專利名稱：脂蛋白分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過將樣品中所含的脂蛋白顆粒分級成各個亞類來分析脂蛋白的方法，所述方法使得有可能進行數(shù)據(jù)分析以有效診斷各種疾病。

背景技術(shù)：
日本專利申請(公開)第9-15225 A號(1997)公開了通過凝膠過濾液相色譜對受試者樣品中所含的脂蛋白顆粒根據(jù)顆粒大小進行分類，然后對分類脂蛋白中所含的膽固醇或甘油三酯進行定量的方法，其中通過使所獲得的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理如高斯分布近似，將脂蛋白顆粒分級成乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
日本專利申請(公開)第2002-139501 A號公開了通過凝膠過濾液相色譜對受試者樣品中所含的脂蛋白顆粒根據(jù)顆粒大小進行分類，然后對分類脂蛋白中所含的膽固醇或甘油三酯進行定量的方法，其中脂蛋白顆粒被分類成20個亞類。
但是，以上專利文件2公開的分類方法只被應(yīng)用于使用特定的柱的情況，20個亞類的各自峰位置(即顆粒大小)未得到理論基礎(chǔ)的支持。例如，LDL的顆粒大小，當(dāng)使用GGE方法(聚丙烯酰胺密度梯度凝膠電泳)時測定為25.5nm截斷值，當(dāng)使用NMR方法時基于電子顯微鏡所觀察到的大小測定為約25.5nm，當(dāng)使用凝膠過濾FPLC方法時基于GGE方法所獲得的大小測定為25.5nm，當(dāng)使用凝膠過濾HPLC時基于乳膠小珠(latex bead)或球狀蛋白質(zhì)同樣測定為25.5nm。當(dāng)使用光散射方法時根據(jù)估測方法顆粒大小可不同。此外，如按平衡超速離心法測定分子量，則該顆粒大小可能又變成不同的值。因此，基于顆粒大小的脂蛋白亞類定義和在這些亞類之間對受試者樣品中所含各種脂蛋白的比較會導(dǎo)致混淆。
發(fā)明公開 鑒于上述情況，本發(fā)明人使得有可能基于在代謝疾病患者觀察到的峰位置進行多個樣品的各亞類之間的比較成為可能，所述患者的脂蛋白代謝表明VLDL、LDL和HDL的大小范圍窄，即使使用具有不同分離規(guī)格和分子大小范圍的不同凝膠過濾柱也是這樣。
本發(fā)明的脂蛋白分析方法包括通過液相色譜分離受試者樣品中所含的多種類別脂蛋白，然后檢測來自分離脂蛋白顆粒中所包括的成分的信號的步驟；和假定脂蛋白由從包括錨定峰(anchor peak)和額外必要峰(extra essential peak)的成分峰推測出的亞類組成，然后用上述檢測信號計算對應(yīng)于成分峰總和的近似曲線的步驟。
另外，分離脂蛋白顆粒中所包括的成分的實例包括膽固醇、甘油三酯、游離膽固醇、磷脂、載脂蛋白等。在本發(fā)明的脂蛋白分析方法中，近似曲線可基于來自至少一種成分的檢測信號來計算，如膽固醇、甘油三酯、游離膽固醇、磷脂、載脂蛋白等。
錨定峰是其位置經(jīng)實驗測定的峰。另一方面，額外必要峰是其位置和寬度用數(shù)學(xué)法確定的峰。假定LDL亞類的分布寬度與HDL的幾乎相同，然后確定額外必要峰的位置和寬度，以使其以幾乎相等的間隔位于各錨定峰之間。
成分峰的數(shù)量可以是但不具體限于13-20個。例如，當(dāng)使用能夠分離多種脂蛋白(從CM到HDL的脂蛋白都可分離)的TSKgelLipopropakXL柱作為液相色譜柱時，最多可建立20個成分峰。在使用分級范圍覆蓋VLDL到HDL(CM未覆蓋)的Pharmacia(或Amersham Biosciences)生產(chǎn)的Superose 6HR 10/30柱或SkylightBiotech Inc.生產(chǎn)的SkylightPak-LDL柱的情況下，可建立數(shù)量小于20個的成分峰。另外，當(dāng)例如使用TSK G3000SWXL柱時，可建立至少13個成分峰，以分析LDL和HDL亞類。
錨定峰的洗脫時間(顆粒大小)可定義為使用得自正常血脂中年男性人群的上述樣品獲得的譜圖(profile)中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的顆粒的平均洗脫時間。錨定峰的洗脫時間(顆粒大小)也可定義為使用得自脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低的病例的上述樣品所獲得的譜圖中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的顆粒的平均洗脫位置。另外，錨定峰的洗脫時間(顆粒大小)還可定義為使用得自膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白缺乏的病例的上述樣品獲得的譜圖中HDL大小的顆粒的平均洗脫位置。此外，錨定峰的洗脫時間(顆粒大小)亦可定義為使用得自具有ApoE2/2的III型高脂血癥的上述樣品獲得的譜圖中VLDL大小的顆粒的平均洗脫位置。
已基于得自膽固醇的檢測信號進行定義的成分峰，可用以計算關(guān)于得自膽固醇的譜圖的近似曲線及關(guān)于得自膽固醇之外成分(如甘油三酯、游離膽固醇、磷脂、載脂蛋白等)的譜圖的其它近似曲線。
本發(fā)明的內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的診斷方法包括制備由待診斷受試者收集的受試者樣品的步驟；通過液相色譜分離上述樣品中所含的多種類別脂蛋白的步驟；檢測來自分離脂蛋白顆粒中所包括的各成分的信號的步驟；假定脂蛋白由從包括錨定峰和額外必要峰的成分峰推測出的亞類組成，然后用上述檢測信號計算對應(yīng)于成分峰總和的近似曲線的步驟；和分析所述計算出的近似曲線的步驟。
內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的實例包括例如以缺血性心臟病為代表的動脈硬化疾病。也就是說，由于近來生活方式改變所伴隨的營養(yǎng)過度或低體力勞動導(dǎo)致脂肪積累和肥胖，因各種風(fēng)險因素的累加所致的以缺血性心臟病為代表的動脈硬化疾病的發(fā)生率已增加。通過造成胰島素抗性的遺傳易感性與獲得性因素如肥胖相結(jié)合引起胰島素抗性而產(chǎn)生這類疾病。重要的是將腹部內(nèi)內(nèi)臟脂肪積累認為是主要的上游原因。肥胖者及非肥胖者所引起的腹部內(nèi)內(nèi)臟脂肪積累密切地促成糖尿病、高血壓和冠狀動脈疾病(CAD)的發(fā)作。因此，內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的實例的實例包括糖尿病、高血壓、高脂血癥和冠狀動脈疾病。
在本發(fā)明的內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的診斷方法中，例如說，內(nèi)臟脂肪面積與VLDL的大、中或小亞類和與LDL的中、小或極小亞類中的膽固醇含量成正比，而內(nèi)臟脂肪面積與HDL的大或中亞類中的膽固醇含量成反比。換句話說，內(nèi)臟脂肪積累所致疾病通過VLDL的大、中或小亞類和LDL的中、小或極小亞類中的膽固醇含量的增加來診斷，和通過HDL的大或中亞類中的膽固醇含量的減少來診斷。
高水平的LDL膽固醇是重要的風(fēng)險因素之一。當(dāng)LDL膽固醇濃度正常時(LDL-C＜130mg/dL)，小和極小LDL亞類中的膽固醇濃度與內(nèi)臟脂肪面積成正比，而大LDL亞類中的膽固醇濃度與內(nèi)臟脂肪面積成反比。這意味著LDL中包括抗動脈粥樣硬化的LDL亞類，大LDL亞類起作用以抑制動脈硬化的發(fā)作。雖然大LDL亞類的成分峰被確定為額外必要峰，并被確定為VLDL和LDL之間的過渡成分，但該成分峰可最新判斷為具有本發(fā)明臨床意義的新亞類。換句話說，因內(nèi)臟脂肪積累所致的動脈硬化的發(fā)作可通過大LDL亞類的成分峰處的膽固醇含量來診斷。
另外，在冠狀動脈疾病中觀察到，小VLDL亞類的膽固醇濃度增加，小和極小LDL亞類的膽固醇濃度也增加，大HDL亞類的膽固醇濃度減少，因此可以通過測量小VLDL、小和極小LDL和大HDL亞類中的膽固醇濃度來診斷冠狀動脈疾病。
本發(fā)明的冠狀動脈疾病的診斷方法包括用本發(fā)明的脂蛋白分析方法分析獲自待診斷受試者的受試者樣品中所含的脂蛋白的步驟；和根據(jù)選自(I)-(V)的任一公式計算數(shù)值 (I)Vs+Ls-Hs； (II)Vs+Ls； (III)Ls； (IV)(Vs+Ls)/Hs；和 (V)Ls/Hs， 其中“Vs”表示小VLDL中的膽固醇含量；“Ls”代表小LDL和極小LDL中的膽固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的膽固醇含量。
在本發(fā)明的冠狀動脈疾病的診斷方法中，分析步驟還優(yōu)選包括將計算值與參考值相比較的步驟。
