專利名稱：蛋白質(zhì)分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
描述了用于在存在纖維蛋白原的情況下測(cè)葡 酶活性的方法或在存在凝
血酶的情況下觀懂纖維蛋白原功能的方法。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原和凝血酶是參與血管損傷后止血的關(guān)鍵蛋白，并且對(duì)于血 疑土央 的形成非常重要。纖維蛋白原和灌裇酶可以以粉末形式或以非水性懸浮液混合， 而不會(huì)引起典型的凝i央反應(yīng)，從而阻止纖維蛋白凝塊的形成，直到蛋白在水性 介質(zhì)或其它在其中蛋白是可溶的液體環(huán)境中形成水化合物。這些呈粉末形式的 蛋白的混合物具有各種潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括局部止血、組織修復(fù)、藥物 遞送等。此外，可以將這些蛋白的混合物以教、末形式裝載至載體或基質(zhì)或其它 醫(yī)學(xué)裝置中，以形成可以例如用作止血裝置的產(chǎn)品。
灌ML酶的凝i央活性通常M3i將溶液中的凝血酶與溶液中已知的纖維蛋白原
量混合來(lái)測(cè)量。在合適的條件下，在兩種蛋白混合后灌趙央形成的速率取決于凝 血酶的活性。將具有未知量凝血酶的樣本的灌妙央形成的速率與達(dá)l血酶參照或達(dá)走
血酶標(biāo)準(zhǔn)品的凝i央形成的速率相比較以確定樣本的活性。
IHfiL酶的活性是任何^血,纖維蛋白原產(chǎn)品的重要屬性，并且將決定其官 育^度。盡管游離凝血酶的測(cè)量是簡(jiǎn)單的，但當(dāng)凝血酶和纖維蛋白原在未反應(yīng)的 混合物中時(shí)測(cè)量凝血酶的活性是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)槠漤毝话阈枰獙⒌鞍踪|(zhì) 混合物進(jìn)行水合及^#解，而溶解的湊M酶和纖維蛋白原之間的纖維蛋白凝±央形 成在7jC合后即馬上開(kāi)始。此外，由于已知凝血酶與立即形成的纖維蛋白凝±央特 異性地結(jié)合并相互作用，凝血酶變得結(jié)合在纖維蛋白凝塊上且不再是游離地可 溶解于水合溶液中并且使得無(wú)法用于隨后的 疑血酶測(cè)量。因此，通過(guò)水合和凝 ±央形成的任何達(dá)|161隞纖維蛋白原產(chǎn)品凝血酶活性的倒可結(jié)果測(cè)量都僅僅是部分 的，因此是不精確的。
此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在未反應(yīng)的混合物中被裝載至載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)裝置中時(shí)， 需要將蛋白質(zhì)從基質(zhì)中移出來(lái)以精確地測(cè)量凝血酶活性，例如，如果載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)裝置由于物理化學(xué)或光學(xué)干擾測(cè)量檢測(cè)系統(tǒng)而對(duì)蛋白廁舌性或功能測(cè) 量產(chǎn)生不利影響的話。為了克月tt自載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)體的干擾，蛋白質(zhì)的 移出或提取需要在不將混合物暴露于水性條件盼瞎況下進(jìn)行，7K性^fl^導(dǎo)致 妨礙隨后測(cè)量的凝塊的形成。
纖維蛋白原最常M3it初由Clauss描述的方法測(cè)量，其基于凝±央形成的速 率觀懂纖維蛋白原的官能度。在典型的Clauss分析中，將未知量的可溶解的纖 維蛋白原與過(guò)量^疑血酶混合。這樣的纖維蛋白原和〗疑血酶比例f吏得纖維蛋白原 成為限制速率的反應(yīng)物，并且凝塊形成速率是纖維蛋白原濃度的函數(shù)?？斓哪?固時(shí)間是高纖維蛋白原濃度的指標(biāo)。反之，更長(zhǎng)的凝固時(shí)間是低濃度的功能纖 維蛋白原的指標(biāo)。功能纖維蛋白原的量可以通過(guò)將樣本的凝固時(shí)間與用來(lái)建立 標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品系列的凝固時(shí)間相比較而量化。樣本中纖維蛋白原的濃度可 以基于衍生自標(biāo)準(zhǔn)品凝固時(shí)間的方程式以數(shù)學(xué)方式計(jì)算而確定。
