新穎的抗-siglec-15抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的藥物組合物，其靶向在破骨細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)的基因所編碼的蛋白。具體地，提供了一種含有抗體的藥物組合物，所述抗體特異性地識(shí)別人Siglec-15且展示抑制破骨細(xì)胞形成的活性等。
FERM BP-10999
2008.08.28
【專利說(shuō)明】新穎的抗-SIGLEC-15抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可用作異常骨代謝的治療劑和/或預(yù)防劑的物質(zhì)以及治療和/或預(yù)防 異常骨代謝的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 已知骨骼為動(dòng)態(tài)性器官，其通過(guò)重復(fù)形成和吸收，進(jìn)行持續(xù)重建，從而改變其本身 的形態(tài)并維持血鈣水平。健康的骨骼維持由成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨形成和由破骨細(xì)胞進(jìn)行的骨 吸收之間的平衡關(guān)系，從而骨量保持恒定。然而，當(dāng)骨形成和骨吸收之間的平衡被破壞時(shí)， 則發(fā)生諸如骨質(zhì)疏松癥等異常骨代謝（參見，例如，非專利文獻(xiàn)1和2)。
[0003] 作為調(diào)節(jié)骨代謝的因子，報(bào)道了很多全身性激素以及局部性細(xì)胞因子，且這些因 子互相合作以形成和維持骨（參見，例如，非專利文獻(xiàn)1和3)。作為因衰老導(dǎo)致的骨組織的 變化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病眾所周知，但是其發(fā)病機(jī)理包含各種因素，如性激素的分泌降低以 及該激素受體異常、骨局部細(xì)胞因子表達(dá)變動(dòng)、老化基因的表達(dá)、破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分 化衰退或功能不全，因此，難以將它理解為單純的年齡相關(guān)的生理現(xiàn)象。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥 主要分為由雌激素分泌降低導(dǎo)致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和由老齡化導(dǎo)致的老年性骨質(zhì)疏松 癥，但為了闡明其發(fā)病機(jī)理和開發(fā)針對(duì)它的治療劑，在骨形成和骨吸收的調(diào)節(jié)機(jī)制方面的 基礎(chǔ)研究的進(jìn)展很重要。
[0004] 破骨細(xì)胞是源自造血干細(xì)胞的多核細(xì)胞，通過(guò)在破骨細(xì)胞粘附的骨表面上釋放氯 離子和氫離子，破骨細(xì)胞使骨表面與破骨細(xì)胞之間的間隙成為酸性，并且還分泌作為酸性 蛋白酶的組織蛋白酶K等（參見，例如，非專利文獻(xiàn)4)。這引發(fā)磷酸鈣的降解、酸性蛋白酶 的活化以及骨基質(zhì)蛋白的降解，導(dǎo)致骨吸收。
[0005] 業(yè)已發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞通過(guò)存在于骨表面上的成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞 膜上表達(dá)的RNAKL (NF-K B配體的受體活化因子)的刺激，分化為破骨細(xì)胞（參見，例如，非 專利文獻(xiàn)5和6)。已發(fā)現(xiàn)RNAKL是成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的膜蛋白，其表達(dá)受骨吸收 因子的調(diào)節(jié)，RNAKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟的多核破骨細(xì)胞的分化等（參見，例如， 非專利文獻(xiàn)5和7)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)敲除RNAKL的小鼠發(fā)生（develop)骨硬化病樣疾病，并 因此，已經(jīng)證明RNAKL是生理性的破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子（參見，例如，非專利文獻(xiàn)8)。
[0006] 使用二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性 雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、PTH和鈣制劑等作為治療骨代謝疾 病或縮短治療時(shí)間的藥物。但是，這些藥物不會(huì)總是表現(xiàn)出令人滿意的治療效果，已經(jīng)需要 開發(fā)具有更有效的治療效果的藥物。
[0007] 免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜被多種聚糖(諸如唾液酸化的聚糖）高度覆蓋，所述聚糖被各 種聚糖結(jié)合蛋白識(shí)別。結(jié)合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素(在下文中稱為"Siglec"）為識(shí) 別并結(jié)合唾液酸化的聚糖的I型膜蛋白家族。許多Siglec在免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)， 并識(shí)別類似地存在于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上的唾液酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞相互作用或細(xì)胞功能，并被 認(rèn)為參與免疫應(yīng)答（參見，例如，非專利文獻(xiàn)9)。然而，也有很多尚未闡明其生理功能的 Siglec分子。最近報(bào)道Siglec-15 (結(jié)合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素15)為屬于Siglec 的分子（參見，例如，非專利文獻(xiàn)10)，其與被稱為CD33L3 (CD33分子樣3)的分子相同。 該分子從魚類到人類是進(jìn)化高度保守的，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在人脾和淋巴結(jié)的樹突細(xì)胞和/或巨噬 細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。此外，使用唾液酸探針的結(jié)合測(cè)試的結(jié)果是：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人Siglec-15結(jié)合 Neu5Ac a 2_6GalNAc，且小鼠 Siglec-15 進(jìn)一步結(jié)合 Neu5Ac a 2_3Gal P l-4Glc 等（參見，例 如，非專利文獻(xiàn)10)。直至最近，還未揭示Siglec-15的生理作用，但業(yè)已報(bào)道，隨著破骨細(xì) 胞的分化和成熟，Siglec-15的表達(dá)增加，通過(guò)用RNA干擾使Siglec-15的表達(dá)下降，可以抑 制破骨細(xì)胞的分化（參見，例如，PTL 1)。此外，在PTL 2 (2009年4月16日公開）和PTL 3 (2010年10月14日公開）中已經(jīng)首次公開了抗-Siglec-15抗體對(duì)破骨細(xì)胞分化的作 用。此外，在PTL 4中也已經(jīng)公開了抑制破骨細(xì)胞分化的抗體，但是，對(duì)具有更有效的作用 的抗體的尋找仍在繼續(xù)。