專利名稱：載脂蛋白a1作為糖尿病標志物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種載脂蛋白A KApolipoprotein A I =ApoA I)用作檢測糖尿病的蛋白質(zhì)分子標記物的應用。
背景技術：
糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，世界發(fā)病率高達2 %，在發(fā)展中國家糖尿病的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)快速上升趨勢。在我國，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，糖尿病患病率日漸增高，目前我國糖尿病總人數(shù)超過4000萬，已經(jīng)成為糖尿病的重災區(qū)，每年用于糖尿病治療的醫(yī)療支出大為增加，這表明糖尿病已經(jīng)成為嚴重危害我國人民生命財產(chǎn)安全的敵人，并且是影響社會經(jīng)濟發(fā)展的一個重要因素，因此加大力度進行我國糖尿病的基礎研究具有戰(zhàn)略意義。糖尿病患者處于臨床糖尿病診斷前期可長達12年，大部分患者是在出現(xiàn)糖尿病急性或慢性并發(fā)癥后才得到診斷和治療的，而事實上早期發(fā)現(xiàn)、早期確診和早期治療才是讓他們恢復健康的關鍵，因而需要尋找到合適的標志物以實現(xiàn)糖尿病的早期發(fā)現(xiàn)，從而進一步實現(xiàn)糖尿病的早期確診和早期治療；以早期診斷和治療為目的去研究和尋找能夠用作預測和診斷糖尿病的蛋白質(zhì)分子標記物具有十分重要的意義。因此，本領域非常有必要通過各種途徑找到早期診斷糖尿病或預測糖尿病患病風險的標志物，以期為臨床診斷提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種載脂蛋白A KApolipoprotein A I =ApoA I)用作檢測糖尿病的蛋白質(zhì)分子標記物的應用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種載脂蛋白Al (ApoA I)或其蛋白片段作為糖尿病標志物的用途。在另一優(yōu)選例中，所述的脂蛋白Al用作檢測糖尿病或預測糖尿病發(fā)生的蛋白質(zhì)分子標記物。在另一優(yōu)選例中，所述的標志物是體液的標志物。在另一優(yōu)選例中，所述的體液為血清。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白片段的氨基酸序列為載脂蛋白Al所特有。在另一優(yōu)選例中，所述的載脂蛋白Al的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO 1或其中第2-17位氨基酸所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1或其中第2-17位氨基酸所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其編碼所述的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載脂蛋白Al或其蛋白片段的用途，用于制備檢測糖尿病的試劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑選自抗體、配體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑的用途，用于制備檢測糖尿病或區(qū)分糖尿病高危人群的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑是抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑，所述試劑是多克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測糖尿病的試劑盒，所述試劑盒包含容器，以及置于所述容器中的所述的試劑。在本發(fā)明的另一方面，提供一種測試條(如試紙或試紙條)，其包括固相載體，以及附著于所述固相載體上的所述的試劑。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了對載脂蛋白Al (ApoA I)母離子-子離子對(969. 5-804. 4)的質(zhì)譜多反應監(jiān)測技術的結果；其中，SN為正常健康對照組；DM為2型糖尿病患者組?？v坐標為輕肽除以重肽的比值，即該段肽EQLGPVTQEFWDNLEK在血中含量比上標準肽的比值。兩組做 t-test 檢驗，ρ 值為 0. 040425，< 0. 