盡管溶液例如人類血槳中的纖維蛋白原的測(cè)量可以通過(guò)已建立的方法進(jìn) 行，然而當(dāng)纖維蛋白原與凝血酶一起存在時(shí)評(píng)估纖維蛋白原的官能度則是一個(gè) 難題?；旌衔锏乃蠈?dǎo)致凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白原至不可溶纖維蛋白凝塊的 轉(zhuǎn)變。 一旦產(chǎn)生纖維蛋白，任何隨后的纖維蛋白原的測(cè)量不再是可能的，因?yàn)?導(dǎo)致纖維形成的纖維蛋白肽從纖維蛋白原的釋放實(shí)質(zhì)上是不可逆的。
因此，仍然有這樣的需求，即在存在纖維素原的情況下精確測(cè)量湊Ml酶活 性以及在存在凝血酶的情況下測(cè)量纖維蛋白原的官能度。
附圖詳述


圖1顯示了失活溶液中pH對(duì)恢復(fù)凝血酶活性的影響。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本文描述了用于確定第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物中第一反應(yīng)組 分或第二反應(yīng)組分的活性或官能度的方法，其包括步驟(a)可逆地抑制第一反 應(yīng)組分以產(chǎn)生具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物；(b)當(dāng)評(píng)估第 一反應(yīng)組分活性時(shí)，往混合物中加入過(guò)量的第二反應(yīng)組分，或當(dāng)評(píng)估第二反應(yīng) 組分的活性時(shí)，加入過(guò)量的第一反應(yīng)組分；(C)可逆地活化第一反應(yīng)組分；(d)允
許第一反應(yīng)組分與混合物中的第二反應(yīng)組分和過(guò)量的第二反應(yīng)組分反應(yīng)，或允
許第一反應(yīng)組分與混合物中的第二反應(yīng)組分和過(guò)量的第一反應(yīng)組分反應(yīng)；以及(e) 確定最初存在于干混合物中的第一或第二反應(yīng)組分的活性或官能度。
7發(fā)明詳述
如在上面討論的那樣，為了確定;ML酶和纖維蛋白原的未反應(yīng)混合物(例 如以粉末形式或非7K性懸浮液，諸如乙醇懸浮液的形式)中凝血酶的活性，需要 使蛋白質(zhì)再水合化并且對(duì)于凝血酶和纖維蛋白原來(lái)說(shuō)需要溶解于7K化介質(zhì)中， 以得到灌f血酶活性的精確測(cè)量。然而， 一旦混合物與水化介質(zhì) 劍蟲(chóng)，任何^l軍 的凝血酶和纖維蛋白原將反應(yīng)而形成即刻的凝塊，并且任何可利用的^疑血酶將 結(jié)合至凝塊并不離離地供其測(cè)量利用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，暫時(shí)抑制性的溶液或可逆地抑制未反應(yīng)混合物中凝血 酶活性，從而避免纖維蛋白凝塊的形成，直到凝血酶和纖維蛋白原完全溶解。 通過(guò)抑制凝血酶活性，避免了即刻的凝塊形成并且凝血酶可以游離地溶解于水 性水合介質(zhì)中并保持供測(cè)量利用。
例如可以通過(guò)調(diào)節(jié)凝血酶的堿性環(huán)境來(lái)達(dá)到對(duì)湊ML酶活性的暫時(shí)或可逆的 抑制。例如，這可以通過(guò)在抑制性的溶液或失活溶液，即具有約8.5至11.5、優(yōu) 選約9.5至10.5、以及更雌約10的pH范圍的堿性溶液中重構(gòu)或水合未反應(yīng) 的MffiL酶和纖維蛋白原以形成第一溶^^完成。表1顯示了 pH對(duì)咴復(fù)的達(dá)恤酶 活性的影響。當(dāng)失活溶液的堿性是pH 10時(shí)，觀察到最大的經(jīng)咴復(fù)的凝血酶活 性。在9.5至10.5的pH范圍內(nèi)，達(dá)到了最大恢復(fù)的湊恤酶活性的至少80%。在 低于9.5和大于10.5的pH 7jC平時(shí)，最大恢復(fù)的凌恤酶活性隨著pH水平更偏離 IO而斷氏。在9,25的pH水平或更低時(shí)，在水合過(guò)程中觀察到了凝i央形成的證 據(jù)并且可以解釋在接近中性劍牛的更低pH值時(shí)觀測(cè)到降低的最大恢復(fù)凝血酶 活性。在酸性剝牛下，例如pH4或5時(shí)，最大恢復(fù)的; 酶活性顯著地低于在 堿性劍牛下所觀察到的，這可能是凝血酶不可逆失活的指示。