在冠狀動脈疾病中顯著增加的小VLDL亞類的成分峰是錨定峰，該峰由得自具有ApoE2/2的III型高脂血癥的VLDL大小確定，因此對應(yīng)于具有ApoE2/2的III型高脂血癥中增加的殘粒(remnant)，由此認識到本程序中同樣是冠狀動脈的重要風(fēng)險因素的殘?？蓮膶?yīng)于小VLDL亞類的成分峰來判斷。
附圖簡述

圖1是顯示脂蛋白分析儀的系統(tǒng)配置的圖，該分析儀定量受試者樣品的脂蛋白顆粒中所含的膽固醇和甘油三酯； 圖2是特性圖，顯示膽固醇色譜圖及甘油三酯色譜圖，橫軸表示洗脫時間(min.)，縱軸表示檢測值(mV)； 圖3是特性圖，顯示用兩根TSKgel LipopropalXL柱(Tosoh Corp.生產(chǎn))獲得的支持錨定峰定義的數(shù)據(jù)； 圖4是特性圖，顯示用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生產(chǎn))獲得的支持錨定峰定義的數(shù)據(jù)； 圖5是特性圖，顯示用SkylightPak-LDL柱(Skylight Biotech Inc生產(chǎn))獲得的支持錨定峰定義的數(shù)據(jù)； 圖6(a)是譜圖，顯示用獲自健康女性的血清樣品獲得的膽固醇含量；6(b)是譜圖，顯示用獲自脂蛋白脂肪酶缺乏患者的血清樣品獲得的膽固醇含量； 圖7(a)是散點圖，顯示高LDL-C組(空心圓圈)和低LDL-C組(實心圓圈)的內(nèi)臟脂肪面積和大LDL-C濃度之間的關(guān)系，圖7(b)是散點圖，顯示高LDL-C組(空心圓圈)和低LDL-C組(實心圓圈)的內(nèi)臟脂肪面積和小LDL-C濃度之間的關(guān)系，圖7(c)是散點圖，顯示高LDL-C組(空心圓圈)和低LDL-C組(實心圓圈)的內(nèi)臟脂肪面積和極小LDL-C濃度之間的關(guān)系； 圖8(a)是特性圖，顯示用Superose 6HR 10/30柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的膽固醇分析的結(jié)果； 圖8(b)是特性圖，顯示用Superose 6HR 10/30柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的甘油三酯分析的結(jié)果； 圖9(a)是特性圖，顯示用兩根TSKgel LipopropakXL柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的膽固醇分析的結(jié)果； 圖9(b)是特性圖顯示用兩根TSKgel LipopropakXL柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的甘油三酯分析的結(jié)果； 圖10(a)是特性圖，顯示用SkylightPak-LDL柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的膽固醇分析的結(jié)果； 圖10(b)是特性圖，顯示用SkylightPak-LDL柱對獲自健康人受試者的混合血清進行的甘油三酯分析的結(jié)果； 圖11是特性圖，顯示G7至G20各峰處的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用Superose 6HR 10/30柱對表8所示59名受試者所得的圖8所示結(jié)果； 圖12是特性圖，顯示G7至G20各峰處的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用TSKgel LipopropakXL柱對表8所示59名受試者所得的圖9所示結(jié)果； 圖13是特性圖，顯示對于G7至G13(對應(yīng)于從小VLDL亞類到LDL亞類的范圍)各成分峰處的膽固醇含量Superose 6HR 10/30和TSKgel LipopropakXL柱之間比較的結(jié)果，其基于對表8所示59名受試者所得的圖11和12所示結(jié)果； 圖14是特性圖，顯示對于G14至G20(對應(yīng)于HDL亞類)各成分峰處的膽固醇含量Superose 6HR 10/30和TSKgel LipopropakXL柱之間比較的結(jié)果，其基于對表8所示59名受試者所得的圖11和12所示結(jié)果； 圖15是特性圖，顯示G6至G20各峰處的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用TSKgel LipopropakX柱對表9所示44名受試者所得的圖9所示結(jié)果； 圖16是特性圖，顯示G6至G20各峰處的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用SkylightPak-LDL柱對表9所示44名受試者所得的圖10所示結(jié)果； 圖17是特性圖，顯示對于G6至G13(對應(yīng)于從中VLDL亞類到LDL亞類的范圍)各成分峰處的膽固醇含量TSKgel LipopropakXL和SkylightPak-LDL柱之間比較的結(jié)果，其基于對表9所示44名受試者所得的圖15和16所示結(jié)果； 圖18是特性圖，顯示對于G14至G20(對應(yīng)于HDL亞類)各成分峰處的膽固醇含量TSKgel LipopropakXL和SkylightPak-LDL柱之間比較的結(jié)果，其基于對表9所示44名受試者所得的圖15和16所示結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳方式 現(xiàn)參考附圖詳細說明本發(fā)明。
如圖1所示，應(yīng)用本發(fā)明分析方法和分析程序的脂蛋白分析儀包括例如，用以分離受試者樣品中所含脂蛋白成分的柱1、用以將柱1洗脫出的含脂蛋白顆粒的洗脫緩沖液分流成2部分的分流器2、通過分流器2分流的第一通道3和第二通道4、置于第一通道3上的膽固醇(下文稱“TC”)反應(yīng)部件5、置于第二通道4上的甘油三酯(下文稱“TG”)反應(yīng)部件6、位于第一通道3上的TC反應(yīng)部件5下游的TC檢測部件7、位于第二通道4上的TG反應(yīng)部件6下游的TG檢測部件8、起到控制本系統(tǒng)運行的作用且來自TC檢測部件7和TG檢測部件8的信號輸入其中的系統(tǒng)控制器9和連接到系統(tǒng)控制器9的運算器10。本文所用的受試者樣品并沒有具體限制，指獲自生物體的樣品如血清、血漿、脊髓液、組織液或淋巴液及含衍自細胞培養(yǎng)物的分泌性顆粒的樣品。
脂蛋白分析儀還包括用以將血清樣品供應(yīng)到柱1的取樣器11、用以將洗脫緩沖液供應(yīng)到柱1的第一泵12和用以給待通過第一泵12供應(yīng)給柱1的洗脫緩沖液除去氣體的除氣器13。
雖然用于本脂蛋白分析儀的柱1沒有具體限制，但特別優(yōu)選使用充填凝膠過濾用填料的柱。具體的說，柱1的一個實例可以是充填平均微孔大小為800-1200埃的填料的柱。當(dāng)使用平均微孔大小低于800埃的填料時，難以使顆粒大小較大的脂蛋白顆粒如CM或VLDL滲透到微孔中。另一方面，當(dāng)使用平均微孔大小大于1200埃的填料時，填料分離顆粒大小較小的脂蛋白顆粒如LDL或HDL的能力降低。因此，優(yōu)選使用上述平均微孔大小為800-1200埃的填料。其中，平均微孔大小為900-1100埃的填料其分離能力優(yōu)越，最終使得脂蛋白的分析可以以高精密度進行。
另外，需要對填料加以選擇，使其具有充分的機械強度以經(jīng)受其在液相色譜中的應(yīng)用。這種填料的實例包括例如硅膠、聚乙烯醇、聚羥基甲基丙烯酸酯和其它基于親水性樹脂的材料(例如Tosoh Corp.生產(chǎn)的TSKgel Lipopropak(商品名))。
洗脫緩沖液的實例包括磷酸鹽緩沖溶液，tris緩沖溶液，bis-tris緩沖溶液等，不過并不具體限于它們，只要溶液能分離脂蛋白顆粒即可。緩沖溶液的濃度優(yōu)選在20-200mM的范圍，更優(yōu)選在50-100mM的范圍，因為緩沖溶液濃度低于20mM不足以提供合適的緩沖能力，濃度超過200mM可能會抑制下文描述的酶試劑和TC或TG之間的反應(yīng)。緩沖溶液的pH值為5-9，更優(yōu)選7-8，因為pH值小于5或大于9可能會抑制下文描述的酶試劑的反應(yīng)。但是，只要不用酶來進行TC和/或TG的測量，pH值就不限于如此。
TC反應(yīng)部件5通過第二泵15連接到裝有試劑的TC試劑罐14，該試劑用于定量柱1洗脫出的含脂蛋白顆粒的洗脫緩沖液中所包括的TC。用于定量TC的試劑的實例包括但不具體限于例如通過將酶如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或過氧化物酶與染料如N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀基乙二胺、4-氨基安替比林或N-乙基-N-(3-磺基丙基)間茴香胺組合而獲得的酶-染料試劑?？蓛?yōu)選使用的這種試劑的實例是市售的測定試劑(determiner)L TCII(Kyowa Medex Co.，Ltd.)和typeL CHO·H(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)。這些試劑與TC反應(yīng)而提供能發(fā)射或吸收熒光的反應(yīng)產(chǎn)物，熒光可通過光譜儀如熒光檢測器或紫外-可見光檢測器來檢測。
