載脂蛋白b抗血清的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種載脂蛋白B抗血清的制備方法，其技術(shù)方案要點(diǎn)是：1）將血清通過多陰離子化合物和二價(jià)金屬離子處理獲得低密度脂蛋白；2）將低密度脂蛋白中的雜蛋白除去，使其凈含載脂蛋白B；3）將其作為抗原對(duì)免疫動(dòng)物進(jìn)行免疫，該發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于1）用多陰離子和二價(jià)金屬離子制備濃縮的LDL粗品，使后續(xù)的超速離心次數(shù)和時(shí)間大大節(jié)?。?0倍），為大批量提取ApoB提供了條件，2）合理提高抗原劑量免疫動(dòng)物，可縮短抗血清的制備時(shí)間，只須傳統(tǒng)方法的二分之一，而且免疫的效價(jià)和成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
【專利說明】載脂蛋白B抗血清的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種載脂蛋白B抗血清的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]載脂蛋白B (ApoB)是人血清中低密度脂蛋白(LDL)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占LDL蛋白質(zhì)含量的97%，其含量可反應(yīng)LDL水平，血清中ApoB增高是心腦血管病的危險(xiǎn)因素。臨床上ApoB測(cè)定常作為心腦血管病的風(fēng)險(xiǎn)度估計(jì)。所有ApoB的免疫測(cè)定技術(shù)均需用ApoB抗血清，目前國際和國內(nèi)通用的ApoB測(cè)定試劑盒均采用免疫比池法(Immunoturbidimetricassay, ITA)，因其快速、準(zhǔn)確、精密并適用于各種類型的自動(dòng)生化分析儀，特別適用大批量標(biāo)本的測(cè)定。為了滿足臨床檢驗(yàn)需要，大批量制備高純度ApoB抗血清顯得非常重要。 [0003]傳統(tǒng)制備載脂蛋白B抗血清是通過將采集的人的外周血液，直接用人的血清通過超速離心，將血清中加入半飽和硫酸銨，半飽和硫酸銨吸引溶液中在蛋白質(zhì)表面不具有極性區(qū)域中的水分子，使水無法有效隔離蛋白質(zhì)的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間相互吸弓丨，從而將其中的蛋白沉淀，然后取下層沉淀，然后通過調(diào)節(jié)PH使沉淀下來的蛋白質(zhì)復(fù)溶，然后將復(fù)溶的蛋白質(zhì)進(jìn)行上柱層析，將其層析物分部收集、濃縮，通過冷凍干燥劑進(jìn)行冷凍干燥，并將其放置在零下80°C的條件下保存，然后將載脂蛋白B作為抗原，每次以3mg/每只免疫動(dòng)物，對(duì)免疫動(dòng)物進(jìn)行免疫，獲得載脂蛋白B抗血清。
[0004]傳統(tǒng)方法制備載脂蛋白B直接從人的外周血液直接進(jìn)行離心，離心次數(shù)多，且耗時(shí)長(zhǎng)，而且用半飽和硫酸氨將蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀，蛋白質(zhì)的復(fù)溶困難，要求高，免疫動(dòng)物時(shí)免疫效價(jià)低，成功率小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種載脂蛋白B抗血清的制備方法，該制備方法的優(yōu)點(diǎn)有:
1)用多陰離子和二價(jià)金屬離子制備濃縮的LDL粗品，使后續(xù)的超速離心次數(shù)和時(shí)間大大節(jié)省(20倍)，為大批量提取ApoB提供了條件；
2)合理提高抗原劑量免疫動(dòng)物，可縮短抗血清的制備時(shí)間，只須傳統(tǒng)方法的二分之一，而且免疫的效價(jià)和成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的載脂蛋白B抗血清的制備方法包括如下步驟:
1)血清的預(yù)處理:將用于制備載脂蛋白B的血清通過濃度為6%-22%的多陰離子化合物和濃度為2-8mol/L的二價(jià)金屬離子處理后獲得低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白；
2)凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取:將獲得的低密度脂蛋白依次經(jīng)過生理鹽水和0.5-1.lmol/L的草酸鉀處理，離心過后取上層液進(jìn)行透析獲得低密度脂蛋白粗品，對(duì)低密度脂蛋白粗品用密度調(diào)節(jié)試劑進(jìn)行密度調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)完成后進(jìn)行超速離心，再通過凝膠柱層析獲得凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白；
3)載脂蛋白B抗血清的制備:將載脂蛋白B作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫反應(yīng)，制備載脂蛋白B抗血清。
[0007]通過采用上述方案，先用較低濃度的多陰離子化合物和二價(jià)金屬離子沉淀血清中的低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白，離心后將沉淀物用生理鹽水溶解，接著再用草酸鉀沉淀多陰離子，離心后上層液透析后即為L(zhǎng)DL粗品(其濃度是血清中LDL含量的20倍)，然后經(jīng)超速離心，得到凈含ApoB的LDL組份，這樣一次超速離心提純的LDL量相當(dāng)于直接從血清中分離LDL量的20倍，大大節(jié)約了超速離心的次數(shù)和時(shí)間。
[0008]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，在所述2)步驟中，在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，所述密度調(diào)節(jié)試劑為溴化鉀，所述低密度脂蛋白調(diào)節(jié)后的密度范圍為