抑制性的溶液或失活溶液可以是堿性溶液或緩沖的堿性溶液，包括但不限 于碳麟、TRIS堿、硼酸鹽、甘氨酸、磷麟、甲胺、2-(環(huán)BS氨萄乙磺酸 (CHES)、 H環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(環(huán)己基氨萄-2-羥基-1-丙磺酸 (CAPSO)溶液。
一旦凝血酶和纖維蛋白原完封也溶解于抑帝雌的溶液或失活的溶液中，可 將第一溶液或其部分與含有已知量纖維蛋白原(優(yōu)選具有過(guò)量纖維蛋白原)的 第二溶^夜混合以形成第三溶液，同時(shí)4吏pH保持在約8.5至11.5、伏選約9.5至 10.5、以及更 約10。由于利用了過(guò)量的纖維蛋白原，因此混合物中凝血酶的量是纖維蛋白凝±央形成的限制速率的反應(yīng)物，從而確保IML酶的活性與凝土央 形成速率強(qiáng)相關(guān)。如果纖維蛋白原不是過(guò)量的，凝固速率會(huì)取決于凝血酶和纖 維蛋白原兩者。
此后，例如可以iBl將第三溶液的pH調(diào)節(jié)至其中凝血酶活性不再穀柳 制的范圍，即約6.0至小于8.5、雌約7.0至小于8.5、以及更 約7.5鄉(xiāng) 轉(zhuǎn)凝血酶活性?；蛘?，可將具有溶解蛋白或其部分的失活溶液即第一溶液與在 第二^#液中的已知量的纖維蛋白原、，過(guò)量的纖維蛋白原混合，以形成第三 溶液，由此同時(shí)逆轉(zhuǎn)凝血酶活性的抑制。第二溶液的實(shí)例包括但不限于 TRIS-HC1、咪唑、4-(2-羥乙基)哌眷1-乙磺酸(HEPES)、磷酸鹽、巴比妥、4-嗎啉基丙磺酸(MOPS)、 3-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、 1,4-哌嗪二乙磺酸 (PIPES)、 N,N-雙(2-羥乙萄-2-氨基乙磺酸(BES)、檸檬離或碳酉敏的緩沖溶液。
第二溶液的體積和緩沖能力應(yīng)該是當(dāng)加入至嘴一溶液時(shí)足以得到具有約 6.0至小于8.5、雌從7.0至小于8.5、以及更雌約7.5的PH的第三溶液的。 例如，當(dāng)?shù)诙芤旱哪枬舛仁羌s25mM至500 mMTRIS-HCl緩沖液以及， 約100mM至150 mM TRIS-HC1緩沖，夜時(shí)，例如，第一和第二溶液的體積比典
型地是約l: l至l: 20、以^&tm在約l: 4至1: 10的范圍。
可以應(yīng)用具有機(jī)械端點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的凝結(jié)物分析儀諸如Diagnostica Stago ST4凝結(jié)物分析儀來(lái)檢測(cè)凝塊的形成，或檢測(cè)由于纖維蛋白凝i央形成而致的混 濁度變化的裝置來(lái)確定凝血酶活性。在失活溶液中的溶解蛋白可以在這些裝置 之一中與第二溶液混合，并且測(cè)量;疑固的時(shí)間，然后將其與已知凝血酶活性的 凝固時(shí)間相關(guān)聯(lián)。
另一種可以測(cè)量湊m酶活性的方法是應(yīng)用凝血酶的發(fā)色或發(fā)熒光的蛋白底 物。在這一方法中，將溶解的凝血酶與過(guò)量的發(fā)色或發(fā)熒光的底物混合。凝血 酶將切害臓物，從而釋放可在分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)中監(jiān)測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光 團(tuán)。發(fā)色或發(fā)熒光的底物的實(shí)例分別包括P-Ala-Gly-Arg-p-硝基苯胺雙醋酸酯和 Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z=^m 、 AMC:7-氨基-4-甲基香豆素?？蓪⑨尫虐l(fā)色 團(tuán)或熒光團(tuán)的速率與凝血酶的話性相關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以ffl31調(diào)節(jié)凝血酶的堿性環(huán)境抑制灌她酶活性來(lái) 測(cè)量未反應(yīng)混合物中纖維蛋白原的官能度。例如，這可以通過(guò)在抑制性的溶液 或失活溶液，即具有約8.5至11.5、雌約9.5至10.5、以及更雌約10的pH