TG反應(yīng)部件6通過第二泵15連接到裝有試劑的TG試劑罐16，該試劑用于定量柱1洗脫出的含脂蛋白顆粒的洗脫緩沖液中所包括的TG。用于定量TG的試劑的實例包括但不具體限于例如通過將酶如抗壞血酸氧化酶、甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶、脂蛋白脂肪酶和過氧化物酶與染料如醌基發(fā)色染料組合而獲得的酶-染料試劑。醌基發(fā)色染料的實例包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀基乙二胺或N-乙基-N-(3-磺基丙基)間茴香胺與4-反氨基吡啶的氧化縮合物?？蓛?yōu)選使用的這種試劑的實例是市售的測定試劑L TGII(Kyowa MedexCo.，Ltd.)和type L TG·H(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)。
提供具有反應(yīng)線圈的TC反應(yīng)部件5和TG反應(yīng)部件6，以在上述試劑與TC或TG的反應(yīng)過程控制溫度。TC反應(yīng)部件5或TG反應(yīng)部件6中上述試劑與TC或TG的反應(yīng)溫度為35-50℃，優(yōu)選45-50℃，因為低于35℃的反應(yīng)溫度可能不足以進行反應(yīng)，而超過50℃的反應(yīng)溫度可能會導(dǎo)致酶在其反應(yīng)過程中變性。
提供具有例如紫外-可見光檢測器的TC檢測部件7，以檢測TC反應(yīng)部件5中TC與試劑之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。提供具有例如紫外-可見光檢測器的TC檢測部件8，以檢測TG反應(yīng)部件6中TG與試劑之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。例如，當(dāng)醌基發(fā)色染料用作上述試劑時，紫外-可見光檢測器的測量波長可為540-560nm。
TC檢測部件7和TG檢測部件8的輸出信號輸入其中的系統(tǒng)控制器9，具有輸出TC色譜圖和TG色譜圖作為結(jié)果的功能。例如如圖2所示，系統(tǒng)控制器9的色譜圖輸出能顯示TC色譜圖和疊加于其上的TG色譜圖，其中橫軸表示洗脫時間(min.)、縱軸表示檢測值(mV)。
作為運算器10，例如可以使用安裝了下述分析程序的計算機。運算器10連接到系統(tǒng)控制器9，具有以下功能用分析程序?qū)ο到y(tǒng)控制器9輸出的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理，將受試者樣品中所含的脂蛋白顆粒分離成20個成分峰，計算TC和TG的數(shù)量。運算器10還可通過信息通訊線路網(wǎng)絡(luò)如因特網(wǎng)、局域網(wǎng)或內(nèi)聯(lián)網(wǎng)連接到系統(tǒng)控制器9。
根據(jù)上述脂蛋白分析儀，各種脂蛋白首先通過柱1依其顆粒大小被分類，然后柱1洗脫出的洗脫緩沖液中所含的TC和TG被定量。因此，脂蛋白分析儀能夠依靠柱1的分辨力為每一脂蛋白亞類定量TC和TG。
脂蛋白根據(jù)諸如顆粒大小、水合密度、電泳度等性質(zhì)上的差異被分類成多種類別。本分析儀按照下述分析程序?qū)⒀鍢悠分兴ǖ闹鞍最w粒分離成20個成分峰。
現(xiàn)描述分析程序。分析程序遵循包括步驟1和步驟2的流程控制運算器10。
步驟1是首先將系統(tǒng)控制器9輸出的色譜圖作為輸入信號通過運算器10的輸入裝置輸入。也就是說，分析程序在步驟1將計算機執(zhí)行為檢測裝置，輸入系統(tǒng)控制器9輸出的色譜圖作為輸入信號。
現(xiàn)詳細描述步驟1。首先，圖2所示的TC色譜圖和TG色譜圖通過運算器10的輸入裝置輸入，然后所述色譜圖和/或支持所述色譜圖的數(shù)值數(shù)據(jù)被儲存在運算器10的固有存儲器中或被記錄在運算器10可記錄的記錄介質(zhì)中。
接著，步驟2是對輸入的色譜圖進行數(shù)據(jù)處理，然后將所獲得的結(jié)果分類成20個成分峰，以計算高斯接近曲線。也就是說，分析程序在步驟2中將計算機執(zhí)行為數(shù)據(jù)處理裝置，用以計算高斯接近曲線。數(shù)據(jù)處理裝置使步驟1輸入的色譜圖得以分離成20個獨立的峰。在以下描述中，20個獨立的峰按大小降低的順序稱為G1至G20。G1和G2是對應(yīng)于乳糜微粒(CM)的成分峰，G3-G7是對應(yīng)于極低密度(比重)脂蛋白(VLDL)的成分峰，G8-G13是對應(yīng)于低密度脂蛋白(LDL)的成分峰，G14-G20是對應(yīng)于高密度(HDL)的成分峰。在對應(yīng)于VLDL的成分峰當(dāng)中，G3-G5表示大VLDL，G6表示中VLDL，G7表示小VLDL。在對應(yīng)于LDL的成分峰當(dāng)中，G8表示大LDL，G9表示中LDL，G10表示小LDL，G11-G13表示極小LDL。在對應(yīng)于HDL的成分峰當(dāng)中，G14和G15表示極大HDL，G16表示大HDL，G17表示中HDL，G18表示小HDL，G19和G20表示極小HDL。
步驟2的數(shù)據(jù)處理裝置是將步驟1輸入的色譜圖或數(shù)值數(shù)據(jù)分離或分類成20個成分峰，然后讓運算器10進行包括G1-G20的高斯近似曲線的計算。20個成分峰是按脂蛋白顆粒的大小分離的。
20個成分峰各自的峰位置如下描述進行定義。對于包括G1-G20的各20個峰，首先確定標(biāo)準(zhǔn)峰(錨定峰)的峰位置(洗脫時間)，然后確定錨定峰之外的峰(額外必要峰)的峰位置。具體舉例說，將G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18定義為錨定峰，G1-G4、G8、G11-G14、G16、G19和G20定義為額外必要峰。圖3顯示支持G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18作為錨定峰的定義的數(shù)據(jù)實例。
由于正常血脂的中年男性(年齡30歲至40歲)人群中VLDL大小、LDL大小和HDL大小的顆粒分別分布在一定的范圍，它們各自的洗脫位置確定為在這些錨定峰當(dāng)中的G6、G9和G17(見圖3(a))。具體的說，從采集自多個正常血脂的中年男性(年齡30歲至40歲)的血清樣品獲得圖2所示的TC色譜圖和TG色譜圖。在所獲得的色譜圖上，對應(yīng)于主類別VLDL、LDL和HDL的峰按這個順序出現(xiàn)。計算出從多個正常血脂的中年男性獲得的色譜圖上各自對應(yīng)于VLDL、LDL和HDL的峰位置的平均值，分別將平均VLDL大小、平均LDL大小和平均HDL大小定義為G6、G9和G17的洗脫位置。
在脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低的情況下，富TG脂蛋白中的甘油三酯不被分解，大小仍較大的VLDL保持在血液中。因此，脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低情況下的VLDL大小的顆粒比正常血脂男性的顯著大得多，并分布在一定的大小范圍內(nèi)。VLDL的平均洗脫位置定義為錨定峰當(dāng)中的G5的洗脫位置(見圖3(b))。
另外，在血液中呈現(xiàn)的膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白的功能作用下，甘油三酯從VLDL轉(zhuǎn)移到LDL，而膽固醇酯從LDL轉(zhuǎn)移到VLDL。LDL變成富含甘油三酯的顆粒，LDL中的甘油三酯被肝臟脂肪酶分解，LDL變得更小。脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低情況下的LDL的顆粒大小比正常血脂男性的LDL大小顯著小得多，并分布在一定的大小范圍內(nèi)。因此，此LDL的平均洗脫位置定義為錨定峰當(dāng)中的G10的洗脫位置(見圖3(b))。
另外，在脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低的情況下，甘油三酯從LDL或VLDL轉(zhuǎn)移到HDL，而膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移到LDL或VLDL。結(jié)果，HDL變得富含甘油三酯，HDL中的甘油三酯被肝臟脂肪酶分解，從而HDL變得更小。因此，脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低情況下HDL大小的顆粒比正常血脂男性的顯著更小，且分布在一定范圍內(nèi)。因此，此HDL的平均洗脫位置定義為錨定峰當(dāng)中的G18的洗脫位置(見圖3(b))。