1.03-1.05g/cm3。
[0009]通過采用上述方案，LDL的密度范圍為1.003-1.063，密度較低的LDL顆粒含ApoC，而密度較高的顆粒含ApoE.故取d =1.030-1.050密度范圍，凈含ΑροΒ，大大提升了 ApoB的純度。
[0010]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，在所述2 )步驟中，在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，所述超速離心的轉(zhuǎn)速為40000-50000轉(zhuǎn)/分，溫度為8°C。
[0011]通過采用上述方案，將離心的轉(zhuǎn)速設(shè)置為40000-50000轉(zhuǎn)/分，溫度為8°C，能夠使LDL與雜蛋白分離充分，將溫度恒定為8°C也能夠避免在離心時(shí)LDL發(fā)生沉淀。
[0012]本發(fā)明的進(jìn)一步 設(shè)置為，所述超速離心的次數(shù)為兩次，所述低密度脂蛋白粗品在離心前均需通過溴化鉀調(diào)節(jié)密度。
[0013]通過采用上述方案，采用溴化鉀進(jìn)行密度的調(diào)節(jié)，不僅用量便于控制，使密度調(diào)節(jié)的更加精確，同時(shí)溴化鉀也便于除去雜質(zhì)離子，避免對(duì)后續(xù)制備產(chǎn)生影響。
[0014]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，所述血清中多陰離子化合物、二價(jià)金屬離子和草酸鉀殘留的濃度依次分別為6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
[0015]通過采用上述方案，通過草酸鉀與多陰離子化合物和二價(jià)金屬離子反應(yīng)，將三者的濃度控制到多陰離子化合物6%、二價(jià)金屬離子0.3mol/L和草酸鉀0.03mol/L，可以避免引入的三種試劑對(duì)制備造成影響。
[0016]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，所述低密度脂蛋白在離心完成后可通過添加防腐劑和海藻糖低溫保存。
[0017]通過采用上述方案，將低密度脂蛋白在離心完成后可通過添加防腐劑低溫保存，既避免了 ApoB在進(jìn)行免疫之前發(fā)生變質(zhì)，同時(shí)也達(dá)到一次提純多次免疫動(dòng)物的目的。
[0018]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，所述低溫保存的溫度為零下4°C至零下10°C。
[0019]通過采用上述方案，將冰凍保存的溫度設(shè)置為零下4°C至零下10°C，能夠保證ApoB的抗原性不會(huì)變化，能夠?qū)poB進(jìn)行較長(zhǎng)期保存。
[0020]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，在所述2)步驟中，在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，采用的凝膠柱層析的凝膠為瓊脂糖4B凝膠柱，收集主峰層析的物質(zhì)即為凈含載脂蛋白B抗原的低密度脂蛋白。
[0021]通過采用上述方案，將瓊脂糖4B凝膠作為層析時(shí)使用的凝膠柱，能夠使主峰當(dāng)中析出的物質(zhì)均為凈含ApoB的LDL，避免對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響。
[0022]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，在所述3)步驟中，在載脂蛋白B抗血清的制備的過程中，所述作用在免疫動(dòng)物上的凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白，其密度選取為1.03-1.05g/cm、用量為每次5-9mg/每只免疫動(dòng)物。
[0023]通過采用上述方案，通過采用上述方案，用在免疫動(dòng)物上的ApoB為每次5-9/mg每只免疫動(dòng)物，其密度選取為1.03-1.05g/cm,在免疫動(dòng)物時(shí)只需要免疫2次，大多數(shù)綿羊的抗體效價(jià)即可達(dá)到要求，剩下的少數(shù)綿羊再追加免疫注射一次，抗體效價(jià)即可達(dá)到要求。不但免疫時(shí)間上只是傳統(tǒng)方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比傳統(tǒng)方法提高。
[0024]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為，所述用于制備載脂蛋白B的血清均通過乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗體以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果須呈陰性。
[0025]通過采用上述方案，將制備ApoB的血清通過病毒檢測(cè)能夠保證本發(fā)明提供的載脂蛋白B抗血清的制備方法所制備出的ApoB抗血清無毒無害，在進(jìn)行ApoB測(cè)定時(shí)不會(huì)對(duì)被測(cè)定者造成損害，提高了生物安全性。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明的制備步驟具體可分為:1)血清的預(yù)處理；2)凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提?。?)載脂蛋白B抗血清的制備。
[0027]【具體實(shí)施方式】如下:
實(shí)施例一:1、LDL粗品的提取:收集混合人血清5L，[經(jīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加10%多陰離子25ml和2M氯化鈣250ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為L(zhǎng)DL和VLDL(可用HDL粗品的提取時(shí)第一步的沉淀物)，收集沉淀物加0.5M草酸鉀200ml，使多陰離子沉淀并分離LDL+VLDL，離心后上層液用生理鹽水透析，備用。
