專利名稱：一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番鴨細(xì)小病毒病是侵害雛番鴨的一種急性或亞急性傳染病，它具有高度傳染性， 發(fā)病率和死亡率都很高，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，主要發(fā)生于1-3周齡的雛番鴨，故稱“三 周病”。臨床上以氣喘、腹瀉、生長遲緩、運(yùn)動失調(diào)和出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為特征。我國早在1987 年，在福建飼養(yǎng)番鴨的部分地區(qū)就發(fā)現(xiàn)本病，它具有流行性，以后廣東和浙江相繼有發(fā)病流 行的報道。近幾年來，江蘇、安徽等地也時有發(fā)生。世界上其他國家也有發(fā)病流行的報道， 1989年秋，在法國西部集約化養(yǎng)鴨地區(qū)飼養(yǎng)的番鴨群也曾暴發(fā)本病，死亡率高達(dá)80%。對死亡的番鴨如果處理不當(dāng)，往往造成病毒的蔓延，產(chǎn)生更大的危害，目前社會上 本病尚無特殊的抗病毒藥物來防治番鴨細(xì)小病毒病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清 的方法，包括以下步驟
1)從病變的番鴨中獲得番鴨細(xì)小病毒；
2)制備一免番鴨細(xì)小病毒抗原；
3)制備二免番鴨細(xì)小病毒抗原；
4)用二免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗； 5)用一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗； 6)用制備得到的抗原與疫苗免疫番鴨，得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清。步驟1)所述的番鴨細(xì)小病毒的制備方法包括以下步驟
A、在無菌的條件下取有典型病變的病鴨的心臟、肝臟、膽囊、腎、脾、胰腺、腸道、十二指 腸、直腸，放入組織機(jī)搗碎；
B、取粉碎的組織，加入75%生理鹽水混勻得到組織懸液，其中粉碎的組織占組織懸液 總重的10% 20%，生理鹽水占組織懸液總重的80 90% ；
C、取組織懸液放入-20°C -40°C冰箱中使組織液完全凍結(jié)為止，然后迅速放入 370C -40°C水浴鍋中融化，反復(fù)凍融3 5次；
D、將反復(fù)凍融后的混懸液離心；
E、取離心后的上清液用孔徑為0.22 um的濾菌膜過濾；
F、取除菌后的濾液，分別按每毫升濾液中加入2000單位-2500單位青霉素和2000單 位-2500單位鏈霉素，然后放入0 4°C冰箱中備用。步驟2)所述的一免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟
A、用濃度為0. 75%的生理鹽水中稀釋步驟1)制備得到番鴨細(xì)小病毒，稀釋100倍，得到稀釋液，
B、用0.lml-0. 2ml的劑量接種12 14日齡的鵝胚的絨毛尿囊腔中；
C、接種后選取在48 120h之間具有胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨 毛尿膜有輕度水腫的鵝胚，取其尿囊液；
D、在每毫升尿囊液中加入2000單位-2500單位的青霉素和2000單位-2500單位鏈霉 素，即 形成為一免番鴨細(xì)小病毒抗原，并將放入冰箱中在0 4°C條件下儲藏備用。步驟3)所述的二免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟
A、取一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備中經(jīng)接種番鴨種毒后死亡的鵝胚體放入組織搗碎 機(jī)中粉碎，取粉碎后的組織加入生理鹽水混合，其中粉碎的組織占組織懸液總重的10% 20%，生理鹽水占組織懸液總重的80 90% ；
B、將混合組織懸液進(jìn)行離心；
C、取離心后的上清液，在上清液中按每毫升分別加入2000單位-2500單位的鏈霉素和 2000單位-2500單位)青霉素，
D、再加入總重的0.35%-0. 4%的甲醛，制成滅活疫苗，即為二免番鴨細(xì)小病毒抗原，放 入0 4°C冰箱備用。步驟4)所述的番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗的制備方法包括以下步驟按 照佛氏不完全佐劑二免番鴨細(xì)小病毒抗原=1:1的比例進(jìn)行充分混合，即得到番鴨細(xì)小病 毒佛氏不完全佐劑疫苗。步驟5)所述的番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗的制備方法包括以下步驟按照 佛氏完全佐劑二免番鴨細(xì)小病毒抗原=1:1的比例進(jìn)行充分混合，即得到番鴨細(xì)小病毒佛 氏完全佐劑疫苗。步驟6)所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法包括以下步驟