05，* 表示 ρ < 0. 05。圖2顯示了載脂蛋白Al蛋白的含特有肽段EQLGPVTQEFWDNLEK的MS2譜圖。圖3顯示了樣品條帶切割情況。圖 4 顯示 7 969. 5-618. 3 (y5) ,969. 5-804. 4 (y6) ,969. 5-951. 5 (y7), 969. 5-1080. 5 (y8)和969. 5-1039. 6 (ylO)共5個母離子-子離子對的RSD分布情況。其中，橫坐標表示RSD值，縱坐標表示相對比值。圖5為糖尿病血清中的Apo Al的ROC曲線分析圖。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和篩選，最終獲得一種對于指示糖尿病的發(fā)生或發(fā)展有用的標志物。所述的標志物是載脂蛋白Al (ApoA I)或其蛋白片段，其在糖尿病患者體液中的含量顯著低于正常人群，因此可用于診斷糖尿病或糖尿病患病風險。載脂蛋白Al脂蛋白是負責運輸脂質(zhì)的一類蛋白復合物，人體中脂蛋白(lipoprotein)由脂質(zhì) (lipid)和載脂蛋白(Apolipoprotein)以非共價鍵相結合，載脂蛋白在腸中合成，并且合成受一系列因子的影響，包括攝入食物的組成，荷爾蒙(如胰島素，胰高血糖素)，酒精的攝入以及很多藥物等。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理作用作為構成并穩(wěn)定脂蛋白的結構，是脂蛋白結構的支柱；修飾并影響與脂蛋白代謝有關的酶活性；作為脂蛋白受體的配體；參與脂蛋白與細胞表面脂蛋白受體的結合代謝過程。載脂蛋白種類很多，主要包括六大類，ApoA, ApoB, ApoC, ApoD, ApoE, ΑροΗ，其中ApoA，ApoB, ApoC各自又有幾種亞類。
載脂蛋白A I (ApoA I)是ApoA族的一種組分，是HDL中的主要載脂蛋白。其 Genebank 登錄號為GI :4557321，NCBI 的登錄號為:NP000030，Swissprot 登錄號為 P(^647，IPI號為:IPI00021841. 1，目前已知ApoA I在膽固醇代謝，血脂代謝中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)ApoA I 與磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(Phospholipid Transfer Protein, PLTP) 磷脂轉(zhuǎn)移蛋白是人體內(nèi)負責將脂質(zhì)從低密度脂蛋白轉(zhuǎn)移到高密度脂蛋白的一個蛋白質(zhì)， 它與動脈粥樣硬化以及冠狀動脈疾病的產(chǎn)生有關，10% PLTP的活性喪失就可以明顯降低動脈粥樣硬化的發(fā)生)的結合可以調(diào)節(jié)后者的活性，并且在高血脂癥中，ApoA I的含量與磷脂轉(zhuǎn)移蛋白的活性是呈線性相關的(Ryan JHenderson, Kishor M Wasan and Carlos G Leon, Journal of Lipid Research :47，1315-1321，2006)。此外，ApoA I 可以穩(wěn)定氧磷酶PON-l(paraoxonase-l)，后者可以阻止過氧化物的產(chǎn)生以及oxLDL的產(chǎn)生，oxLDL在內(nèi)皮細胞功能障礙、單核細胞趨化、濾泡細胞的形成以及血小板的碎裂即動脈粥樣硬化等過程中起作用。ApoA I還可以通過調(diào)節(jié)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，在膽固醇的代謝中起著重要作用。另外，HDL中的ApoA I還有抗炎癥以及抗氧化的作用(NicolasVUILLEUMIER，Emmanuel CHARBONNEY, Pascale ROUX-LOMBARD, etal. Journal of clinical science :115,25-33, 2008)。然而，目前還沒有將ApoA I作為糖尿病的分子標記的有關報道。載脂蛋白Al的蛋白片段基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，提供了來源于ApoA I的肽段(多肽)，所述的肽段是ApoA I蛋白所特有的，可良好地應用于作為糖尿病的分子標記物。較佳地，所述的肽段具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :1中第2_17位所示的氨基酸序列。本發(fā)明人分析了大量來源于ApoA I的肽段，經(jīng)鑒定這條肽段強度最好。檢測這條肽段的含量就可以直接地反映ApoA I蛋白的含量，方便、快捷且準確性高。編碼所述的ApoA I的肽段的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。