9范圍的減性溶液中重構(gòu)或水化凝血酶和纖維蛋白原的混合物以形成第一溶液來(lái) 完成。抑制性的溶液或失活溶液可以是堿性溶液或緩沖堿性溶液，包括但不限
于碳麟、TRIS(3(羥甲基)氨基甲夠堿、硼鵬、甘氨酸、磷麟、甲胺、2<環(huán) aS氨基)乙磺醆CHES)、 3-(環(huán)己基氨基)-l-丙磺敏CAPS)或3-(環(huán)己基氨萄-2-羥基-l-丙磺敏CAPSO)溶液。此外或任選地，可將凝血,制劑，諸如比{妒 定CAngiomax)加入到抑制性的溶^夜或失活溶液或第一溶液中以達(dá)到最大的灌是血 酶活性抑制，從而允許大多數(shù)纖維蛋白原溶解，以用于隨后的測(cè)試。凝血酶抑 律躋啲其它實(shí)例包括抗湊ML酶、肝素、低舒量肝素、低分子量肝素類似物、 阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊諾加群、達(dá)比加群、水蛭素(hirudan)及 水蛭素(hirudan)衍生物，諸如重組的7K蛭素和地西盧定。
一旦凝血酶的活性受至柳制，纖維蛋白原的活性可以通過(guò)如下確定將第 一溶液或其部分與具有已知量湊ML酶、tt^過(guò)量的凝血酶的第二溶液混合，以 形,三溶液，同時(shí)使pH保持在約8.5至11.5、 im約9.5至10.5、以及更優(yōu)
選約10。禾,了過(guò)量的凝血酶，因此混合物中纖維蛋白原的量是纖維蛋白凝i央 形成的限制速率的反應(yīng)物，從而確保纖維蛋白原的濃度與凝i央形成速率強(qiáng)相關(guān)。 如菊 酶不是過(guò)量的，貝,固速率會(huì)取決于湊ML酶和纖維蛋白原兩者。
此后，例如可以通過(guò)將第三溶液的pH調(diào)節(jié)至其中凝血酶活性不再受到抑 制的范圍，艮卩約6.0至小于8.5、,約7.0至小于8.5、以及更1，約7.5而逆 轉(zhuǎn)凝血酶活性?；蛘?，可將具有溶解蛋白的失活溶液或其部分即第一溶液與具
有已知量凝血酶、im過(guò)量的凝血酶的第二溶液混合，以形成第三溶液，由此
同時(shí)逆轉(zhuǎn)凝血酶活性的抑制。第二溶液的實(shí)例包括但不限于pH約為7.5的 TRIS-HC1、咪唑、4-(2-羥乙基)哌卩秦1-乙磺酸(HEPES)、磷酸鹽、巴比妥、4-嗎啉基丙磺酸(MOPS)、 3-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、 1,4-哌嗪二乙磺酸 (PIPES)、 N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺斷BES)、禾封蒙fr雄或碳f趨的緩沖溶液。
可以應(yīng)用具有機(jī)械端點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的凝結(jié)物分析儀諸如Dmgnostica Stago ST4凝結(jié)物分析儀來(lái)檢測(cè)凝i央形成，或檢測(cè)由于纖維蛋白凝i央形成而致的混濁 度變化的裝置來(lái)確定纖維蛋白原的官能度。在失活^#液中的溶解蛋白可以在這 些裝置之一中與第二溶液混合，并且測(cè)量凝固的時(shí)間，然后將其與已知纖維蛋 白原官能度的凝固時(shí)間相關(guān)聯(lián)。
或者，可以通過(guò)應(yīng)用凝血,制劑諸如比伐盧定( )抑制凝血酶活性而確定纖維蛋白原的官能度。任選地，可以結(jié)合4OT;疑血酶的抑制劑來(lái)調(diào)節(jié) 凝血酶的堿性環(huán)境。凝血酶抑制劑的其它實(shí)例包括..抗凝血酶、肝素、低分子 量肝素、低分子量肝素類似物、阿戈托班、美拉加群、依非加群、糾若加群、
達(dá)比加群、水蛭素(hirudan)及水蛭素(hirudan)衍生物，諸如重組的水蛭素 和地西盧定。 一旦;疑血酶的活性受到抑制，可以ffiil能夠作用于纖維蛋白原形 成凝土^f旦不受到凝血Wl]制劑影響的類凝血酶來(lái)確定纖維蛋白原的官能度。類 凝血酶的實(shí)例包括但不限于巴曲斷得自南美響尾蛇大具竅蝮蛇(Bothrops atrox) 的毒銜和安克洛瞰得自紅口 ,的毒銜。