一種響應面法優(yōu)化的酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種響應面法優(yōu)化的酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）的方法，本發(fā)明方法用酸性乙醇溶液作為提取溶媒提取桑葉1-DNJ，利用響應面法對提取條件進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為液料比為25，即25mL提取溶媒/g桑葉粗粉，在80℃條件下浸提2.7h，重提1次，濾液經(jīng)純化、濃縮后得1-DNJ提取液；本發(fā)明方法可獲得約0.2%的桑葉1-DNJ提取率，顯著高于傳統(tǒng)的乙醇提取率0.00139%，及稀酸提取效率0.00147%，說明稀酸和乙醇在浸提桑葉1-DNJ中發(fā)生了協(xié)同作用，產(chǎn)生了不可預見的效果，為桑葉1-DNJ產(chǎn)品的在醫(yī)藥和保健品方面的開發(fā)利用提供理論支持和技術(shù)指導。
【專利說明】一種響應面法優(yōu)化的酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取1-脫氧野尻霉素的方法，具體涉及一種響應面法優(yōu)化的稀酸乙醇提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，屬于植物提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]桑葉1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)是從桑樹(Morus alba L.)中發(fā)現(xiàn)的一種天然哌啶類小分子水溶性生物堿，分子量為163.7。作為強效的糖代謝酶抑制劑(比如α -葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等)，DNJ可顯著延緩多糖的降解過程，可降低餐后血糖的峰值，穩(wěn)定空腹血糖。此外，DNJ還有胰島素增敏的作用，改善胰島素抵抗。
[0003]桑葉1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)屬于哌啶類小分子水溶性生物堿，因此現(xiàn)有文獻多以去離子水提取法、溶劑提取法和酸提取法，而且提取效率低、成本高。溶劑提取主要采用乙酸乙酯、乙醇和石油醚等溶劑分部提取；而酸提取法主要采用稀鹽酸和稀硫酸提取桑葉中的1-脫氧野尻霉素。文件CN102675188A中公開乙醇提取率(1_脫氧野尻霉素的提取量X 100% /所用桑組織的質(zhì)量)為0.00139%，蒸餾水提取法提取率0.00121%，稀酸提取效率為0.00147%。因此，桑樹中1-脫氧野尻霉素提取效率較低成為1-脫氧野尻霉素制備的瓶頸問題。在有關(guān)桑葉1-DNJ提取方法的文獻中不也有以傳統(tǒng)的煎煮法、回流提取法及超生波輔助提取法等。然而，煎煮法會使1-DNJ結(jié)構(gòu)被破壞，降低其生物利用度；回流法及超聲波輔助提取法則有工藝復雜，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等缺點。目前的這些提取方法很難滿足人們對1-DNJ的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種響應面法優(yōu)化的稀酸乙醇提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0006]一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，包括以下步驟:
[0007]I)取體積濃度為40~70%的乙醇溶液并調(diào)節(jié)pH值為2~7作為提取溶媒，加入桑葉粗粉，混勻，使液料比為10~30，即10~30mT提取溶媒/g桑葉粗粉，在70~90°C條件下浸提1.5~3h，抽濾，分別得1-DNJ初步提取液和桑葉濾渣；
[0008]2)將桑葉濾渣按步驟I)重復浸提I~4次，將每次所得1-DNJ初步提取液混合；
[0009]3)將混合的1-DNJ初步提取液進行減壓濃縮，離心，收集上清液，抽濾，收集濾液；
[0010]4)再將濾液用超純水稀釋至體積為提取溶媒的0.03~0.1倍，再經(jīng)純化，減壓濃縮，即得桑葉1-DNJ提取液。