A、選擇健康無病的20日齡的番鴨，用一免佛氏完全佐劑疫苗在其頸部、腿部皮下進(jìn)行 多點(diǎn)注射，注射量均為lml-2ml ；
B、7天后用二免佛氏不完全佐劑疫苗進(jìn)行皮下、腿部多點(diǎn)注射，注射量均為lml-2ml；
C、再經(jīng)7天后用不加佐劑的二免抗原進(jìn)行皮下、腿部三免，注射量均為lml-2ml；
D、三免注射后每隔5天采血一次，并進(jìn)行抗體效價的檢測，30天后當(dāng)抗體效價在1 64 1 :128范圍時，在無菌條件下采集番鴨血；
E、將采集的血放入無菌容器中進(jìn)行自然分離，吸取血清；
F、在得到的血清中加入1000單位-2000單位的青霉素和1000單位-2000單位鏈霉素， 同時加入血清總重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清；
G、將得到的抗番鴨細(xì)小病毒的血清分裝，經(jīng)無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和抗體效價 檢測后，冷凍保存。本發(fā)明有益效果采用本發(fā)明方法制備得到的血清的效價高，1 64以上，對 預(yù)防和治療番鴨細(xì)小病毒具有顯著的療效，預(yù)防率為96. 6%，治愈率70%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從病變的番鴨中獲得番鴨細(xì)小病毒 番鴨細(xì)小病毒的制備方法包括以下步驟Α、在無菌的條件下取有典型病變的病鴨的心臟、肝臟、膽囊、腎、脾、胰腺、腸道、十二指 腸、直腸，放入組織機(jī)粉碎；
B、取占組織懸液總量20%的粉碎組織與占組織懸液總量80%的濃度為0.75%的生理鹽 水，混勻，得到組織懸液；
C、取組織懸液放入-20°C冰箱中冷凍，然后迅速放入37°C水浴鍋中融化，反復(fù)凍融3
次；
D、將反復(fù)凍融后的混懸液在5000r/min條件下離心20min；
E、取離心后的上清液用孔徑為0.22 um的濾菌膜過濾；
F、取除菌后的濾液，分別按每毫升濾液中加入2000單位的青霉素和2000單位的鏈霉 素，得到番鴨細(xì)小病毒，然后放入4°C冰箱中備用。實(shí)施例2 —免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備 一免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟
A、用濃度為75%的生理鹽水中制備得到番鴨細(xì)小病毒，稀釋100倍，得到稀釋液；
B、用0.Iml的劑量接種12日齡的鵝胚的絨毛尿囊腔中；
C、接種后選取在96h具有胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨毛尿膜有輕 度水腫的鵝胚，取其尿囊液；
D、在每毫升尿囊液中加入2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，即形成為一免番鴨細(xì) 小病毒抗原，并將放入冰箱中在4°C條件下儲藏備用。實(shí)施例3 二免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備 二免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟
A、取一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備中經(jīng)接種番鴨種毒后死亡的鵝胚體放入組織搗碎機(jī) 中粉碎，取粉碎后的組織加入生理鹽水混合，其中粉碎的組織占組織懸液總重的10%，生理 鹽水占組織懸液總重的90% ；
B、將混合組織懸液進(jìn)行離心，離心條件5000r/min離心20min；
C、取離心后的上清液，在上清液中按每毫升分別加入2000單位的鏈霉素和2000單位 的青霉素，
D、再加入總重0.4%的甲醛，制成滅活疫苗，即為二免番鴨細(xì)小病毒抗原，放入4°C冰箱 備用。實(shí)施例4番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗的制備