還另外，在膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白缺乏的情況下，膽固醇酯沒有從HDL轉(zhuǎn)移到LDL或VLDL，而甘油三酯沒有從LDL或VLDL接受到，結(jié)果HDL變得富含膽固醇，同時大小變得更大。特別是在膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白缺乏情況下，HDL包括極少的甘油三酯。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白完全缺乏情況下HDL大小的顆粒比正常血脂男性的顯著更大，且分布在一定大小范圍內(nèi)。因此，此HDL的平均洗脫位置定義為錨定峰當(dāng)中的G15的洗脫位置(見圖3(d))。
還另外，在具有ApoE2/2的III型高脂血癥中，在第158位Cys替代Arg導(dǎo)致結(jié)合以ApoE為配體的LDL受體(ApoB/E)、LDL受體相關(guān)蛋白和VLDL受體的位點發(fā)生構(gòu)象變化，結(jié)果小VLDL(殘粒)的摻入減少，對應(yīng)于小VLDL的成分在血液中增加，從而觀察到特定的峰。因此，這種情況下VLDL的平均洗脫位置定義為錨定峰當(dāng)中的G7的洗脫位置(見圖3(c))。小VLDL的洗脫位置對應(yīng)于中密度脂蛋白(IDL)的洗脫位置，IDL是通過超離心法從多個患有具有ApoE2/2的III型高脂血癥的人受試者分離到的密度在1.006g/ml至1.019g/ml之間的級分(參見Shinichi Usui，Yukichi Hara，Seijin Hosaki，and Mitsuyo Okazaki，Journal of Lipid Research，Volume 43，p 805-814，(2002))。此外，IDL級分中的膽固醇含量與本發(fā)明的小VLDL中的膽固醇含量高度相關(guān)。因此，在具有ApoE2/2的III型高脂血癥中顯著增加的由錨定峰G7確定的小VLDL對應(yīng)于殘粒脂蛋白和/或IDL。
雖然圖3所示的數(shù)據(jù)是用兩根TSKgel LipopropakXL柱(TosohCorp.生產(chǎn))獲得的，但用其它的柱獲得的數(shù)據(jù)也可用作支持錨定峰定義的數(shù)據(jù)。
例如，如圖4所示，用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生產(chǎn))同樣能獲得數(shù)據(jù)，因此錨定峰可基于這些數(shù)據(jù)定義。在這種情況下，G9和G17的洗脫位置可從正常血脂的中年男性(年齡30歲到40歲)的譜圖定義(圖4(a))。G10和G18的洗脫位置可從脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低的病例的譜圖定義(圖4(b))。G7的洗脫位置可從具有ApoE2/2的III型高脂血癥病例的譜圖定義(圖4(c))。G15的洗脫位置可從膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白完全缺乏的病例的譜圖定義(圖4(d))。
再舉例說，如圖5所示，用SkylightPak-LDL柱(Skylight Biotech Inc.生產(chǎn))同樣可獲得數(shù)據(jù)，因此錨定峰可基于這些數(shù)據(jù)定義。在這種情況下，G6、G9和G17的洗脫位置可從正常血脂的中年男性(年齡歲17到30歲)的譜圖定義(圖5(a))。G10和G18的洗脫位置可從脂蛋白脂肪酶活性沒有或極低的病例的譜圖定義(圖5(b))。G7的洗脫位置可從具有ApoE2/2的III型高脂血癥病例的譜圖定義(圖5(c))。G15的洗脫位置可從膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白完全缺乏的病例的譜圖定義(圖5(d))。
如上所述，在G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17和G18是錨定峰的條件下，定義了各個洗脫位置。
接著，對于額外必要峰，峰的位置和寬度通過數(shù)學(xué)法確定。額外必要峰對于通過高斯近似來分析成分峰來說是必需的，在高斯近似中成分峰的大小和分布是固定的(時間和寬度固定)。就LDL和HDL而言，包括錨定峰和額外必要峰的成分峰的分布寬度假定為相互間幾乎相同，額外必要峰還假定為以幾乎相等的間隔位于錨定峰之間。在G10和G15之間設(shè)置了四個額外必要峰(峰11-14)，在G7和G9之間設(shè)置了一個額外必要峰(峰8)，在G15和G17之間設(shè)置了一個額外必要峰(峰16)，在G18之后設(shè)置了兩個額外必要峰(峰19和20)。屬于HDL的額外必要峰(峰16-20)的位置，可參考正常人群中的峰觀察頻率與使用另一HDL特異性柱的分析中進行重新色譜所獲得的實驗值之間的對應(yīng)性來定義(參見Okazaki M et al.，J Biochem.，1982；92517-524)。
成分峰G8-20的位置確定為間隔幾乎相等，它們的寬度也確定為幾乎相等。成分峰2、3、4對于孔隙體積(Void)處的峰1和錨定峰G5之間進行高斯近似是必需的，也按照峰間隔和寬度規(guī)則來確定。
另外，成分峰寬度的最小值可定義為從分析系統(tǒng)獲得的游離甘油(分子量92、大小均勻的顆粒，圖2所示FG)寬度，最大值可定義為相鄰成分峰間隔的兩倍。
對于20個成分峰，峰寬度可設(shè)置為通過以下方程式獲得的數(shù)值SD(min.)＝半峰寬(sec.)/143。具體的說，下述數(shù)值被輸入或預(yù)置為20個成分峰的峰寬度G01為033min.；G02為0.40min.；G03為0.55min.；G04為0.55min.；G05為0.55min.；G06為0.50min.；G07為0.40min.；G08為0.38min.；G09為0.38min.；G10為0.38min.；G11為0.38min.；G12為0.38min.；G13為0.38min.；G14為0.38min.；G15為0.38min.；G16為0.38min.；G17為0.38min.；G18為0.38min.；G19為0.38min.和G20為0.48min.。
步驟2的數(shù)據(jù)處理裝置可例如通過應(yīng)用高斯曲線擬合計算算法來執(zhí)行。根據(jù)高斯曲線擬合計算算法，可如下獲得20個成分峰。
即，首先假設(shè)色譜圖上的單個峰呈對稱高斯分布的形式，時間t時的峰高h(t)可表示為 h(t)＝H×exp(-(t-T)2/2σ2) 式中T為峰位置，σ為寬度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(H為峰高的最大值)。已知峰還可呈以下形式(1)Peason VII，(2)Lorentzian，(3)指數(shù)修正的Gaussian，(4)Weibull，(5)bi-Gaussian，(6)Poisson，(7)Gram-Charlier，(8)Gauss和Cauchy函數(shù)的組合，(9)統(tǒng)計動差的組合或(10)凸輪驅(qū)動模擬峰(cam-driven analog peak)，因此可假定峰呈(1)至(8)任一形式。
第n個峰的高度hn(t)可表示為 hn(t)＝Hn×exp(-(t-Tn)2/2σn2)...I 式中Tn為第n個峰的位置，σn為寬度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(Hn為第n個峰(高度)的最大值)。
假設(shè)exp(-(t-Tn)2/2σn2)＝Gn(t)，則公式I可表示為 hn(t)＝Hn×Gn(t)...II. 假設(shè)N個峰相互獨立，時間t時的合成曲線A(t)可表示為 A(t)＝h1(t)+h2(t)+...+hn-1(t)+hn(t) ＝H1×G1(t)+H2×G2(t)+...+Hn-1×Gn-1(t)+Hn×Gn(t)...III. 假設(shè)數(shù)據(jù)點的數(shù)量為m，上述公式III可如下m種不同方式表示 A(t1)＝H1×G1(t1)+H2×G2(t1)+...+Hn-1×Gn-1(t1)+Hn×Gn(t1)； A(t2)＝H1×G1(t2)+H2×G2(t2)+...+Hn-1×Gn-1(t2)+Hn×Gn(t2)； ...；和 A(tm)＝H1×G1(tm)+H2×G2(tm)+...+Hn-1×Gn-1(tm)+Hn×Gn(tm)。
假設(shè)時間t時的色譜圖的實際曲線由R(t)表示，用曲線擬合方法來確定峰數(shù)量n、峰位置T和寬度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)σ，以獲得R(t)＝A(t)。在實際上，由于通過線性最小二乘法在任何時間都不能實現(xiàn)公式R(t)＝A(t)，故確定使(R(t)-A(t))2之和為最小值的參數(shù)。