[0011]進一步的，一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，通過響應面法優(yōu)化后，包括以下步驟:
[0012]I)取體積濃度為66.5%的乙醇溶液并調(diào)節(jié)pH值為6.7作為提取溶媒，加入桑葉粗粉，混勻，使液料比為25，即25mL提取溶媒/g桑葉粗粉，在80 (條件下浸提2.7h，抽濾，分別得1-DNJ初步提取液和桑葉濾渣；
[0013]2)將桑葉濾渣按步驟I)重復浸提I次，將2次所得1-DNJ初步提取液混合；
[0014]3)將混合的1-DNJ初步提取液進行減壓濃縮，離心，收集上清液，抽濾，收集濾液；
[0015]4)再將濾液用超純水稀釋至體積為提取溶媒的0.04倍，再經(jīng)純化，減壓濃縮，即得桑葉1-DNJ提取液。
[0016]進一步的，上述所有調(diào)節(jié)pH用到的調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硫酸和醋酸。 [0017]進一步的,上述所有離心為:4500~5500rpm離心13~18min。
[0018]進一步的，上述所有純化的具體過程為:將溶液用732H型陽離子交換樹脂純化富集，除去中性及酸性成分，去離子水清洗離子交換柱，洗至流出液至無色后，用體積比為7:3的氨水和乙醇混合液開始洗脫，收集洗脫液。
[0019]進一步的，上述在所述的響應面法優(yōu)化過程中，設置乙醇濃度、pH值、浸提時間3個變量，并利用DesignExpert7.1.6軟件根據(jù)Box-Behnken設計原則進行優(yōu)化。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:
[0021]本文充分考慮了以上因素，優(yōu)化了桑葉1-DNJ提取工藝參數(shù)，非常具有實用價值，也為桑葉降糖成分1-DNJ在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域的研究開發(fā)打下了夯實的基礎，提供了可靠的依據(jù)，更為糖尿病的治療研究提供了新思路、新方法。
[0022]本文結(jié)合1-DNJ結(jié)構(gòu)及現(xiàn)有提取方法，首次采用稀酸乙醇溶液浸提桑葉中1-DNJ，為開發(fā)桑葉1-DNJ降血糖提供新的提取途徑，在單因素試驗基礎上，以1-DNJ提取率為指標，采用響應面分析法(Response Surface Methodology)優(yōu)化提取工藝,確定最佳提取條件，獲得約0.2 %的桑葉1-DNJ提取率，顯著高于傳統(tǒng)的乙醇提取率0.00139 %，及稀酸提取效率0.00147%，說明稀酸和乙醇在浸提桑葉1-DNJ中發(fā)生了協(xié)同作用，產(chǎn)生了不可預見的效果，為桑葉1-DNJ產(chǎn)品的在醫(yī)藥和保健品方面的開發(fā)利用提供理論支持和技術(shù)指導。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為1-DNJ的標準曲線；
[0024]圖2為1-DNJ標準品HPLC-ELSD檢測色譜圖；
[0025]圖3為桑葉中1-DNJ HPLC-ELSD檢測色譜圖；
[0026]圖4為浸提時間對1-DNJ提取率的影響；
[0027]圖5為乙醇濃度對1-DNJ提取率的影響；
[0028]圖6為pH值對1-DNJ提取率的影響；
[0029]圖7為液料比對1-DNJ提取率的影響；
[0030]圖8為乙醇濃度及浸提時間對1-DNJ提取量的等高線㈧和響應面⑶；
[0031]圖9為乙醇濃度及pH值對1-DNJ提取量的等高線㈧和響應面⑶；
[0032]圖10為浸提時間及pH值對1-DNJ提取量的等高線㈧和響應面⑶。
【具體實施方式】
[0033]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但并不局限于止。
[0034]實施例1:[0035]一、1-DNJ的標準曲線及HPLC-ELSD檢測圖譜
[0036]I)標準曲線繪制
[0037]精密稱取1-DNJ標準品3.56mg至50mL容量瓶中，利用超純水溶解配制成含量為71.2μ g.HlL-1的母液,進樣量分別為5μ L, 10 μ L，20 μ L，30 μ L，40 μ L，根據(jù)質(zhì)量和峰面積的關(guān)系制作標準曲線。以標準品1-DNJ標準溶液質(zhì)量X-對峰面積Y-進行線性回歸，所得的回歸方程為Υ=624.56Χ-112.74，R2=0.9991，在0.356~2.848 μ g.πιl-1范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系(見圖1)。