由于所述的肽段是ApoA I蛋白所特有的，其對應的多核苷酸序列也是特有的?？赏ㄟ^常規(guī)的檢測核酸的方法來獲知待測樣品中所述的多核苷酸的含量。檢測多肽或核酸含量的方法是本領域人員所熟知的。例如，檢測多肽可借助于質(zhì)譜分析儀器等，或可通過狗stern Blot或ELISA等方法。檢測核酸包括PCR擴增、Northern Blot等方法。載脂蛋白Al或其蛋白片段的用途本發(fā)明人將正常健康對照組血清和2型糖尿病患者的血清樣品(均從上海市第六人民醫(yī)院糖尿病研究所取得)分別以乙醇沉淀法分級血清蛋白質(zhì)-溶液內(nèi)酶解-一體柱串聯(lián)質(zhì)譜分析和樣品切膠-串聯(lián)質(zhì)譜(LTQ-Orbi)技術對其中的蛋白質(zhì)進行鑒定并比較了其中蛋白質(zhì)的表達水平，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白Al (ApoA I)在糖尿病病人血清中的表達水平低于正常健康對照血清中的表達水平；通過質(zhì)譜多反應監(jiān)測技術，進一步證實并發(fā)現(xiàn)正常健康對照組與2型糖尿病患者組血清中載脂蛋白Al的表達水平存在差異表達。通過檢測正常健康對照以及2型糖尿病病人血清中ApoA I表達量，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) ApoA I在正常健康對照以及和2型糖尿病病人血清中存在差異表達，ApoA I在糖尿病病人血清中的表達水平低于正常健康對照血清中的表達水平；通過MS/MS檢測、搜庫、查找蛋白質(zhì)、buildsummary分析、MRM檢測定量ΑροΑΙ，進一步證實并發(fā)現(xiàn)正常健康對照組、2型糖尿病患者組的ApoA I表達水平存在差異表達。因此，本發(fā)明提供了一種ApoA I或其蛋白片段作為糖尿病標志物的用途。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，ApoA I作為糖尿病的血清檢測標志物。血清檢測取材方便、操作簡單、便于復查，患者易于接受，評估預后，指導治療?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，可以利用ApoA I蛋白或其蛋白片段(i)進行糖尿病的鑒別診斷、和/或易感性分析；( )評估相關人群的糖尿病治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評估相關人群糖尿病患病風險，早期監(jiān)測早期預防。其還可以用于制備特異性識別ApoA I的試劑，從而用于檢測ApoA I的存在與否以及存在量，作為糖尿病的判斷依據(jù)。識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑和試劑盒基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑。 任何可識別ApoA I或其蛋白片段的試劑均包含在本發(fā)明中，用作檢測糖尿病的標志物。所述的特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑例如是特異性結合ApoA I的抗體或配體。本發(fā)明還提供了一種特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑的用途，用于檢測糖尿病或糖尿病高危人群。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的試劑是抗ApoA I的抗體；更特別的例如是多克隆抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的抗原可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生，所述的動物如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511，1976 ； Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammer ling 等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。所述的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測標本中的ApoA I水平，從而用于診斷糖尿病或判斷患病風險(易感性)。利用所述的抗體，可以檢測體液中ApoA I的水平，因而可用于檢測糖尿病，可用于預測早期糖尿病的發(fā)生，或者用于制備檢測糖尿病的制劑或試劑盒等，用于制備預測早期糖尿病的發(fā)生的制劑或試劑盒等。