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文件 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) I: WO 07/093042 專利文獻(xiàn)2: WO 09/48072 專利文獻(xiàn) 3: WO 10/117011 專利文獻(xiàn) 4: WO 11/041894 非專利文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn) I: Endocrinological Review, (1992) 13，第 66-80 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 2: Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996) 第87-102頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 3: Endocrinological Review, (1996) 17，第 308-332 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 4: American Journal of Physiology, (1991) 260，C1315-C1324 非專利文獻(xiàn) 5: Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95，第 3597-3602 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 6: Cell, (1998) 93，第 165-176 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 7: Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23，S222 非專利文獻(xiàn) 8: Nature, (1999) 397，第 315-323 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 9: Nature Reviews Immunology, (2007) 7，第 255-266 頁(yè) 非專利文獻(xiàn) 10: Glycobiology, (2007) 17，第 838-846 頁(yè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明所要解決的問(wèn)題 本發(fā)明的目的在于提供：在各種形式的異常骨代謝(可見為骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、癌的骨轉(zhuǎn)移等）中特異表達(dá)的基因；抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其活性的物質(zhì)；以及 異常骨代謝的治療劑和/或預(yù)防劑。
[0010] 解決問(wèn)題的手段 為了找到對(duì)異常骨代謝具有治療和/或預(yù)防效果的物質(zhì)，本發(fā)明的發(fā)明人以闡明破骨 細(xì)胞的分化、成熟和活化機(jī)制為目標(biāo)進(jìn)行了研究。結(jié)果本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)隨著破骨細(xì)胞 的分化和成熟，Siglec-15基因的表達(dá)增加，還發(fā)現(xiàn)特異性地結(jié)合Siglec-15的抗體可以抑 制破骨細(xì)胞的分化。此外，本發(fā)明的發(fā)明人人源化了已經(jīng)得到的大鼠抗-小鼠Siglec-15 抗體從而完成了本發(fā)明。
[0011] 具體地，本發(fā)明包括下述發(fā)明。
[0012] (1) 一種抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于： 重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述⑶RH3 包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或在其中包含1-3個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列； 且 輕鏈序列含有具有⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID NO: 36表不的氨基酸序列。
[0013] (2) -種抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于： 重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述⑶RH3 包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列；且 輕鏈序列含有具有⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID NO: 36表不的氨基酸序列。
[0014] (3)根據(jù)（1)或（2)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含 有由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基1-121的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基1-109的輕鏈可變區(qū)序列。
[0015] (4)根據(jù)⑴至⑶所述的抗體的抗原結(jié)合片段，所述片段選自：Fab、F(ab'）2、 Fab' 和 Fv。
[0016] (5)根據(jù)⑴至⑶所述的抗體，其特征在于是scFv。
[0017] (6)根據(jù)（1)至（4)中的任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在 于所述抗體是嵌合抗體。
[0018] (7)根據(jù)（6)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 8表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 10 表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0019] (8)根據(jù)（1)、⑵或⑷所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于所 述抗體是人源化的。
[0020] (9)根據(jù)（6)或（8)所述的抗體，其中所述重鏈具有人免疫球蛋白G2重鏈的恒定 區(qū)，且所述輕鏈具有人免疫球蛋白K輕鏈的恒定區(qū)。
[0021] (10) -種抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞性骨吸收的抗體或所述抗體的抗原 結(jié)合片段，其特征在于包含： (a)選自下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列： al)包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a2)包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a3)包含由SEQ ID NO: 16表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a4)包含由SEQ ID NO: 18表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a5)包含由SEQ ID NO: 20表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a6)包含由SEQ ID NO: 