[0038]2)高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器(HPLC-ELSD)檢測圖譜
[0039]用HCl調(diào)節(jié)乙醇溶液的pH約為6.5作為提取溶媒，精確稱取10.0g桑葉粗粉加入提取溶媒中，置于80°C恒溫水浴浸提兩次，抽濾，合并濾液并濃縮，后于5000r.mirT1離心約15min，收集上清液，抽濾，定容至10mL。用732H型陽離子交換樹脂純化富集，除去中性及酸性成分，去離子水洗至無色后用氨水/乙醇(70:30)溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮除去氨水/乙醇，用去離子水定容至5ml容量瓶中，精密量取Iml用去離子水定容至25ml容量瓶，0.45 μ m濾頭過濾，備用，待HPLC-ELSD檢測。
[0040]色譜條件:色譜柱為DIKMA Platisil NH2 (4.6mmX250mm, 5 μ m);流動相(乙腈-水=90:10);流速為1.0ml.mirT1;ELSD漂移管溫度40°C ;載氣流速3.5X IO5Pa0分析軟件為:DesignExpert7.L 6,外標法分析計算。
[0041]因為蒸發(fā)光檢測器的特殊性，計算濃度不可用一般的紫外檢測，峰面積-含量函數(shù)直接計算。樣品中1-DNJ含量計算公式為，log A=b log m+log a。
[0042]圖2和圖3分別為1-DNJ標準品及桑葉中1-DNJ的HPLC-ELSD檢測圖譜，從圖中可看出樣品中1-DNJ保留時間為7min，并且基線較平穩(wěn)。說明通過HPLC-ELSD檢測方法穩(wěn)定可行。
[0043]二、單因素實驗
[0044]在本試驗中，分別選取浸提時間、乙醇濃度、pH值及液料比4個因素作為影響桑葉1-DNJ提取率的研究對象。選取時間分別為1.0, 1.5,2.0,2.5和3.0h ;選取乙醇體積濃度為 30%,40%,50%,60%^P 70% ;選取 pH 值分別為:1，2，3，4，5，6 和 7 ;液料比為 10，15，20，25和30ml提取溶媒/g粗粉。觀察各因素對桑葉1-DNJ提取率的影響，每個樣品重復3次。本文中所述的提取溶媒均為經(jīng)HCl調(diào)節(jié)至一定pH值的乙醇溶液。
[0045]I)浸提時間對桑葉1-DNJ提取率的影響
[0046]在乙醇濃度為70%、pH值為7、液料比為20ml提溶媒/ g桑葉粗粉、溫度為80°C的條件研究較優(yōu)的提取時間，分別選取提取時間1.0, 1.5,2.0,2.5和3.0h。
[0047]從圖4可以看出，桑葉的1-DNJ質(zhì)量分數(shù)隨著浸提時間增加而逐漸增高，當浸提時間為2.1h時，桑葉1-DNJ提取率達到最高為0.1674%;但隨著浸提時間的增加，1-DNJ含量反而減少。因此，浸提時間為2.0h較適宜。
[0048]2)乙醇濃度對桑葉1-DNJ提取率的影響
[0049]在浸提時間為2.0h、、pH值為7、液料比為20ml提溶媒/g桑葉粗粉、溫度為80 (研究較優(yōu)的乙醇濃度，分別選取乙醇體積濃度為30%，40%，50%，60%和70%。
[0050]從圖5可以看出，桑桑葉的1-DNJ質(zhì)量分數(shù)隨著乙醇濃度增加而逐漸增高，當乙醇濃度為60v / ￥%時，桑葉1-DNJ質(zhì)量分數(shù)逐漸平穩(wěn)，當乙醇濃度達到70v / ￥%時，桑葉1-DNJ提取率最高為0.1713%。因此，乙醇濃度為65~70v / ￥%較適宜。
[0051]3) pH值對桑葉1-DNJ提取率的影響
[0052]在浸提時間為2.0h、乙醇體積濃度為70%、液料比為20ml提溶媒/ g桑葉粗粉、溫度為80°C的條件研究較優(yōu)的pH值，分別選取pH值為1，2，3，4，5，6和7。
[0053]從圖6可以看出，桑葉的1-DNJ質(zhì)量分數(shù)隨著pH值降低而逐漸增高，當pH值為6時，桑葉1-DNJ質(zhì)量分數(shù)達到最高為0.1598% ;但隨著pH值的降低，1-DNJ含量反而減少。因此，pH值為6較適宜。
[0054]4)液料比對桑葉1-DNJ提取率的影響
[0055]在浸提時間為2.0h、pH值為7、乙醇體積濃度為70%、溫度為80°C的條件研究較優(yōu)的液料比，分別選取液料比為10，15，20，25和30ml提取溶媒/g桑葉粗粉。