番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗的制備方法為取Iml的佛氏不完全佐劑，加入Iml 二免番鴨細(xì)小病毒抗原，充分混合，即可。實(shí)施例5番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗的制備
番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗的制備方法為取Iml的佛氏完全佐劑，加入Iml—免 番鴨細(xì)小病毒抗原，充分混合，即可。實(shí)施例6抗番鴨細(xì)小病毒血清的制備 制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法包括以下步驟
A、選擇健康無病的20日齡的番鴨，用一免佛氏完全佐劑疫苗在其頸部、腿部皮下10個 點(diǎn)進(jìn)行注射，注射量均為Iml ；
B、7天后用二免佛氏不完全佐劑疫苗在皮下、腿部10個點(diǎn)進(jìn)行注射，注射量均為Iml；C、再經(jīng)7天后用不加佐劑的二免抗原在皮下、腿部10個點(diǎn)進(jìn)行注射，注射量均為Iml；
D、在第三次注射后每隔5天采血一次，并進(jìn)行抗體效價的檢測，30天后當(dāng)抗體效價在 1 128時，在無菌條件下采集番鴨血；
E、將采集的血放入無菌容器中進(jìn)行自然分離，吸取血清；
F、在得到的血清中加入1000單位的青霉素和1000個單位的鏈霉素，同時加入血清總 重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清；
G、將得到的抗番鴨細(xì)小病毒的血清分裝，經(jīng)無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和抗體效價 檢測后，冷凍保存。實(shí)施例7成品的檢測 A.無菌檢驗(yàn)
取血清按0. 1 mL分別接種于普通瓊脂斜面、血平板、營養(yǎng)肉湯、厭氧肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 48 h應(yīng)無菌生長。結(jié)果顯示沒有菌生長。B.安全檢驗(yàn)
取健康的20日齡的番鴨10只，每只皮下注射2ml，觀察7-10天，結(jié)果這這些實(shí)驗(yàn)番鴨 全部健活。C.效價檢測
用瓊脂凝膠沉淀法檢測血清效價，結(jié)果顯示效價在1:64以上。
D.效力檢驗(yàn)
取20日齡30只，分成三組組。1組為血清組，2組為生理鹽水組對照組，3組為空 白組對照，1、2組同時以番鴨細(xì)小病毒強(qiáng)毒攻擊，攻毒24h血清組注射血清制品1 mL/ 只，生理鹽水組注射生理鹽水1 mL/只，觀察10 d,血清組存活100 %，空白組和死亡70 % 100 %。E.保存期
該制品在_ 15 °C條件下保存3年仍有效。
權(quán)利要求
一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，所述的制備方法包括以下步驟1)從病變的番鴨中獲得番鴨細(xì)小病毒；2)制備一免番鴨細(xì)小病毒抗原；3)制備二免番鴨細(xì)小病毒抗原；4)用二免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗；5)用一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗； 6)用制備得到的抗原與疫苗免疫番鴨，得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟1)所述 的番鴨細(xì)小病毒的制備方法包括以下步驟A、在無菌的條件下取有典型病變的病鴨的心臟、肝臟、膽囊、腎、脾、胰腺、腸道、十二指 腸、直腸，放入組織機(jī)搗碎；B、取粉碎的組織，加入75%生理鹽水混勻得到組織懸液，其中粉碎的組織占組織懸液 總重的10% 20%，生理鹽水占組織懸液總重的80 90% ；C、取組織懸液放入-20°C _40°C冰箱中冷凍，使組織液完全凍結(jié)為止，然后迅速放入 370C -40°C水浴鍋中融化，反復(fù)凍融3 5次；D、將反復(fù)凍融后的混懸液離心；E、取離心后的上清液用孔徑為0.22 um的濾菌膜過濾；F、取除菌后的濾液，分別按每毫升濾液中加入2000單位-2500單位(青霉素和2000單 位-2500單位鏈霉素，然后放入0 4°C冰箱中備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟2)所述 的一免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟A、用濃度為0.75%的生理鹽水中稀釋步驟1)制備得到番鴨細(xì)小病毒，稀釋100倍，得 到稀釋液，B、用0.lml-0. 