22表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a7)包含由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a8)包含由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a9)包含由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； alO)包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； all)與選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； al2)與選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； 和 al3)在選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列中包括一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加的氨基酸序列；和 (b)選自下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列： bl)包含由SEQIDNO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列；b2)包含由SEQIDNO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b3)包含由SEQIDNO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b4)包含由SEQIDNO: 30表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b5)包含由SEQIDNO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b6)包含由SEQIDNO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b7)與選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； b8)與選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；和 b9)在選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列中包括一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失 或添加的氨基酸序列。
[0022] (11)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0023] (12)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0024] (13)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0025] (14)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0026] (15)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0027] (16)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0028] (17)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
[0029] (18)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0030] (19)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0031] (20)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0032] (21)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0033] (22)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0034] (23)根據(jù)（10)所述的抗體或抗體的功能片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示 的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0035] (24)根據(jù)（10)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
[0036] (25)根據(jù)（11)至（24)中的任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈 包括從其羧基端末端的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸缺失。
[0037] (26) -種藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)⑴至（25)所述的抗體或所 述抗體的抗原結(jié)合片段。
[0038] (27)根據(jù)（26)所述的藥物組合物，其特征在于是異常骨代謝的治療劑和/或預(yù)防 劑。
[0039] (28) -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的藥物組合物，其特征在于包含至少一 種根據(jù)（1)至（25)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段和至少一個(gè)選自下述的成員：二 膦酸鹽、活性維生素D 3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào) 節(jié)劑）、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非甾體類抗炎 藥、可溶性TNF受體、抗-TNF-a抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激 素相關(guān)的蛋白）抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或 所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細(xì)胞 生成抑制因子）。
[0040] (29)根據(jù)（27)或（28)所述的藥物組合物，其中所述異常骨代謝選自：骨質(zhì)疏松 癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破 壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、假體關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨 破壞、骨佩吉特病、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和成骨不全。
[0041] (30)根據(jù)（29)所述的藥物組合物，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì)疏松癥、伴 隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
[0042] (31)根據(jù)（30)所述的藥物組合物，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì)疏松癥。
[0043] (32)根據(jù)（31)所述的藥物組合物，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏 松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏 松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