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是以未反應(yīng)混合物形式被加載至載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)裝置時(shí)，例如 混合物可以呈粉末形式，其中蛋白質(zhì)是干燥的或經(jīng)干燥的，可以通過(guò)用非水性 液體提取蛋白來(lái)完成7K合及溶解之前的蛋白的移出，戶/F述非水性液體包括但不 限于全氟化的碳?xì)浠衔铮T如HFE-7000、 HFE7001、 HFE7003、 HFE-7300 和PF-5060(可從Mimiesota的3M商購(gòu)得到)，以及可以禾U用蛋白質(zhì)不會(huì)溶解于 其中的任何其它載 體，諸如乙醇、乙醚或其它有機(jī)液體。 一旦用非水性溶 劑提取了蛋白質(zhì)，就可以如上面描述的那樣測(cè)量凝血酶的活性或纖維蛋白原的 官能度。
或者，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被裝載至載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)裝置時(shí)，可以不用移出蛋白質(zhì) 而如上面所描述的那樣測(cè)量凝血酶的活性或纖維蛋白原的官能度。例如，可通 過(guò)將在其上具有蛋白質(zhì)的載體、基質(zhì)或醫(yī)學(xué)^S直接置于抑制性的溶液或失活 溶液中而將蛋白質(zhì)水合化，所述溶液可以用于作為如上面所描述那樣測(cè)量凝血 酶活性或纖維蛋白原功能的樣本。
權(quán)利要求
1.用于確定在第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的未反應(yīng)混合物中第一反應(yīng)組分或第二反應(yīng)組分的活性或官能度的方法，其包括以下步驟(a)可逆地抑制第一反應(yīng)組分以產(chǎn)生具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物；(b)當(dāng)評(píng)估第一反應(yīng)組分的活性時(shí)，往混合物中加入已知量的第二反應(yīng)組分，或當(dāng)評(píng)估第二反應(yīng)組分的活性時(shí)，加入已知量的第一反應(yīng)組分；(c)可逆地活化第一反應(yīng)組分；(d)允許第一反應(yīng)組分與最初存在于混合物中的第二反應(yīng)組分和已知量的第二反應(yīng)組分反應(yīng)，或允許第一反應(yīng)組分與最初存在于混合物中的第二反應(yīng)組分和已知量的第一反應(yīng)組分反應(yīng)；以及(e)確定最初存在于混合物中的第一或第二反應(yīng)組分的活性或官能度。
2. 才又利要求1的方法，其中第一反應(yīng)組分是凝血酶并且第二反應(yīng)組分是纖 維蛋白原。
3. ^l利要求2的方法，其中IElfiL酶是重組體或從動(dòng)物或人類得到，并且纖 維蛋白原是重組體^;人動(dòng)物或y^^得到。
4. ^^利要求2的方法，其中同時(shí)進(jìn)^^驟(b)和(c)。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述混合物呈粉末形式，并且可逆抑制第一反 應(yīng)組分的步驟包括在具有8.5至11.5的pH范圍的抑制性的溶液麟一溶液中 重構(gòu)第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液麟一溶液具有9.5至10 的pH。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述抑制性的溶液，一溶液具有約10的pH。
8. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液麟一溶液包含選自碳酉鄉(xiāng)、 TRIS(3(羥甲基)氨基甲烷)堿、硼酸鹽、甘氨酸、磷酸鹽、甲胺、2-(環(huán)BS氨萄 乙磺酸(CHES)、 3-(環(huán)戰(zhàn)氨基)-l-丙磺敏CAPS)或3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-l-丙 磺敏CAPSO)中的至少一禾中組分的堿性溶液。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中已知量的第二反應(yīng)組分在第二溶液中，所述第 二溶液能夠使具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至約6.0至小于8.5 。