[0028]2、LDL組份的進(jìn)一步提純:用KBr調(diào)節(jié)透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(jī)，專用離心管(30ml/每管)，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時(shí)，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.050，按上述離心條件離心，收集離心管上層液，用生理鹽水透析后，加防腐劑和海藻糖，4°C冰箱保存，至少可穩(wěn)定一年，此抗原量至少可免疫100只綿羊，臨用時(shí)按需用Sepharose 4B柱層析，收集主峰，即為凈含ApoB抗原的LDL組份，用島津-UV2550型分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。
[0029] 3、抗ApoB血清的制備:將凈含ApoB抗原的LDL組份，按5mg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點(diǎn)皮下注射，二周后，用同樣劑量的抗原，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部(不要在原部位)多點(diǎn)皮下注射，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml,分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對(duì)人血清作雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1:512或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時(shí)分離出抗血清，LDL的分子量較大為512000D，抗原牲強(qiáng)，除極個(gè)別羊外，二次免疫都能達(dá)到要求，個(gè)別未達(dá)到要求者以同樣劑量作第三次免疫，將所有的血清混合后作為一個(gè)批次，用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只和提純的LDL和人血清產(chǎn)生沉淀線，與ApoAl、ApoA I1、ApoC、ApoE、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達(dá)到要求。
[0030]實(shí)施例二:1、LDL粗品的提取:收集混合人血清5L，[經(jīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加8%多陰離子50ml和2M氯化鈣500ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為L(zhǎng)DL和VLDL (可用HDL粗品的提取時(shí)第一步的沉淀物)，收集沉淀物加0.5M草酸鉀400ml，使多陰離子沉淀并分離LDL+VLDL，離心后上層液用生理鹽水透析，備用。
[0031 ] 2、LDL組份的進(jìn)一步提純:用KBr調(diào)節(jié)透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(jī)，專用離心管(30ml/每管)，45000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時(shí)，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.050，按上述離心條件離心，收集離心管上層液，用生理鹽水透析后，加防腐劑和海藻糖，4°C冰箱保存，至少可穩(wěn)定一年，此抗原量至少可免疫100只綿羊，臨用時(shí)按需用Sepharose 4B柱層析，收集主峰，即為凈含ApoB抗原的LDL組份，用島津-UV2550型分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。
[0032]3、抗ApoB血清的制備:將凈含ApoB抗原的LDL組份，按5mg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點(diǎn)皮下注射，二周后，用同樣劑量的抗原，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部(不要在原部位)多點(diǎn)皮下注射，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml,分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對(duì)人血清作雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1:512或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時(shí)分離出抗血清，LDL的分子量較大為512000D，抗原牲強(qiáng)，除極個(gè)別羊外，二次免疫都能達(dá)到要求，個(gè)別未達(dá)到要求者以同樣劑量作第三次免疫，將所有的血清混合后作為一個(gè)批次，用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只和提純的LDL和人血清產(chǎn)生沉淀線，與ApoAl、ApoA I1、ApoC、ApoE、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達(dá)到要求。 [0033]實(shí)施例三:1、LDL粗品的提取:收集混合人血清5L，[經(jīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加12%多陰離子25ml和2.4M氯化鈣250ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為L(zhǎng)DL和VLDL(可用HDL粗品的提取時(shí)第一步的沉淀物)，收集沉淀物加0.6M草酸鉀200ml，使多陰離子沉淀并分離LDL+VLDL，離心后上層液用生理鹽水透析，備用。