本發(fā)明還提供了用于診斷糖尿病的試劑盒，該試劑盒包括特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑。所述的試劑例如是單克隆抗體或多克隆抗體。所述的試劑盒中還可含有用于免疫組織化學分析的試劑，所述的試劑例如第二抗體、染色劑、顯色劑等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等。更具體地，所述的試劑盒可以是一種基于酶聯(lián)免疫反應(ELISA)技術的試劑盒。 用于檢測糖尿病或預測早期糖尿病的發(fā)生。ELISA技術以及基于該技術的檢測試劑對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。更具體地，所述的特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑也可固定于試紙上，制備成免疫膠體金試紙或類似檢測材料。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(1)首次揭示ApoA I或其蛋白片段可以作為診斷糖尿病的標志物。(2)首次制備出了特異性識別ApoA I或其蛋白片段的試劑，所述試劑特異性好， 檢測靈敏度高，準確性高，具有良好的臨床應用價值。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。^MLl、差異表達蛋白質(zhì)的篩選方法ι-乙醇沉淀法分級-一體柱串聯(lián)質(zhì)譜策略本實施例中所有的實驗用水均來自Milli-Q(Millipore，Bedford, MA, USA)超純水裝置；dithiothreitol (DTT)、SDS、尿素、3_[ (3-膽酰胺丙基)_ 二乙]_ 丙磺基(CHAPS)、 Tris、碳酸氫銨(NH4HC03)和 iodoacetamide (IAA)從 Bio-Rad 公司(Hercules, CA, USA) 購買；胰蛋白酶(Trypsin)購自 Promega 公司(Madison, WI, USA)；甲酸(formic acid, FA)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)和乙腈(Acetonitrile)購自 Aldrich 公司 (Milwaukee, WI, USA)；磷酸購自上?；瘜W試劑公司。除乙腈為色譜純外，其余的化學試劑均為分析純。正常健康對照血清和2型糖尿病患者血清樣品由上海交通大學附屬上海市第六人民醫(yī)院糖尿病研究所提供。在50 μ L 血清樣品中加入 250 μ L 溶液(IOOmM NaCl, IOmMHEPES, ρΗ 7. 4)，用 0. 22 4!11濾膜在41 IOOOOg的轉(zhuǎn)速下離心去除脂類；取260 μ L除脂后的血清樣品加入 182口1^令乙醇溶液，置于41立式搖床上混合111，然后41 16000g離心45min。上清即為高豐度組分，沉淀部分即為低豐度組分。將兩個組分均進行低溫凍干，然后各加入200 μ L 2D裂解液進行溶解。取高豐度和低豐度組分各100 μ L，加入IyL IM DTT，混勻，37°C放置2. 5h，冷卻至室溫后，加入5μ L IM ΙΑΑ，室溫避光放置40min。經(jīng)過上述處理的蛋白質(zhì)完全變性，二硫鍵被打開，巰基被封閉。然后將每管溶液用: 的超濾膜，12000g離心超濾， 除去溶液中的鹽類和其他小分子化合物，使溶劑置換為IOOmM的碳酸氫銨溶液。完成上述所有操作之后，向兩個組分分別加入20 μ g的胰蛋白酶(Trypsin)，37°C水浴酶解Mh，再用Millipore 10K超濾膜超濾，除去酶和未被酶解的蛋白質(zhì)，收集濾液、凍干，每管用60 μ L 0. 甲酸水溶液復溶，取1/3樣品進行質(zhì)譜分析。一體柱串聯(lián)質(zhì)譜(IMDL-MS/MQ包括一個自動進樣器、一個高壓混合泵和一個用于二維液相色譜分離的Bi-phase整體柱。Bi-phase整體柱分為兩段前半段為強陽離子交換柱，后半段為 C 18 反相柱(300 μ m ID ；50mm length, Column Technology Inc，USA)。 高效液相色譜溶液包括A :0. 甲酸；B 0. 甲酸，100%乙腈。酶解后的肽段混合物經(jīng)自動進樣器以無損失的模式進入到一體柱中，肽段混合物先經(jīng)過一體柱的前半部分(即強陽離子交換柱部分)，大部分肽段被結合在強陽離子交換柱上，未保留部分被沖到后半部分的C18反相柱上，然后用2-40%的B溶液沖洗120min，并進行質(zhì)譜檢測。