[0044] (33) -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的方法，其特征在于施用至少一種根據(jù) (1)至（25)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或根據(jù)（27)或（28)所述的藥物組合 物。
[0045] (34) -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的方法，其特征在于同時(shí)地或接連地施 用至少一種根據(jù)（1)至（25)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或根據(jù)（28)所述的藥 物組合物和至少一個(gè)選自下述的成員：二膦酸鹽、活性維生素D 3、降鈣素及其衍生物、激素 例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌）、鈣 制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非留體類抗炎藥、可溶性TNF受體、抗-TNF- a抗體或所述抗 體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白）抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片 段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或所 述抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子）。
[0046] (35)根據(jù)（33)或（34)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述異常骨代謝 是骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
[0047] (36)根據(jù)（35)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì)疏 松癥。
[0048] (37)根據(jù)（36)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后 骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性 骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
[0049] (38) -種多核苷酸，其編碼根據(jù)（1)至（25)中的任一項(xiàng)所述的抗體。
[0050] (39)根據(jù)（38)所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 1表示的 核苷酸序列的核苷酸1-363的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列的核 苷酸1-327的核苷酸序列。
[0051] (40)根據(jù)（39)所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 7表示的 核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 9表示的核苷酸序列的 核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0052] (41)根據(jù)（38)所述的多核苷酸，其特征在于包含： (a)選自下述核苷酸序列的多核苷酸： al)包含由SEQIDNO: 11表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；a2)包含由SEQIDNO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a3)包含由SEQIDNO: 15表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a4)包含由SEQIDNO: 17表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a5)包含由SEQIDNO: 19表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a6)包含由SEQIDNO: 21表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a7)包含由SEQIDNO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a8)包含由SEQIDNO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a9)包含由SEQIDNO: 41表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； alO)包含由SEQIDNO: 43表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； all)與選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； al2)與選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； al3)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含選自al)至alO)的任 一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交； al4) -種核苷酸序列，其包括選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨 基酸殘基的取代、缺失或添加；和 (b)選自下述核苷酸序列的多核苷酸： bl)包含由SEQIDNO: 23表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；b2)包含由SEQIDNO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b3)包含由SEQIDNO: 27表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b4)包含由SEQIDNO: 28表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b5)包含由SEQIDNO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b6)包含由SEQIDNO: 47表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b7)與選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； b8)與選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含選自bl)至b6)的任一 個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和 blO) -種核苷酸序列，其包括在選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè) 核苷酸的取代、缺失或添加。
[0053] (42)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0054] (43)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0055] (44)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ IDNO:13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQIDNO:27表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0056] (45)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0057] (46)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0058] (47)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0059] (48)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