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中已知量的第二反應(yīng)組分在第二溶液中，所述 第二溶液能夠使具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液， 一溶液的pH ^j氐至約7.0至小于8.5。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中已知量的第二反應(yīng)組分在第二溶液中，所述 第二溶液能夠使具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液或第 一溶液的pH斷氐至約7.5。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中倉(cāng)辦降低抑制性的溶液麟一溶液pH的第 二溶液是選自TRIS-HC1、咪唑、4-(2-羥乙基)哌漆1-乙磺^HEPES)、磷酸鹽、 巴比妥、4-嗎啉基丙磺酸(MOPS)、 3-嗎啉-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、 1,4-哌嗪二 乙磺,IPES)、 N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、檸檬,雄 酸鹽中的 至少一種組分的溶液。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中能夠降低抑制性的溶液麟一溶液pH的第 二溶液包含25mM至500mM的TRIS-HC1緩沖液。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中能夠降低抑制性的溶液麟一溶液pH的第 二溶液包含100mM至150mM的TRIS-HC1緩沖液。
15. ^X利要求9的方法，其中在步驟(b)中將已知過(guò)量的第二反應(yīng)組分加入 到具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液麟一溶液中。
16. 權(quán)利要求2的方法，其中歩驟(b)包括將具有已知量的第二反應(yīng)組分的 第二^t液加入到具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液， 一溶液中，以形成具有8.5至11.5的pH范圍的第三溶液。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中可逆地活化第一反應(yīng)組分的歩驟(c)包括將第 三溶液的pH調(diào)節(jié)至約6.0至8.5 。
18. 權(quán)利要求9的方法，其中通il動(dòng)力學(xué)凝固分析確定最初存在于混合物 中的第一職二反應(yīng)組分的活性或官會(huì)渡，所述動(dòng)力學(xué)凝固分析測(cè)量凝結(jié)時(shí)間， 該凝結(jié)時(shí)間與第一或第二活性組分的已知活性或官能度相關(guān)聯(lián)。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中將第一，二活性組分的活性或官能度轉(zhuǎn)換 為活性單位或官能團(tuán)數(shù)量。
20. 權(quán)利要求9的方法，其中應(yīng)用比濁法、艦測(cè)渾法、粘度法和機(jī)械端 點(diǎn)分析方法確定最初存在于混合物中的第一或第二反應(yīng)組分的活性或官能度。
21. !^利要求2的方法，其中第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物以粉末形式位于基質(zhì)上，并且通過(guò)將具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分混合物的基質(zhì)置于具有已知量第二反應(yīng)組分的第二溶液中來(lái)實(shí)施步驟(b)。
22. 權(quán)利要求2的方法，其中第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的混合物是非 水性的懸浮液。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述非水性的懸浮液包含醇、MlftL酶和纖維 蛋白原。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述醇是乙醇。