在自動進樣器中，以不同的PH梯度和無損失進樣模式把100 μ L ρΗ溶液進樣到一體柱里，即把一部分肽段混合物從一體柱的前半部分(強陽離子交換柱部分)洗脫到后半部分(C18反相柱)，2-40% 的B溶液沖洗120min，并進行質(zhì)譜檢測；用不同ρΗ溶液重復上述過程共11次。在整個過程中的質(zhì)譜條件為質(zhì)譜掃描條件設定為一個400-2000M/Z的全掃描(full scan)后面進行全掃描中前10個最高峰的MS/MS掃描，其中動態(tài)排除(dynamic exclusion)的設定是 重復次數(shù)O^peat count)為2，重復容忍時間(r印eat duration)為30s，動態(tài)排除時間 (exclusion duration)為 90s。以上述方法制備10例正常健康對照血清和17例2型糖尿病患者血清樣品。2型糖尿病病人的臨床指標詳見表1(性別“1”表示男性；“2”表示女性；以下同)，正常血清的臨床指標詳見表2。測定的臨床指標分別為甘油三酯(TG，mmol/L)，總膽固醇(TC，mmol/ L)，高密度脂蛋白(HDL，mmol/L)，低密度脂蛋白(LDL，mmol/L)，空腹血糖(FPG，mmol/L)，餐后2小時血糖(PG2H, mmol/L)。表1、17例2型糖尿病患者的臨床資料
性別年齡FPGPG2HTGTCHDLLDLBMIDMl1699. 7319. 140. 644. 302. 111. 8220. 40DM216777. 502. 345. 931. 363. 5825. 70DM3697. 216. 84. 528. 031. 765. 1524. 77DM41699. 8418. 341. 875. 201. 063. 1123. 05DM516514. 7116. 781. 716. 201. 584. 1228. 20DM61688. 5014. 601. 456. 201. 384. 0322. 50DM71687. 1162. 325. 71. 594. 1425. 1DM81679. 4414. 900. 713. 700. 982. 64NADM91668. 099. 101. 104. 001. 012. 81NADMlO1679. 7017. 801. 543. 721. 242. 5625. 20DMll1679. 591. 694. 131. 342. 7725. 6DM121697. 1015. 300. 853. 911. 362. 8425. 50DMl 31677. 4017. 501. 534. 861. 343. 5525. 70DMl 41667. 9811. 670. 865. 602. 302. 5323. 90
權利要求
1.一種載脂蛋白Al或其蛋白片段作為糖尿病標志物的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白片段的氨基酸序列為載脂蛋白 Al所特有。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的載脂蛋白Al的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 1或其中第2-17位氨基酸所示。
4.一種分離的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1或其中第2-17位氨基酸所示。
5.一種分離的多核苷酸，其特征在于，其編碼權利要求4所述的多肽。
6.一種載脂蛋白Al或其蛋白片段的用途，用于制備檢測糖尿病的試劑。
7.一種特異性識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑的用途，用于制備檢測糖尿病或區(qū)分糖尿病高危人群的試劑盒。
8.一種特異性識別載脂蛋白Al或其蛋白片段的試劑，所述試劑是多克隆抗體。
9.一種檢測糖尿病的試劑盒，所述試劑盒包含容器，以及置于所述容器中的權利要求 8所述的試劑。
10.一種測試條，其包括固相載體，以及附著于所述固相載體上的權利要求8所述的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及載脂蛋白A1作為糖尿病標志物的應用。本發(fā)明提供了一種對于指示糖尿病的發(fā)生或發(fā)展有用的標志物——載脂蛋白A1，其在糖尿病患者血清中的含量顯著低于正常人群，因此可用于診斷糖尿病或糖尿病患病風險。
文檔編號G01N33/577GK102565416SQ201010605388
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權日2010年12月27日
發(fā)明者吳家睿, 夏方瑩, 曾嶸, 李榮霞, 蘇智端, 賈偉平, 陳海冰 申請人:上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院, 中國科學院上海生命科學研究院