[0060] (49)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0061] (50)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0062] (51)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0063] (52)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0064] (53)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0065] (54)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0066] (55)根據(jù)（41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
[0067] (56) -種載體，其包含根據(jù)（38)至（55)所述的任一個(gè)多核苷酸。
[0068] (57) -種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)（38)至（55)所述的任一個(gè)多核苷酸。
[0069] (58) -種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)（56)所述的載體。
[0070] (59) -種生產(chǎn)根據(jù)（1)至（25)中的任一項(xiàng)所述的抗體的方法，所述方法包括：培 養(yǎng)根據(jù)（57)或（58)所述的宿主細(xì)胞，和從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物純化所述抗體。
[0071]發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可以得到異常骨代謝的治療劑和/或預(yù)防劑，其作用機(jī)制是抑制破骨細(xì) 胞的分化和成熟及其骨吸收活性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0072][圖1]圖1顯示了大鼠#24A3重鏈可變區(qū)的克隆核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0073][圖2]圖2顯示了大鼠#24A3輕鏈可變區(qū)的克隆核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0074][圖3]圖3顯示了人嵌合#24A3抗體重鏈的苷酸序列及其氨基酸序列。
[0075][圖4]圖4顯示了人嵌合#24A3抗體輕鏈的苷酸序列及其氨基酸序列。
[0076][圖5]圖5顯示了 h#24A3_Hl的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0077][圖6]圖6顯示了 h#24A3_H2的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0078][圖7]圖7顯示了 h#24A3_H3的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0079][圖8]圖8顯示了 h#24A3_H4的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0080][圖9]圖9顯示了 h#24A3-H5的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0081][圖10]圖10顯示了 h#24A3-H6的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0082][圖11]圖11顯示了 h#24A3-Ll的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0083][圖12]圖12顯示了 h#24A3_L2的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0084][圖13]圖13顯示了 h#24A3_L3的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0085][圖14]圖14顯示了 h#24A3-L4的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0086][圖15]圖15顯示了大鼠#24A3抗體的各個(gè)⑶R序列的氨基酸序列。
[0087][圖16]圖16顯示的圖描繪了大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3的人嵌合 抗體（N=6)對(duì)正常人破骨細(xì)胞分化的抑制。
[0088][圖17]圖17顯示了 h#24A3_H2b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0089][圖18]圖18顯示了 h#24A3_H2c的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0090][圖19]圖19顯示了 h#24A3-H2d的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0091][圖20]圖20顯示了 h#24A3-H2e的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0092][圖21]圖21顯示了 h#24A3_L2b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0093][圖22]圖22顯示了 h#24A3-L3b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0094][圖23]圖23顯示的圖描繪了大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3的人源化 抗體（N=6)對(duì)正常人破骨細(xì)胞分化的抑制。
[0095][圖24]圖24是為了確定h#24A3-H2d/Ll抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。[0096][圖25]圖25是為了確定h#24A3_H2e/Ll抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。 [0097][圖26]圖26是為了確定h#24A3-H2b/L3b抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。
[0098][圖27]圖27是為了確定h#24A3-H2c/L2b抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0099] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"基因"不僅包括DNA，還包括mRNA、cDNA以及cRNA。
[0100] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"用于與核酸相同的含義，并且還包括DNA、RNA、探針、 寡核苷酸以及引物。
[0101] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白"無(wú)區(qū)別使用。