[0034]2、LDL組份的進(jìn)一步提純:用KBr調(diào)節(jié)透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(jī)，專用離心管(30ml/每管)，45000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時(shí)，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.050，按上述離心條件離心，收集離心管上層液，用生理鹽水透析后，加防腐劑和海藻糖，4°C冰箱保存，至少可穩(wěn)定一年，此抗原量至少可免疫100只綿羊，臨用時(shí)按需用Sepharose 4B柱層析，收集主峰，即為凈含ApoB抗原的LDL組份，用島津-UV2550型分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。
[0035]3、抗ApoB血清的制備:將凈含ApoB抗原的LDL組份，按7mg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點(diǎn)皮下注射，二周后，用同樣劑量的抗原，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部(不要在原部位)多點(diǎn)皮下注射，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml,分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對(duì)人血清作雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1:512或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時(shí)分離出抗血清，LDL的分子量較大為512000D，抗原牲強(qiáng)，除極個(gè)別羊外，二次免疫都能達(dá)到要求，個(gè)別未達(dá)到要求者以同樣劑量作第三次免疫，將所有的血清混合后作為一個(gè)批次，用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只和提純的LDL和人血清產(chǎn)生沉淀線，與ApoAl、ApoA I1、ApoC、ApoE、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達(dá)到要求。
[0036]實(shí)施例四:1、LDL粗品的提取:收集混合人血清5L，[經(jīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加18%多陰離子25ml和3.6M氯化鈣250ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為L(zhǎng)DL和VLDL(可用HDL粗品的提取時(shí)第一步的沉淀物)，收集沉淀物加0.9M草酸鉀200ml，使多陰離子沉淀并分離LDL+VLDL，離心后上層液用生理鹽水透析，備用。
[0037]2、LDL組份的進(jìn)一步提純:用KBr調(diào)節(jié)透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(jī)，專用離心管(30ml/每管)，47000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時(shí)，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.050，按上述離心條件離心，收集離心管上層液，用生理鹽水透析后，加防腐劑和海藻糖，4°C冰箱保存，至少可穩(wěn)定一年，此抗原量至少可免疫100只綿羊，臨用時(shí)按需用Sepharose 4B柱層析，收集主峰，即為凈含ApoB抗原的LDL組份，用島津-UV2550型分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。
[0038]3、抗ApoB 血清的制備:將凈含ApoB抗原的LDL組份，按7mg/每只羊，用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點(diǎn)皮下注射，二周后，用同樣劑量的抗原，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部(不要在原部位)多點(diǎn)皮下注射，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml,分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對(duì)人血清作雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1:512或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時(shí)分離出抗血清，LDL的分子量較大為512000D，抗原牲強(qiáng)，除極個(gè)別羊外，二次免疫都能達(dá)到要求，個(gè)別未達(dá)到要求者以同樣劑量作第三次免疫，將所有的血清混合后作為一個(gè)批次，用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只和提純的LDL和人血清產(chǎn)生沉淀線，與ApoAl、ApoA I1、ApoC、ApoE、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達(dá)到要求。
[0039]實(shí)施例五:1、LDL粗品的提取:收集混合人血清5L，[經(jīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗體(HCV抗體)以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體(HIV抗體)均為陰性]，加20%多陰離子25ml和4M氯化鈣250ml，混勻，置30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，沉淀物為L(zhǎng)DL和VLDL (可用HDL粗品的提取時(shí)第一步的沉淀物)，收集沉淀物加IM草酸鉀200ml，使多陰離子沉淀并分離LDL+VLDL，離心后上層液用生理鹽水透析，備用。