除曲線擬合方法外，還可以應(yīng)用例如迭代方法(如F1etcherPowell、Marquardt、Newton-Raphson、Simplex minimization、Box-Complex方法)。但是，這些曲線擬合方法之外的方法具有如下缺點，即初始值對計算結(jié)果有影響；必需先假定曲線對應(yīng)于Gaussian還是對應(yīng)于Lorentzian；和當(dāng)峰的數(shù)量較大時(4個或更多)收斂難以實現(xiàn)。因此，非常重要的是知道如何確定更接近于真實值的初始值。最近已報道了諸如(1)因子分析、(2)矩分析、(3)正交多項式分析和(4)反擴散模型的方法作為克服這些缺點的峰分離方法，這些方法也可應(yīng)用于本發(fā)明算法。
由于ti(i＝1，2，...，m)為常數(shù)，任何Gn(ti)也變成常數(shù)。因此，上述公式III可如下m種不同方式表示 A(t1)＝H1×G1(t1)+H2×G2(t1)+...+H19×Gn-1(t1)+H20×G20(t1)； A(t2)＝H1×G1(t2)+H2×G2(t2)+...+H19×Gn-1(t2)+H20×G20(t2)； ...；和 A(tm)＝H1×G1(tm)+H2×G2(tm)+...H19×G19(tm)+H20×G20(tm)。
假設(shè)R(t)＝A(t)，可獲得m個基本表達式，其各自包含20個未知數(shù)H1、H2...、H19和H20。若m＝20，則解開該m個基本表達式即得解。
雖然在實際數(shù)據(jù)中數(shù)據(jù)點的數(shù)量不是20，但方便地選擇容易高速進行計算的20個點(例如20個峰位置，各位置存在于20個成分峰的每一個中)用于本發(fā)明算法中的計算。在本發(fā)明算法中，數(shù)據(jù)點的數(shù)量可不選擇為20個點，而是可通過最小二乘法確定。
根據(jù)上述包括步驟1和步驟2的流程，系統(tǒng)控制器9輸出的色譜圖(例如圖2所示的色譜圖)可分離成20個成分峰。通過分離成20個成分峰獲得的，顯示內(nèi)臟脂肪面積(VFA)的明顯相關(guān)性的譜圖，被有效地用來檢查內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的風(fēng)險。
內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的實例包括例如以缺血性心臟病為代表的動脈硬化疾病。也就是說，由于近來生活方式改變所伴隨的營養(yǎng)過度或低體力勞動導(dǎo)致脂肪積累和肥胖，因各種風(fēng)險因素的累加所致的以缺血性心臟病為代表的動脈硬化疾病的發(fā)生率已增加。通過造成胰島素抗性的遺傳易感性與獲得性因素如肥胖相結(jié)合引起胰島素抗性而產(chǎn)生這類疾病。重要的是將腹部內(nèi)的內(nèi)臟脂肪積累認為是主要的上游原因。肥胖者及非肥胖者所引起的腹部內(nèi)內(nèi)臟脂肪積累密切地促成糖尿病、高血壓和冠狀動脈疾病(CAD)的發(fā)作。因此，內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的實例的實例包括糖尿病、高血壓、高脂血癥和冠狀動脈疾病。
在本發(fā)明的內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的診斷方法中，例如說，內(nèi)臟脂肪面積與VLDL的大、中或小亞類和與LDL的中、小或極小亞類中的膽固醇含量成正比，而與HDL的大或中亞類中的膽固醇含量成反比。換句話說，內(nèi)臟脂肪積累所致疾病通過VLDL的大、中或小亞類和LDL的中、小或極小亞類中的膽固醇含量的增加，和通過HDL的大或中亞類中的膽固醇含量的減少來診斷。
高水平的LDL膽固醇是重要的風(fēng)險因素之一。當(dāng)LDL膽固醇濃度正常時(LDL-C＜130mg/dL)，小和極小LDL亞類中的膽固醇濃度與內(nèi)臟脂肪面積成正比，而大LDL亞類中的膽固醇濃度與內(nèi)臟脂肪面積成反比。這意味著LDL中包括抗動脈粥樣硬化的LDL亞類，大LDL亞類起作用以抑制動脈硬化的發(fā)作。雖然大LDL亞類的成分峰被確定為額外必要峰，并被確定為VLDL和LDL之間的過渡成分，但該成分峰可最新判斷為具有本發(fā)明臨床意義的新亞類。換句話說，因內(nèi)臟脂肪積累所致的動脈硬化的發(fā)作可通過大LDL亞類的成分峰處的膽固醇含量來診斷。
另外，在冠狀動脈疾病中觀察到，小VLDL亞類的膽固醇濃度增加，小和極小LDL亞類的膽固醇濃度也增加，大HDL亞類的膽固醇濃度減少，因此可以通過測量小VLDL、小和極小LDL和大HDL亞類中的膽固醇濃度來診斷冠狀動脈疾病。
因此，根據(jù)本發(fā)明可提供冠狀動脈疾病的診斷方法。冠狀動脈疾病的診斷方法利用根據(jù)上述包括步驟1和步驟2的流程分離的20個成分峰。具體的說，冠狀動脈疾病的診斷方法包括以下步驟根據(jù)上述包括步驟1和步驟2的流程分析獲自待診斷受試者的受試者樣品中所含的脂蛋白，以獲得得自受試者的20個成分峰；根據(jù)選自(I)-(V)的任一公式計算數(shù)值 (I)Vs+Ls-Hs； (II)Vs+Ls； (III)Ls； (IV)(Vs+Ls)/Hs；和 (V)Ls/Hs， 其中“Vs”表示小VLDL中的膽固醇含量；“Ls”代表小LDL和極小LDL中的膽固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的膽固醇含量。
通過冠狀動脈疾病的診斷方法獲得的數(shù)值可用于涉及冠狀動脈疾病的臨床檢查。在冠狀動脈疾病的診斷方法中，分析步驟可包括將計算值與參考值相比較的步驟。參考值可設(shè)置為預(yù)定的數(shù)值，該數(shù)值基于對正常受試者組和冠狀動脈疾病組的分析結(jié)果計算出。參考值可針對年齡組、種族組、性別等進行設(shè)置。
在冠狀動脈疾病中顯著增加的小VLDL亞類的成分峰是錨定峰，該峰由得自具有ApoE2/2的III型高脂血癥的VLDL大小確定，因此對應(yīng)于具有ApoE2/2的III型高脂血癥中增加的殘粒，由此認識到本程序中同樣是冠狀動脈的重要風(fēng)險因素的殘?？蓮膶?yīng)于小VLDL亞類的成分峰來判斷。
實施例 用實施例詳細解釋本發(fā)明。但是，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受以下實施例的限制。
[實施例1] <方法> 受試者 本研究招募62名男性(年齡22至67歲)，他們包括15名健康志愿者和47名大阪大學(xué)醫(yī)院的住院病人。所有受試者在參加研究前都根據(jù)大阪大學(xué)醫(yī)院倫理委員會的要求表示了他們的知情同意。所有患者都沒有嚴(yán)重的肝病或腎病，且他們都沒有服用任何已知會影響胰島素作用或血清脂蛋白水平的藥物。在過夜禁食后抽取靜脈血。血清樣品保存在冰箱中，在血液收集后7天內(nèi)進行分析。
HPLC方法 簡言之，將5mL全血清樣品注射到2根連接在一起的TSKgelLipopropakXL(Tosoh)柱(300k×7.8mm)，用TSKeluent Lp-1(Tosoh)洗脫。柱洗脫液與市售試劑盒Determiner L TC(Kyowa Medex)進行在線酶促反應(yīng)后于550nm處進行連續(xù)監(jiān)測。各大類脂蛋白及其亞類的膽固醇濃度用我們自己的計算機程序來計算，該程序設(shè)計來用修飾的高斯曲線擬合處理復(fù)雜的色譜圖，以通過數(shù)學(xué)處理來解析重疊的峰。
我們確定了亞類分析用的每個高斯成分峰的數(shù)量、位置和寬度，以在恒定的條件下對來自動物和人類的各種樣品進行充分的曲線擬合分析，在該條件下每個高斯曲線的峰寬和位置都不改變。為此目的，我們先說明健康的正常血脂男性(n＝28)的VLDL和LDL的平均顆粒大小。因此，成分峰6和9的位置分別對應(yīng)于健康受試者的VLDL(36.8±2.5nm)和LDL(25.5±0.4nm)的位置。類似地，峰5和10的位置分別是有和沒有脂蛋白脂肪酶(LPL)的極高甘油三酯血癥受試者(＞1000mg/dL(n＝7))的VLDL(44.5±2.1nm)和LDL(23.0±0.5nm)的位置。峰7對應(yīng)于具有ApoE2/2的III型高脂血癥受試者(n＝5)的LDL(或VLDL；31.3±1.0nm)。峰15是膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白缺乏受試者(n＝6)的HDL(13.5±0.4nm)。HDL亞類的其它成分峰(峰16-20)基于用分離范圍只針對HDL的凝膠滲透柱(G3000SW)確定的5個亞類。除上述通過一定實驗背景確定的11個成分峰外，還引入9個另外的峰(峰1-4、8和11-14)，以便只通過改變每個高斯曲線的峰高就獲得最佳曲線模擬分析。峰8的位置(28.6nm)確定為峰7和峰9之間的中間點，代表了從富含TG的殘粒脂蛋白到LDL的過渡成分。將四個峰(峰11-14)勻稱地插入到峰10和峰15之間，使得從峰8到峰20各峰間隔相似。此外，在孔隙體積(峰1)和峰5之間需要引入至少3個峰(峰2-4)，以進行最佳曲線擬合。另外的峰作其它設(shè)置導(dǎo)致對原始色譜圖的曲線擬合分析的程度下降。洗脫時間向顆粒直徑的換算用柱校準(zhǔn)曲線來進行，該曲線是標(biāo)準(zhǔn)樣品——直徑25和37nm的乳膠小珠(MagsphereInc)和含甲狀腺球蛋白(17nm)、鐵蛋白(12.2nm)、過氧化氫酶(9.2nm)、清蛋白(7.1nm)和卵清蛋白(6.1nm)的高分子量校準(zhǔn)品(PharmaciaBiotech)的顆粒直徑對數(shù)對其洗脫時間的曲線。