25. 用于確定湊Ml酶和纖維蛋白原的未反應(yīng)混合物中纖維蛋白原的官能度 的方法，其包括以下步驟(a) 通過(guò)在具有8.5至11.5的pH范圍的抑制性的溶液或第一溶液中重構(gòu)凝 血酶和纖維蛋白原的混合物來(lái)抑制湊ML酶而產(chǎn)生具有失活的湊是血酶和纖維蛋白 原的混合物；(b) 往混合物中加入含有已知量凝血酶的第二溶液，所述第二溶液會(huì),使具 有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液麟一溶液的pH降低 至約6.0至小于8.5;(C)允許所述凝血酶與所述纖維蛋白原反應(yīng)；以及 (d)確定最初存在于混合物中的纖維蛋白原的官肯巨度。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中抑制第一反應(yīng)組分的步驟還包括添加湊恤酶 抑制劑。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述的湊Ml酶抑制劑選自抗凝血酶、肝素、 低分子量的肝素、低分子量的肝素類似物、磺達(dá)肝素、阿戈托班、美拉加群、 依非加群、伊諾加群、達(dá)比加群、比伐盧定、水蛭素及水蛭素衍生物例如重組 水蛭素和地西盧定。
28. 用于確定凌ML酶和纖維蛋白原的未反應(yīng)混合物中纖維蛋白原官能度的 方法，其包括以下步驟(a) ilil在具有8.5至11.5的pH范圍的抑制性的溶液或第一溶液中重構(gòu)凝 血酶和纖維蛋白原的混合物來(lái)抑制甚Ml酶而產(chǎn)生具有失活的)疑血酶和纖維蛋白 原的混合物；(b) 往混合物中加入已知量的類凝血酶，以及任選地將具有失活的第一反應(yīng)組分和第二反應(yīng)組分的抑制性的溶液麟一溶液的pH斷氐至約6.0至小于8.5;(c) 允許類凝血酶與纖維蛋白原反應(yīng)；以及(d) 確定最初存在于混^tl中的纖維蛋白原的官會(huì)渡。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中抑制第一反應(yīng)組分的步驟還包括添加凝血酶 抑制劑。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中所述凝血,制齊腿自.-抑ML酶、肝素、 低分子量的肝素、低分子量的肝素類似物、磺達(dá)肝素、阿戈托班、美拉加群、 依非加群、伊諾加群、達(dá)比加群、比伐盧定、水蛭素及水蛭素衍生物例如重組 水蛭素和地西盧定。
31. 權(quán)利要求28的方法，其中所述類灌l(xiāng)Jfe酶是巴曲酶或安克洛酶。
32. 用于確定Ml&L酶和纖維蛋白原的未反應(yīng)混合物中凌ML酶活性的方法， 其包括以下步驟(a) 通過(guò)在具有8.5至11.5的pH范圍內(nèi)的抑制性的溶液，一溶液中重構(gòu) MifiL酶和纖維蛋白原的混合物來(lái)可逆i也抑制凝血酶而產(chǎn)生具有失活凝血酶和纖 維蛋白原的混合物；(b) 加入會(huì),j妙;f述抑制性的溶液麟一溶液的pH斷氐至約6.0至小于8.5 的第二溶液；(c) 允許類纖維蛋白原與凝血酶反應(yīng)；以及(d) 評(píng)估凝塊的形成。
33. 用于確定灌Ml酶和纖維蛋白原的未反應(yīng)混合物中Ml&l酶活性的方法， 其包括以下歩驟(a) 可逆地抑制湊ML酶而產(chǎn)生具有失活的湊ML酶和纖維蛋白原的混合物；(b) 往混合物中加入已知量的發(fā)色或發(fā)熒光的凝血酶底物； (C)可艦活化達(dá)她酶；(d) 允許Wl酶與所述發(fā)色戯熒光的凝血酶底物反應(yīng)；(e) 確定最初存在于混合物中的;疑血酶的活性。
全文摘要
描述了用于在存在纖維蛋白原的情況下測(cè)量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情況下測(cè)量纖維蛋白原功能的方法。
文檔編號(hào)G01N33/86GK101680905SQ200880000199
公開(kāi)日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日
發(fā)明者A·德安格利斯, A·戈曼, I·努爾, L·巴, R·梅德勒 申請(qǐng)人:伊西康公司;奧姆里克斯生物藥品公司