[0040]2、LDL組份的進(jìn)一步提純:用KBr調(diào)節(jié)透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到
1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制備型超速離心機(jī)，專用離心管(30ml/每管)，50000轉(zhuǎn)/分，8°C，離心20小時(shí)，收集離心管下層液，再用KBr調(diào)節(jié)密度到1.050，按上述離心條件離心，收集離心管上層液，用生理鹽水透析后，加防腐劑和海藻糖，4°C冰箱保存，至少可穩(wěn)定一年，此抗原量至少可免疫100只綿羊，臨用時(shí)按需用Sepharose 4B柱層析，收集主峰，即為凈含ApoB抗原的LDL組份，用島津-UV2550型分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。[0041]3、抗ApoB血清的制備:將凈含ApoB抗原的LDL組份,按8mg/每只羊,用福氏完全佐劑乳化，在綿羊的背部多點(diǎn)皮下注射，二周后，用同樣劑量的抗原，用福氏不完全佐劑乳化，再次在綿羊的背部(不要在原部位)多點(diǎn)皮下注射，第二次注射后十天，頸靜脈抽血約5ml,分離血清，以倍比稀釋法將此抗血清稀釋后，對(duì)人血清作雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1:512或以上者到第十四天作頸靜脈插管放血，并及時(shí)分離出抗血清，LDL的分子量較大為512000D，抗原牲強(qiáng)，除極個(gè)別羊外，二次免疫都能達(dá)到要求，個(gè)別未達(dá)到要求者以同樣劑量作第三次免疫，將所有的血清混合后作為一個(gè)批次，用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果應(yīng)只和提純的LDL和人血清產(chǎn)生沉淀線，與ApoAl、ApoA I1、ApoC、ApoE、人白蛋白不產(chǎn)生沉淀線，純度達(dá)到要求。
[0042] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)血清的預(yù)處理:將用于制備載脂蛋白B的血清通過濃度為6%-22%的多陰離子化合物和濃度為2-8mol/L的二價(jià)金屬離子處理后獲得低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白； 2)凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取:將獲得的低密度脂蛋白依次經(jīng)過生理鹽水和0.5-1.lmol/L的草酸鉀處理，離心過后取上層液進(jìn)行透析獲得低密度脂蛋白粗品，對(duì)低密度脂蛋白粗品用密度調(diào)節(jié)試劑進(jìn)行密度調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)完成后進(jìn)行超速離心，再通過凝膠柱層析獲得凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白； 3)載脂蛋白B抗血清的制備:將載脂蛋白B作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫反應(yīng)，制備載脂蛋白B抗血清。
2.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:在所述2)步驟中，在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，所述密度調(diào)節(jié)試劑為溴化鉀，所述低密度脂蛋白調(diào)節(jié)后的密度范圍為1.03-1.05g/cm3。
3.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:所述血清中多陰離子化合物、二價(jià)金屬離子和草酸鉀殘留的濃度依次分別為6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，所述超速離心的轉(zhuǎn)速為40000-50000轉(zhuǎn)/分，溫度為8°C。
5.如權(quán)利要求4所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:所述超速離心的次數(shù)為兩次，所述低密度脂蛋白粗品在離心前均需通過溴化鉀調(diào)節(jié)密度。
6.如權(quán)利要求4所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:所述低密度脂蛋白在離心完成后可通過添加防腐劑和海藻糖低溫保存。
7.如權(quán)利要求6所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:所述低溫保存的溫度為零下4°C至零下10°C。
8.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:在凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取過程中，采用的凝膠柱層析的凝膠為瓊脂糖4B凝膠柱，收集主峰層析的物質(zhì)即為凈含載脂蛋白B抗原的低密度脂蛋白。
9.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:在載脂蛋白B抗血清的制備的過程中，所述作用在免疫動(dòng)物上的凈含載脂蛋白B的低密度脂蛋白，其密度選取為1.03-1.05g/cm、用量為每次5_9mg/每只免疫動(dòng)物。
10.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白B抗血清的制備方法，其特征在于:所述用于制備載脂蛋白B的血清均通過乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗體以及人類免疫缺陷病毒I型和II型抗體檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果須呈陰性。
【文檔編號(hào)】C07K16/06GK104017075SQ201410004058
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】楊昌國 申請(qǐng)人:寧波博泰生物技術(shù)有限公司