其它臨床和脂質(zhì)參數(shù)分析 血清TC和TG用市售試劑盒(Kyowa Medex)酶法測定。HDL-C通過肝素Ca2+沉淀方法定量。LDL-C用Friedewald等的公式計算。尿酸(UA)、空腹免疫反應(yīng)性胰島素(IRI)和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1分別通過酶學(xué)方法和通過雙抗體放射免疫測定法測量。
體脂肪分布按先前文獻的描述通過計算機斷層(CT)掃描(GeneralElectric CT/T掃描器，General Electric Co)在仰臥體位測定。皮膚和肌肉之間到腹膜外區(qū)域的脂肪層定義為皮下脂肪區(qū)域(SFA)，注意廣度(attention range)為-40至-140 Hounsfield單位。密度與SFA相同的腹膜內(nèi)區(qū)域定義為VFA。SFA和VFA在臍水平測量。
統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，除非另有規(guī)定。各變量之間的相關(guān)性以Pearson相關(guān)系數(shù)(r值)給出，P值＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
<結(jié)果> 研究受試者的臨床特征和脂質(zhì)水平 本研究的62名男性的臨床特征和脂質(zhì)水平在表1中顯示。
表1.62名男性的臨床特性、脂質(zhì)和脂蛋白譜 *用沉淀法測定。
_方程的計算值。
獲得的人體測量值相差甚大，因為招募他們就是為了覆蓋大范圍的體脂肪值體重指數(shù)(BMI)21-43kg/cm2，VFA 24-255cm2，SFA55-512cm2。代謝參數(shù)相比于參考值顯示有偏差UA 3.8-12.5mg/dL，IRI2-43μU/mL，PAI-15.0-75.7ng/mL。
HPLC對各大類脂蛋白及其亞類中血清膽固醇水平的測定的分析性能 如表2所示，我們以脂蛋白顆粒大小(直徑)為基礎(chǔ)定義了3個VLDL亞類(大、中和小)、4個LDL亞類(大、中、小和極小)和5個HDL亞類(極大、大、中、小和極小)乳糜微粒(＞80nm，峰1-2)、VLDL(30-80nm，峰3-7)、LDL(16-30nm，峰8-13)和HDL(8-16nm，峰14-20)。
表2.各大類血清脂蛋白及其亞類的定義及它們的 膽固醇水平測量的天內(nèi)精密度(within-day precision)(n＝5) NA.表示無數(shù)據(jù)。CV，變異系數(shù)；CM，乳糜微粒 集合1正常血脂混合血清 集合2高血脂混合血清 用于對正常血脂受試者(TC＝131mg/dL，TG＝39mg/dL)和高血脂受試者(LPL缺乏，TC＝219mg/dL，TG＝1420mg/dL)進行曲線擬合分析的代表性色譜圖在圖6中給出。
在圖6中，代表性的HPLC譜型(a)顯示健康女性，(b)顯示LPL缺乏患者。將5-μL血清樣品注射到2根串連的凝膠滲透柱(TSKgelLipopropakXL)上，用TSKeluent LP-1以0.7mL/min的流速洗脫。實線是TC試劑的在線酶促反應(yīng)所檢測到的真實HPLC譜型。虛線是各個亞類及它們的高斯曲線之和，該曲線為用高斯總和法確定的曲線擬合。血清TC和血清TG水平分別為131mg/dL和39mg/dL(a)及219mg/dL和1420mg/dL(b)。還給出了從所觀測到的峰時間確定的顆粒大小(nm)。
對表2所示的2個不同的混合樣品(集合(pool)1TC＝177mg/dL，TG＝56mg/dL；集合2TC＝163mg/dL，TG＝428mg/dL)，確定20個亞類和主類別的膽固醇測定的運行內(nèi)再現(xiàn)性(within-runreproducibility)(n＝5)。
LDL和HDL顆粒大小的運行內(nèi)再現(xiàn)性(n＝5)，對于集合1分別為25.20±0.07nm(變異系數(shù)[CV]，0.27％)和11.25±0.04nm(CV，0.36％)，對于集合2分別為25.63±0.14nm(CV，0.56％)和11.03±0.05nm(CV，0.45％)。
20個高斯曲線的面積之和占原始色譜圖下面積的100.2±0.4％(99.1-101.7％，n＝62)。對應(yīng)于HDL(峰14-20)的峰面積之和占原始色譜圖下HDL峰面積的99.741.1％(98.3-103.9％，n＝62)。
獲得了沉淀法測出的HDL-C(x)和HPLC測出的總HDL(所有HDL亞類)(y)之間的良好相關(guān)性y＝0.975x+5.29(r＝0.973，n＝62，P＜0.0001)。此外，還獲得了Friedewald方程計算出的LDL-C(x)和HPLC測出的總LDL(所有LDL亞類)(y)之間的良好相關(guān)性y＝0.903x+6.28(r＝0.977，n＝62，P＜0.0001)。
膽固醇HPLC譜圖與臨床參數(shù)的相關(guān)性 各大類脂蛋白及其亞類中的膽固醇水平與各種臨床參數(shù)(年齡、BMI、VFA、SFA、UA、IRI和PAI-1)和血清TG水平的簡單相關(guān)性在表3中總結(jié)。此外，表3還給出LDL和HDL顆粒大小的相關(guān)性。
表3.HPLC方法所得膽固醇譜與臨床參數(shù)的簡單相關(guān)性(n＝62) 數(shù)值是Pearson相關(guān)系數(shù) *通過HPLC從LDL和HDL峰時間獲得的平均顆粒直徑(nm)。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 對于年齡，獲得了中和小HDL-C的顯著負相關(guān)性(P＜0.01)。對于BMI，只觀察到HDL參數(shù)大HDL-C(P＜0.01)和HDL顆粒大小(P＜0.01)的顯著負相關(guān)性。雖然在SFA和所有脂蛋白亞類之間沒有觀察到相關(guān)性，但VFA與VLDL-C亞類(大、中和小)和LDL-C亞類(中、小和極小)有顯著的正相關(guān)性(P＜0.01)，與大和中HDL-C、LDL和HDL顆粒大小有負相關(guān)性(P＜0.01)。
對于UA，對VLDL-C亞類(中和小)獲得了正相關(guān)性(P＜0.01)，對大HDL-C和HDL顆粒大小獲得了負相關(guān)性(P＜0.01)。在IRI情況下，對小和極小LDL-C獲得了正相關(guān)性(P＜0.01)，對大HDL-C和HDL顆粒大小獲得了負相關(guān)性(P＜0.01)。對于PAI-1，對小HDL-C和極小HDL-C觀察到正相關(guān)性(P＜0.01)。對于血清TG水平，VFA與VLDL-C亞類(大、中和小)和LDL-C亞類(小和極小)有顯著的正相關(guān)性(P＜0.01)，與大LDL-C、HDL-C亞類(大和中)、LDL和HDL顆粒大小有負相關(guān)性(P＜0.01)。
傳統(tǒng)脂質(zhì)參數(shù)對VFA與脂蛋白亞類之間相關(guān)性的影響 在表3的人體測量值當(dāng)中，VFA水平顯示出與脂蛋白亞類最強的相關(guān)性。因此，通過分別調(diào)整血清TG、血清TC、HDL-C和LDL-C水平來研究傳統(tǒng)脂質(zhì)參數(shù)對VFA與脂蛋白亞類之間相關(guān)性的影響(表4)。分別調(diào)整TG、TC、HDL-C和LDL-C后，VFA與小LDL-C和極小LDL-C的正相關(guān)性仍保持顯著(P＜0.01)。
表4 HPLC方法所得的膽固醇譜與VFA的部分相關(guān)性 數(shù)值是Pearson相關(guān)系數(shù)。
TC、HDL-C和LDL-C是通過酶學(xué)方法、沉淀法和Friedewald方程獲得的數(shù)值。
*通過HPLC從LDL和HDL峰時間獲得的平均顆粒直徑(nm)。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 對于VLDL亞類，簡單的相關(guān)性分析顯示，所有的VLDL亞類都與VFA正相關(guān)，但在調(diào)整血清TG水平后大VLDL和小VLDL分別與VFA負相關(guān)和正相關(guān)。在LDL亞類情況下，LDL-C的調(diào)整引起大LDL和VFA之間的顯著負相關(guān)性(P＜0.01)，但消除中LDL和VFA之間的顯著正相關(guān)性。
