250ml，混勻，放置2小時后，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集沉淀物即為HDL組份，加Imo 1/L草酸鉀250ml，使多陰離子沉淀并分離HDL，離心后上層液(HDL組份)用生理鹽水透析，備用。
[0034]2.HDL組份的進一步提純:HDL組份的密度范圍為1.063-1.21 g/cm3，用KBr調(diào)節(jié)透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機，專用離心管(30ml/每管)裝10管，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21 g/cm3,按上述離心條件離心,收集上層液,用生理鹽水透析，即為 P =1.063-1.21 g/cm3 的 HDL 純品。
[0035]3.ApoA I的提取:HDL純品加鹽酸胍到9mol/L，37°C保溫3小時，使HDL顆粒中的載脂蛋白(主要為ApoA I ,以及ApoA I1、ApoC, ApoE等)分離出來,用生理鹽水透析除去鹽酸胍，用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21，按上述離心條件，再次離心，收集離心管下三分之一段的溶液，用生理鹽水透析除去KBr,再用6mol/L尿素透析,備用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度層析，收集主峰，即為ApoA I純品，透析去除尿素，用島津-UV2550型分光光度計280nm波長測定蛋白含量，總計ApoA I含量約2.3g,調(diào)節(jié)ApoA I濃度至2mg/ml, _20°C,冰凍保存,至少可穩(wěn)定二年,此ApoA I抗原量至少可免疫約80只綿羊。
[0036]4.抗ApoA I血清的制備:將ApoA I純品，IOmg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點皮下注射，二周后，用同樣劑量的ApoA I純品，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部多點皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml，分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對人血清作雙向免疫擴散測定，效價達到1:16或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時分離出抗血清，對于效價未達到1:16者以同樣劑量作第三次免疫注射后第十天進行效價測定，達到要求的羊作頸靜脈插管放血，并及時分離出血清，將所有的血清混合后作為一個批次，用雙向免疫擴散法進行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只與ApoA I純品或提純的HDL產(chǎn)生沉淀線，與ApoB、ApoA I1、ApoC、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達到要求。
[0037]實施例三:1.HDL粗品的提取:收集混合人血清5L (此處需說明的是，本實施例中所采取的用量只是為了便于本發(fā)明進行步驟的闡述，具體的用量以生產(chǎn)情況為準(zhǔn))，[經(jīng)檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加15%多陰離子25ml和3mol/L氯化鈣250ml,混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為LDL和VLDL,收集作ApoB抗原提取用，收集上層液，追加15%多陰離子250ml和3mol/L氯化鈣250ml，混勻，放置2小時后，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集沉淀物即為HDL組份，加lmol/L草酸鉀250ml，使多陰離子沉淀并分離HDL，離心后上層液(HDL組份)用生理鹽水透析，備用。
[0038]2.HDL組份的進一步提純:HDL組份的密度范圍為1.063-1.21 g/cm3，用KBr調(diào)節(jié)透析后的HDL溶液， 使其密度到1.063 g/cm3,用BECKmol/LAN_COULTER L-90K制備型超速離心機，專用離心管(30ml/每管)裝10管，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21 g/cm3，按上述離心條件離心，收集上層液，用生理鹽水透析，即為 d=l.063-1.21 g/cm3 的 HDL 純品。
[0039]3.ApoA I的提取:HDL純品加鹽酸胍到7mol/L，37°C保溫3小時，使HDL顆粒中的載脂蛋白(主要為ApoA I ,以及ApoA I1、ApoC, ApoE等)分離出來,用生理鹽水透析除去鹽酸胍，用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21，按上述離心條件，再次離心，收集離心管下三分之一段的溶液，用生理鹽水透析除去KBr,再用8mol/L尿素透析,備用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度層析，收集主峰，即為ApoA I純品，透析去除尿素，用島津-UV2550型分光光度計280nm波長測定蛋白含量，總計ApoA I含量約2.3g,調(diào)節(jié)ApoA I濃度至2mg/ml, _20°C,冰凍保存,至少可穩(wěn)定二年,此ApoA I抗原量至少可免疫約80只綿羊。
[0040]4.抗ApoA I血清的制備:將ApoA I純品，IOmg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點皮下注射，二周后，用同樣劑量的ApoA I純品，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部多點皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml，分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對人血清作雙向免疫擴散測定，效價達到1:16或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時分離出抗血清，對于效價未達到1:16者以同樣劑量作第三次免疫注射后第十天進行效價測定，達到要求的羊作頸靜脈插管放血，并及時分離出血清，將所有的血清混合后作為一個批次，用雙向免疫擴散法進行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只與ApoA I純品或提純的HDL產(chǎn)生沉淀線，與ApoB、ApoA I1、ApoC、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達到要求。