[0056]從圖7可以看出，桑葉的1-DNJ質(zhì)量分數(shù)隨著液料比升高而逐漸增高，當液料比為25即25mL提取溶媒/ g桑葉粗粉時，桑葉1-DNJ質(zhì)量分數(shù)達到最高為0.1600%;但隨著液料比的升高，1-DNJ含量反而減少。因此，液料比為25較適宜，但液料比對桑葉1-DNJ提取效果的影響不顯著。
[0057]三、響應面法優(yōu)化桑葉中1-DNJ的提取工藝
[0058]根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對桑葉1-DNJ提取效果影響較顯著的3個因素，利用DesignExpert7.1.6軟件根據(jù)Box-Behnken設計原則設計試驗,并對所得數(shù)據(jù)進行分析。
[0059]I)響應面分析因素水平的選擇
[0060]根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,綜合單因素試驗結(jié)果,選取乙醇濃度、浸提時間和pH值3個因素，分別以A，B和C表示。而對桑葉1-DNJ提取效果影響不顯著的液料比，統(tǒng)一選擇提取效果較好的液料比25 (即25ml提取溶媒/ g桑葉粗粉)。以單因素試驗結(jié)果的最適條件作為中水平，即O水平，高水平與低水平選擇與中水平接近的數(shù)值，試驗因素水平設計見表1。
[0061]表1因素A(乙醇濃度，V / 0、8(浸提時間)和(:(?!1值)的值與相應水平
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)取體積濃度為40~70%的乙醇溶液并調(diào)節(jié)pH值為2~7作為提取溶媒，加入桑葉粗粉，混勻，使液料比為10~30，即10~30mL提取溶媒/g桑葉粗粉，在70~90°C條件下浸提1.5~3h，抽濾，分別得1-DNJ初步提取液和桑葉濾渣； 2)將桑葉濾渣按步驟I)重復浸提I~4次，將每次所得1-DNJ初步提取液混合； 3)將混合的1-DNJ初步提取液進行減壓濃縮，離心，收集上清液，抽濾，收集濾液； 4)再將濾液用超純水稀釋至體積為提取溶媒的0.03~0.1倍，再經(jīng)純化，減壓濃縮，即得桑葉1-DNJ提取液。
2.—種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:通過響應面法優(yōu)化后，包括以 下步驟: 1)取體積濃度為66.5%的乙醇溶液并調(diào)節(jié)pH值為6.7作為提取溶媒，加入桑葉粗粉，混勻，使液料比為25，即25mL提取溶媒/g桑葉粗粉，在80°C條件下浸提2.7h，抽濾，分別得1-DNJ初步提取液和桑葉濾渣； 2)將桑葉濾渣按步驟I)重復浸提I次，將2次所得1-DNJ初步提取液混合； 3)將混合的1-DNJ初步提取液進行減壓濃縮，離心，收集上清液，抽濾，收集濾液； 4)再將濾液用超純水稀釋至體積為提取溶媒的0.04倍，再經(jīng)純化，減壓濃縮，即得桑葉1-DNJ提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:所述調(diào)節(jié)pH用到的調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硫酸和醋酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:所述離心為:4500~5500rpm離心13~18 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:所述純化的具體過程為:將溶液用732H型陽離子交換樹脂純化富集，除去中性及酸性成分，去離子水清洗離子交換柱，洗至流出液至無色后，用體積比為7:3的氨水和乙醇混合液開始洗脫，收集洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于:在所述的響應面法優(yōu)化過程中，設置乙醇濃度、PH值、浸提時間3個變量，并利用DesignExpert7.1.6軟件根據(jù)Box-Behnken設計原則進行優(yōu)化。
【文檔編號】C07D211/46GK103755623SQ201410004154
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】蘇楠, 吳新榮 申請人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院