LDL-C對VFA和LDL亞類之間相關(guān)性的影響 將研究受試者按總LDL-C水平(所有LDL亞類之和)的平均值分成低LDL-C組(n＝31，LDL-C＜130mg/dL)和高LDL-C組(n＝31，LDL-C≥130mg/dL)。如表3所給出，在總?cè)巳褐?n＝62)，獲得了VFA與總LDL-C之間的顯著正相關(guān)性(r＝0.431，P＜0.001)。VFA與總LDL-C之間在低LDL-C組中沒有相關(guān)性，但在高LDL-C組中有顯著正相關(guān)性(r＝0.546，P＜0.002)。VFA與LDL亞類之間的散點圖在圖7中給出。
在圖7中，顯示VFA對高LDL-C組(○)和低LDL-C組(●)的(a)大LDL-C、(b)小LDL-C和(c)極小LDL-C的散點圖。虛線表示低LDL-C組的線性回歸。還給出了低LDL-C組(n＝31)的相關(guān)系數(shù)和P值。
大LDL-C在總?cè)巳汉透週DL-C組中沒有顯示與VFA的顯著相關(guān)性，但在低LDL-C組中顯示顯著負相關(guān)性(r＝-0.446，P＜0.02)。小LDL-C和極小LDL-C在總?cè)巳汉蛢山M中顯示與VFA的顯著正相關(guān)性，高LDL-C組中的極小LDL-C除外。
[實施例2] <方法> 受試者 從在1996年12月到1998年12月兩年間在日本Yamagata大學(xué)醫(yī)院相續(xù)進行心導(dǎo)管術(shù)的609名男性中選擇62名受試者，排除了接受任何脂質(zhì)降低藥物的人或者患有糖尿病或患有任何腎病和肝病的人。所有受試者在參加本實施例研究前都根據(jù)大阪大學(xué)醫(yī)院倫理委員會的要求表示了他們的知情同意。
將選出的年齡為62±9歲(范圍41-76歲)的受試者根據(jù)是否患有CAD分成兩組。在患有CAD的患者組(n＝45)中，21名患者有心肌梗塞(MI)史(急性MI 3人；1個月內(nèi)的MI 1人；過往MI 7人)，7名患者有勞累性心絞痛，11名患者有血管痙攣性心絞痛，4名患者有不穩(wěn)定型心絞痛，2名患者沒有心臟癥狀但有明顯的冠狀動脈狹窄(無癥狀心肌缺血)。在不患CAD的對照受試者(n＝17)中，4名患者有非典型胸痛，6名患者有心肌病，4名患者有主動脈瓣病變，3名患者有心電圖異常。
在本實施例中，定義了以下-1到3的5等級標(biāo)度以評估血管疾病的嚴(yán)重性-1，沒有血管疾病；0，血管疾病伴狹窄＜75％；1，單血管疾病伴狹窄≥75％；2，雙血管疾病伴狹窄≥75％；3，三血管疾病伴狹窄≥75％。
在過夜禁食后抽取靜脈血。血漿樣品保存在冰箱中，在血液收集后7天內(nèi)進行分析。
HPLC方法 血漿脂蛋白按實施例1描述的方法分析。
其它臨床和脂質(zhì)參數(shù)分析 血漿TG用市售試劑盒(Kyowa Medex，日本東京)酶法測定。血漿載脂蛋白A-I、A-II、B、C-II、C-III和E水平用日本東京DaiichiChemicals公司的免疫比濁法測定?？崭寡?FBS)通過酶學(xué)方法測量。用病史檔案和調(diào)查表獲得有關(guān)年齡、體重、身高、吸煙史、家族史、高血壓、先前的MI、心絞痛、糖尿病和藥物使用的資料。體重指數(shù)(BMI)從體重和身高計算為(kg)/[身高(m)]2。
統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，除非另有規(guī)定。用Student t檢驗確定各組之間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。各個變量之間的相關(guān)性以Pearson相關(guān)系數(shù)(r值)給出，P值＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
結(jié)果 臨床特征、脂質(zhì)和脂蛋白水平的比較 本研究的62名男性的臨床特征、脂質(zhì)和載脂蛋白水平在表5中顯示。對于年齡、BMI、FBS、風(fēng)險標(biāo)志(目前吸煙者、高血壓和家族史)百分比分布、血漿TC和TG水平，患者組和對照組之間沒有顯著差異。對于載脂蛋白譜圖，在患者組獲得顯著更高的載脂蛋白B(P＜0.05)和載脂蛋白E(P＜0.01)。
表5 _P＜0.01，§P＜0.05(與對照受試者相比) 數(shù)據(jù)代表平均值±SD或受試者的數(shù)量(％)。
我們通過HPLC后的成分分析確定了3個VLDL亞類(大、中和小)、4個LDL亞類(大、中、小和極小)、5個HDL亞類(極大、大、中、小和極小)中的膽固醇水平，還定義了各大類脂蛋白(總VLDL、總LDL和總HDL)中的膽固醇水平。表6比較了患者組與對照組的各大類脂蛋白及其亞類中的膽固醇水平。
表6 _P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 對于各大類脂蛋白，患者組有顯著(P＜0.05)更高的總LDL-C和更低的總HDL-C，但在總VLDL-C水平上沒有差異。對于脂蛋白亞類，患者組的小VLDL-C(P＜0.001)、小LDL-C(P＜0.05)和極小LDL-C(P＜0.001)顯著增加，但大HDL-C(P＜0.001)顯著減少。所有傳統(tǒng)風(fēng)險標(biāo)記、非HDL-C、TC/HDL-C比和LDL-C/HDL-C比都是患者組顯著高于對照組。
為了更清楚地區(qū)分兩個組，從每個亞類計算出幾個衍生變量。將在患者組中顯著增加的三個亞類(小VLDL、小LDL和極小LDL)合并表示為“Vs+Ls”?！癡s”表示小VLDL中的膽固醇水平。“Ls”表示小LDL和極小LDL中的膽固醇水平之和。增加的亞類(Vs+Ls)和減少的亞類(大HDL)之差或之比分別表示為“Vs+Ls-Hs”和“(Vs+Ls)/Hs”或“Ls/Hs”?！癏s”表示大HDL中的膽固醇水平。
所有這些衍生變量也是患者組顯著高于對照組，“Vs+Ls-Hs”顯示最強的差異。
各大類脂蛋白及其亞類中的膽固醇水平和衍生變量與血管疾病分數(shù)的相關(guān)性 各大類脂蛋白及其亞類中的膽固醇水平與血管疾病分數(shù)(CAD的指標(biāo))的簡單相關(guān)性在表7中顯示。血管疾病分數(shù)與小VLDL-C和小LDL-C呈強正相關(guān)(P＜0.01)，與大HDL-C呈負相關(guān)(P＜0.01)。
表7 數(shù)值是Pearson相關(guān)系數(shù)。
a)VD分數(shù)血管疾病分數(shù)，-1，沒有血管疾?。?，血管疾病伴狹窄＜75％；1，單血管疾病伴狹窄≥75％；2，雙血管疾病伴狹窄≥75％；3，三血管疾病伴狹窄≥75％。
_P＜0.001，_P＜0.01，§P＜0.05 我們還研究了血管疾病分數(shù)和表6所給出的幾個衍生變量之間的相關(guān)性。如表7所示，所有變量與血管疾病分數(shù)都有高于r＝0.333(n＝62，P＜0.01)的強正相關(guān)性，“Vs+Ls-Hs”獲得最強的相關(guān)性(r＝0.428，P＜0.001)。對于傳統(tǒng)的脂質(zhì)風(fēng)險標(biāo)記，血管疾病分數(shù)與LDL-C/HDL-C比和TC/HDL-C比顯著(P＜0.01)相關(guān)，但與非HDL-C不顯著相關(guān)(結(jié)果未給出)。
傳統(tǒng)脂質(zhì)參數(shù)對CAD嚴(yán)重性與脂蛋白亞類及其衍生變量的相關(guān)性的影響 研究了傳統(tǒng)脂質(zhì)參數(shù)對血管疾病分數(shù)和脂蛋白亞類及其衍生變量之間的相關(guān)性的影響，以評估這些變量對CAD嚴(yán)重性關(guān)聯(lián)的臨床有用性。表7顯示控制每個傳統(tǒng)單變量(TG、TC、HDL-C、LDL-C和載脂蛋白B)或每個組合變量如非HDL-C、TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C后，HPLC變量和血管疾病分數(shù)之間的部分相關(guān)系數(shù)。控制血漿TG、TC和HDL-C并不對血管疾病分數(shù)和HPLC變量之間的相關(guān)性產(chǎn)生很大的影響。另一方面，在控制LDL-C、載脂蛋白B或非HDL-C后，極小LDL-C和血管疾病分數(shù)的正相關(guān)性變得不顯著。調(diào)整LDL-C后產(chǎn)生了大LDL-C和血管疾病分數(shù)的顯著負相關(guān)性?？刂芓C/HDL-C或LDL-C/HDL-C消除了所有的顯著相關(guān)性，但在控制TC/HDL-C后中VLDL-C和血管疾病分數(shù)的負相關(guān)性變得顯著。即使在控制任何因素后，“Vs+Ls-Hs”和血管疾病分數(shù)的正相關(guān)性仍保持。此外，除控制TC/HDL-C或LDL-C/HDL-C外，“Vs+Ls”和血管疾病分數(shù)的顯著正相關(guān)性仍保持。