[0041 ] 實施例四:1.HDL粗品的提取:收集混合人血清5L (此處需說明的是，本實施例中所采取的用量只是為了便于本發(fā)明進行步驟的闡述，具體的用量以生產(chǎn)情況為準(zhǔn))，[經(jīng)檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加18%多陰離子25ml和3.6mol/L氯化鈣250ml,混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為LDL和VLDL,收集作ApoB抗原提取用，收集上層液，追加15%多陰離子250ml和3.6mol/L氯化鈣250ml，混勻，放置2小時后，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集沉淀物即為HDL組份，加lmol/L草酸鉀250ml，使多陰離子沉淀并分離HDL，離心后上層液(HDL組份)用生理鹽水透析，備用。
[0042]2.HDL組份的進一步提純:HDL組份的密度范圍為1.063-1.21 g/cm3，用KBr調(diào)節(jié)透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機，專用離心管(30ml/每管)裝10管，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21 g/cm3,按上述離心條件離心,收集上層液,用生理鹽水透析，即為 d=l.063-1.21 g/cm3 的 HDL 純品。
[0043]3.ApoA I的提取:HDL純品加鹽酸胍到8mol/L，37°C保溫3小時，使HDL顆粒中的載脂蛋白(主要為ApoA I ,以及ApoA I1、ApoC, ApoE等)分離出來,用生理鹽水透析除去鹽酸胍，用KBr調(diào)節(jié)密度到1.21，按上述離心條件，再次離心，收集離心管下三分之一段的溶液，用生理鹽水透析除去KBr,再用 9mol/L尿素透析,備用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度層析，收集主峰，即為ApoA I純品，透析去除尿素，用島津-UV2550型分光光度計280nm波長測定蛋白含量，總計ApoA I含量約2.3g,調(diào)節(jié)ApoA I濃度至2mg/ml, _20°C,冰凍保存,至少可穩(wěn)定二年,此ApoA I抗原量至少可免疫約80只綿羊。
[0044]4.抗ApoA I血清的制備:將ApoA I純品，IOmg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點皮下注射，二周后，用同樣劑量的ApoA I純品，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部多點皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml，分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對人血清作雙向免疫擴散測定，效價達到1:16或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時分離出抗血清，對于效價未達到1:16者以同樣劑量作第三次免疫注射后第十天進行效價測定，達到要求的羊作頸靜脈插管放血，并及時分離出血清，將所有的血清混合后作為一個批次，用雙向免疫擴散法進行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只與ApoA I純品或提純的HDL產(chǎn)生沉淀線，與ApoB、ApoA I1、ApoC、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達到要求。
[0045]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種載脂蛋白A I抗血清的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)高密度脂蛋白的提取:將用于制備載脂蛋白AI的血清通過濃度為6%-22%的多陰離子化合物和濃度為2-6mol/L的二價金屬離子處理后提純獲得高密度脂蛋白； 2)載脂蛋白AI的提取:將獲得的高密度脂蛋白通過濃度為4-lOmol/L鹽酸胍處理后經(jīng)過超速離心、梯度層析，獲得載脂蛋白A I ； 3)載脂蛋白AI抗血清的制備:將載脂蛋白A I作為抗原，對免疫動物進行免疫反應(yīng)，制備載脂蛋白A I抗血清。
2.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述第I)步驟中，所述用于制備載脂蛋白A I的血清通過多陰離子化合物和二價金屬離子處理后，需再經(jīng)過濃度為0.3-lmol/L的草酸鉀沉淀除去多陰離子化合物和二價金屬離子，獲得高密度脂蛋白粗品。
3.如權(quán)利要求2所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述獲得的高密度脂蛋白粗品，需進一步用超速離心提純時將密度范圍縮小到1.075-1.190 d。
4.如權(quán)利要求2所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述獲得的高密度脂蛋白粗品需依次經(jīng)過溴化鉀進行密度調(diào)節(jié)，然后用生理鹽水透析后，離心，提純，獲得高密度脂蛋白純品。
5.如權(quán)利要求2所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述血清中多陰離子化合物、二價金屬離子和草酸鉀殘留的濃度依次分別為6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
6.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述第2)步驟所述的鹽酸胍處理包括將高密度脂蛋白依次通過鹽酸胍、溴化鉀、生理鹽水和濃度為5-llmol/L的尿素進行處理。
7.如權(quán)利要求6所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述經(jīng)過鹽酸胍處理的高密度脂蛋白通過凝膠柱層析純化獲取載脂蛋白A I，并將載脂蛋白A I進行冰凍保存。
8.如權(quán)利要求7所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述冰凍保存的溫度為零下20°C至零下80°C。
9.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述第3)步驟中，所述作用在免疫動物上的載脂蛋白A I的量為每次8 - 14mg/每只免疫動物。
10.如權(quán)利要求1-9任意一項所述的載脂蛋白AI抗血清的制備方法，其特征在于:所述用于制備載脂蛋白A I的血清均通過乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗體以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體檢測，且檢測結(jié)果須呈陰性。
【文檔編號】C07K16/18GK104017076SQ201410004059
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】楊昌國 申請人:寧波博泰生物技術(shù)有限公司