2ml的劑量接種12 14日齡的鵝胚的絨毛尿囊腔中；C、接種后選取在48 120h之間具有胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨 毛尿膜有輕度水腫的鵝胚，取其尿囊液；D、在每毫升尿囊液中加入2000單位-2500單位的青霉素和2000單位-2500單位鏈霉 素，即形成為一免番鴨細(xì)小病毒抗原，并將放入冰箱中在0 4°C條件下儲藏備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟3)所述 的二免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備方法包括以下步驟A、取一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備中經(jīng)接種番鴨種毒后死亡的鵝胚體放入組織搗碎 機(jī)中粉碎，取粉碎后的組織加入生理鹽水混合，其中粉碎的組織占組織懸液總重的10% 20%，生理鹽水占組織懸液總重的80 90% ；B、將混合組織懸液進(jìn)行離心；C、取離心后的上清液，在上清液中按每毫升分別加入2000單位-2500單位的鏈霉素和 2000單位-2500單位)青霉素，D、再加入總重的0.5%-0. 4%的甲醛，制成滅活疫苗，即為二免番鴨細(xì)小病毒抗原，放入 0 4°C冰箱備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟4)所述的番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗的制備方法包括以下步驟按照佛氏不完全佐劑二 免番鴨細(xì)小病毒抗原=1:1的比例進(jìn)行充分混合，即得到番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫田ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟5)所述 的番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗的制備方法包括以下步驟按照佛氏完全佐劑二免番 鴨細(xì)小病毒抗原=1:1的比例進(jìn)行充分混合，即得到番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，其特征在于步驟6)所述 的制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法包括以下步驟A、選擇健康無病的20日齡的番鴨，用一免佛氏完全佐劑疫苗在其頸部、腿部皮下進(jìn)行 多點(diǎn)注射，注射量均為lml-2ml ；B、7天后用二免佛氏不完全佐劑疫苗進(jìn)行皮下、腿部多點(diǎn)注射，注射量均為lml-2ml；C、再經(jīng)7天后用不加佐劑的二免抗原進(jìn)行皮下、腿部三免，注射量均為lml-2ml；D、三免注射后每隔5天采血一次，并進(jìn)行抗體效價的檢測，30天后當(dāng)抗體效價在1 64 1 :128范圍時，在無菌條件下采集番鴨血；E、將采集的血放入無菌容器中進(jìn)行自然分離，吸取血清；F、在得到的血清中加入1000單位-2000單位的青霉素和1000單位-2000單位鏈霉素， 同時加入血清總重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清；G、將得到的抗番鴨細(xì)小病毒的血清分裝，經(jīng)無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和抗體效價 檢測后，冷凍保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備抗番鴨細(xì)小病毒血清的方法，包括以下步驟番鴨細(xì)小病毒的制備，一免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備，二免番鴨細(xì)小病毒抗原的制備，用二免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏不完全佐劑疫苗，用一免番鴨細(xì)小病毒抗原制備番鴨細(xì)小病毒佛氏完全佐劑疫苗，然后用制備得到的抗原與疫苗免疫番鴨，得到抗番鴨細(xì)小病毒的血清，采用本發(fā)明方法制備得到的血清的效價高，對預(yù)防和治療番鴨細(xì)小病毒具有顯著的療效，預(yù)防率為96.6%，治愈率70%左右。
文檔編號A61P31/20GK101961488SQ20101051308
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 韓改會 申請人:鄭州后羿制藥有限公司