[實施例3] 在本實施例中，用Superose 6HR 10/30柱(Pharmacia生產(chǎn))和兩根TSKgel LipopropakXL柱(Tosoh Corp.生產(chǎn))分析表8所示的59個樣品，然后將獲得的結(jié)果相互比較。
[表8] 在本實施例中，還用Superose柱(Pharmacia生產(chǎn))和兩根TSKgelLipopropakXL柱(Tosoh Corp.生產(chǎn))分析表9所示的44個樣品，然后將獲得的結(jié)果相互比較。
[表9] 在本實施例中，20個成分峰的洗脫時間(顆粒大小)如表10所示定義。
表10 對于來自健康受試人的混合血清，圖8(a)和(b)顯示用Superose6HR 10/30柱獲得的分析結(jié)果，圖9(a)和(b)顯示用TSKgelLipopropakXL柱獲得的分析結(jié)果，圖10(a)和(b)顯示用SkylightPak-LDL柱獲得的分析結(jié)果。圖8(a)、9(a)和10(a)中描繪的粗線顯示膽固醇在分離成成分峰之前的譜圖。圖8(b)、9(b)和10(b)中描繪的粗線顯示甘油三酯在分離成成分峰之前的譜圖。
圖11顯示G7至G20每個峰中所包括的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用Superose 6HR 10/30柱對表8所示59名受試者所得的圖8(a)所示結(jié)果。圖12顯示G7至G20每個峰中所包括的平均膽固醇含量的計算結(jié)果，其來自用TSKgel LipopropakXL柱對表8所示59名受試者所得的圖9(a)所示結(jié)果。圖13顯示基于對表8所示59名受試者所得的圖11和12所示結(jié)果，Superose 6HR 10/30和TSKgelLipopropakXL柱之間對于G7至G13(對應(yīng)于小VLDL亞類到LDL亞類)各成分峰中所包括的膽固醇含量的比較結(jié)果。還有，圖14顯示基于對表8所示59名受試者所得的圖11和12所示結(jié)果，兩種柱之間對于G14至G20(對應(yīng)于HDL亞類)各成分峰中所包括的膽固醇含量的比較結(jié)果。
在圖8(a)、9(a)、11-14中可見，G7至G20這14個成分峰中所包括的膽固醇含量用Superose 6HR 10/30柱或TSKgel LipopropakXL柱證實是大約一致的。
圖15顯示用TSKgel LipopropakXL柱對表9所示44名受試者所得的圖9(a)所示結(jié)果當(dāng)中，G6至G20各峰中所包括的平均膽固醇含量的計算結(jié)果。圖16顯示用SkylightPak-LDL柱對表9所示44名受試者所得的圖10(a)所示結(jié)果當(dāng)中，G6至G20各峰中所包括的平均膽固醇含量的計算結(jié)果。圖17顯示基于對表9所示44名受試者所得的圖15和16所示結(jié)果，TSKgel LipopropakXL柱和SkylightPak-LDL柱之間對于G6至G13(對應(yīng)于中VLDL亞類到LDL亞類)各成分峰中所包括的膽固醇含量的比較結(jié)果。圖18顯示基于對表9所示44名受試者所得的圖15和16所示結(jié)果，兩種柱之間對于G14至G20(對應(yīng)于HDL亞類)各成分峰中所包括的膽固醇含量的比較結(jié)果。
在圖9(a)、10(a)、15-18中可見，G6至G20這15個成分峰中所包括的膽固醇含量用TSKgel LipopropakXL柱或SkylightPak-LDL柱證實是大約一致的。
因此，根據(jù)本發(fā)明的分析方法，即使在使用任何柱而不論其一些特性如分辨力如何時，都能獲得可靠性優(yōu)越的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。而且，如圖8(b)、9(b)和10(b)所示，本發(fā)明的分析方法可應(yīng)用于甘油三酯的分析，類似于上述膽固醇的分析。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的分析方法，基于得自膽固醇的檢測信號進行定義的成分峰被用來計算有關(guān)得自甘油三酯、游離膽固醇、磷脂、載脂蛋白等的譜圖的近似曲線。
產(chǎn)業(yè)適用性 上文已詳細描述到，本發(fā)明提供脂蛋白顆粒的分析裝置和方法，用該分析裝置和方法即使在使用分辨力或分子大小范圍不同的凝膠過濾柱時都可以進行多個樣品各亞類之間的比較。根據(jù)本發(fā)明的脂蛋白顆粒分析裝置和方法，可以比常規(guī)和公知的方法和裝置以更高的可靠性獲得數(shù)據(jù)。通過本發(fā)明的脂蛋白顆粒分析裝置和方法獲得的數(shù)據(jù)，能有效地用于診斷例如由內(nèi)臟脂肪積累所致的各種疾病，如糖尿病、高血壓、高血脂癥和冠狀動脈疾病。
權(quán)利要求
1.一種脂蛋白顆粒分析方法，所述方法包括以下步驟
通過液相色譜分離受試者樣品中所含的多種類別脂蛋白，然后檢測來自分離脂蛋白顆粒中所包括的成分的信號；
假定每種脂蛋白顆粒由從錨定峰和額外必要峰組成的成分峰推測出的亞類組成，然后用上述檢測信號計算對應(yīng)于成分峰總和的近似曲線。
2.權(quán)利要求1的分析方法，其中一個或多個所述錨定峰的洗脫位置通過在代謝疾病患者中觀察到的洗脫位置來確定，所述患者的脂蛋白代謝表明VLDL、LDL和HDL的大小范圍窄。
3.權(quán)利要求1的分析方法，其中所述錨定峰對應(yīng)于至少一個選自以下的峰洗脫位置在44.5±2.1nm的峰、洗脫位置在36.8±2.5nm的峰、洗脫位置在31.3±1.0nm的峰、洗脫位置在25.5±0.4nm的峰、洗脫位置在23.0±0.5nm的峰、洗脫位置在13.5±0.4nm的峰、洗脫位置在10.9±0.2nm的峰和洗脫位置在9.8±0.2nm的峰。
4.權(quán)利要求1的分析方法，其中對所述額外必要峰的洗脫位置和峰寬度進行預(yù)設(shè)置，以使其以幾乎相等的間隔位于所述各錨定峰之間。
5.權(quán)利要求1的分析方法，其中所述近似曲線由20個成分峰組成。
6.一種內(nèi)臟脂肪積累所致疾病的診斷方法，所述方法包括以下步驟
提供得自待診斷受試者的受試者樣品；
通過液相色譜分離所述受試者樣品中所含的多種類別脂蛋白，然后檢測來自分離脂蛋白顆粒中所包括的成分的信號；
假定每種脂蛋白由從錨定峰和額外必要峰組成的成分峰推測出的亞類組成，然后用上述檢測信號計算對應(yīng)于成分峰總和的近似曲線；
分析所述計算出的近似曲線。
7.權(quán)利要求6的診斷方法，其中一個或多個所述錨定峰的洗脫位置通過在代謝疾病患者中觀察到的洗脫位置來確定，所述患者的脂蛋白代謝表明VLDL、LDL和HDL的大小范圍窄。
8.權(quán)利要求6的診斷方法，其中所述錨定峰對應(yīng)于至少一個選自以下的峰洗脫位置在44.5±2.1nm的峰、洗脫位置在36.8±2.5nm的峰、洗脫位置在31.3±1.0nm的峰、洗脫位置在25.5±0.4nm的峰、洗脫位置在23.0±0.5nm的峰、洗脫位置在13.5±0.4nm的峰、洗脫位置在10.9±0.2nm的峰和洗脫位置在9.8±0.2nm的峰。
9.權(quán)利要求6的診斷方法，其中對所述額外必要峰的洗脫位置和峰寬度進行預(yù)設(shè)置，以使其以幾乎相等的間隔位于所述各錨定峰之間。
10.權(quán)利要求6的診斷方法，其中所述近似曲線由20個成分峰組成。
11.權(quán)利要求6的診斷方法，其中所述分析步驟是將大VLDL、中VLDL、小VLDL、中LDL、小LDL、極小LDL、大HDL和中HDL中的膽固醇含量與參考值進行比較。
12.權(quán)利要求6的診斷方法，其中所述分析步驟是通過將大LDL中的膽固醇含量與參考值進行比較，將疾病診斷為動脈硬化癥。
13.權(quán)利要求6的診斷方法，其中所述分析步驟是通過將小VLDL、小LDL、極小LDL和大HDL中的膽固醇含量與參考值進行比較，將疾病診斷為冠狀動脈疾病。
14.一種冠狀動脈疾病診斷方法，所述方法包括以下步驟
用權(quán)利要求1-5中任一項的脂蛋白分析方法分析得自待診斷受試者的受試者樣品中所含的脂蛋白；
根據(jù)選自(I)-(V)的任一公式計算數(shù)值
(I) Vs+Ls-Hs；
(II) Vs+Ls；
(III) Ls；
(IV) (Vs+Ls)/Hs；
(V) Ls/Hs，
其中“Vs”表示小VLDL中的膽固醇含量；“Ls”代表小LDL和極小LDL中的膽固醇含量之和；“Hs”代表大HDL中的膽固醇含量。
15.權(quán)利要求14的診斷方法，其中所述分析步驟還包括將計算值與參考值進行比較的步驟。
全文摘要
本發(fā)明的脂蛋白分析方法包括以下步驟通過液相色譜分離受試者樣品中所含的多種類別脂蛋白，然后檢測來自分離脂蛋白中所包括的成分的信號；和假定脂蛋白由從包括錨定峰和額外必要峰的成分峰推測出的亞類組成，然后用上述檢測信號計算對應(yīng)于成分峰總和的近似曲線。
文檔編號G01N30/88GK101107519SQ20058004708
公開日2008年1月16日 申請日期2005年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者岡崎三代 申請人:岡崎三代