[0102] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"RNA級(jí)分"是指包含RNA的級(jí)分。
[0103] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"包括動(dòng)物個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0104] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"Siglec-15"以與"Siglec-15蛋白"相同的含義使用。
[0105] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"破骨細(xì)胞形成"以與"破骨細(xì)胞分化"或"破骨細(xì)胞成熟"相同的 含義使用。
[0106] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗體的抗原結(jié)合片段"以與"抗體的功能片段"相同的含義使 用，并表示具有抗原結(jié)合活性的抗體的一部分片段，包括Fab、F(ab'）24 ￥、8(^1雙特異抗 體、線性抗體、從抗體片段形成的多特異性抗體等。該術(shù)語(yǔ)也包括Fab'，其為在還原條件下 處理F (ab'）2得到的抗體的可變區(qū)的單價(jià)片段。但是，該術(shù)語(yǔ)不限于這些分子，只要所述片 段具有與抗原的結(jié)合親和力。此外，這些抗原結(jié)合片段不僅包括用適當(dāng)?shù)拿柑幚砜贵w蛋白 的全長(zhǎng)分子得到的片段，還包括使用遺傳修飾的抗體基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白。
[0107] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"表位"是指特定的抗-Siglec-15抗體結(jié)合的Siglec-15的部 分肽或部分三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)諸如免疫測(cè)定法等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，可以確定作為 Siglec-15的部分肽的上述表位。但是，例如，可以采用以下的方法。制備Siglec-15的各 種部分結(jié)構(gòu)。在制備部分結(jié)構(gòu)時(shí)，可使用已知的寡肽合成技術(shù)。例如，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的基因重組技術(shù)，制備從Siglec-15的C末端或N末端順次縮短所得到的具有適當(dāng)?shù)?縮短長(zhǎng)度的一系列多肽。此后，檢測(cè)這些多肽的抗體的反應(yīng)性，并粗略確定識(shí)別位點(diǎn)。然后， 合成長(zhǎng)度更短的肽，并檢測(cè)與這些肽的反應(yīng)性，由此可確定表位。此外，通過(guò)X-射線晶體結(jié) 構(gòu)分析描述鄰近抗體的Siglec-15的氨基酸殘基，可以確定作為Siglec-15的部分三級(jí)結(jié) 構(gòu)的表位(特異性的抗-Siglec-15抗體與其結(jié)合)。如果第二抗-Siglec-15抗體結(jié)合第一 抗-Siglec-15抗體所結(jié)合的部分肽或部分三級(jí)結(jié)構(gòu)，則可以確定第一抗體與第二抗體共 享相同的表位。此外，通過(guò)證實(shí)第二抗-Siglec-15抗體與第一抗-Siglec-15抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合Siglec-15 (即第二抗體抑制Siglec-15和第一抗體之間的結(jié)合)，可以確定第一抗體和 第二抗體共享相同的表位，即使尚未確定所述表位的具體序列或結(jié)構(gòu)。此外，當(dāng)?shù)谝豢贵w和 第二抗體結(jié)合相同的表位，且第一抗體具有諸如抗原中和活性等特殊效應(yīng)時(shí)，可以預(yù)期第 二抗體具有相同的活性。
[0108] 已知抗體分子的每個(gè)重鏈和輕鏈具有3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)（⑶R)?；パa(bǔ)性決定區(qū)也 稱作超變結(jié)構(gòu)域，且存在于抗體的每個(gè)重鏈和輕鏈的可變區(qū)中。它是在它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中具 有特別高可變性的位點(diǎn)，且在每個(gè)重和輕多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)單獨(dú)的CDR。在本說(shuō) 明書中，作為抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)，重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)由來(lái)自重鏈氨基酸序列的氨基端 末端的CDRHl、CDRH2和CDRH3表示，且輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)由來(lái)自輕鏈氨基酸序列的氨基 端末端的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3表示。這些位點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此鄰近，決定了抗體結(jié)合 的抗原的特異性。
[0109] 本文使用的短語(yǔ)"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交"是指在可實(shí)現(xiàn)鑒定的條件下進(jìn)行雜交， 其中在市售的雜交溶液ExpressHyb雜交溶液（由Clontech Laboratories, Inc?生產(chǎn))中， 在68 °C進(jìn)行雜交，或者使用其上固定有DNA的濾器，在0. 7-1. OM NaCl存在下，在68 °C進(jìn)行 雜交，然后使用〇. 1-2X的SSC溶液（I X SSC溶液由150 mM NaCl和15 mM檸檬酸鈉組成） 在68°C進(jìn)行洗滌，或在與其等同的條件下雜交。
[0110] 在本說(shuō)明書中在本文使用的短語(yǔ)"一個(gè)至幾個(gè)"和"一個(gè)或幾個(gè)"中的術(shù)語(yǔ)"幾個(gè)" 表示2-10個(gè)，優(yōu)選地10個(gè)或更少，5個(gè)或6個(gè)或更少，或2個(gè)或3個(gè)。
[0111] I. Siglec-15 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Siglec-15基因在巨細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)單 核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時(shí)，Siglec-15基因的表達(dá)水平增加。
[0112] 要在本發(fā)明中使用的Siglec-15直接地從人、非人哺乳動(dòng)物(例如豚鼠、大鼠、小 鼠、兔、豬、綿羊、?；蚝铮┗螂u的單核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞純化，并然后可以使用，或者從上述細(xì) 胞的細(xì)胞膜級(jí)分制備，并然后可以使用。此外，通過(guò)體外合成或通過(guò)基因工程在宿主細(xì)胞內(nèi) 生產(chǎn)，可以得到Siglec-15。具體地，在這樣的基因工程生產(chǎn)中，將Siglec-15 cDNA整合進(jìn) 能表達(dá)Siglec-15 cDNA的載體中，并在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液 中合成Siglec-15,或者轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細(xì)胞以表達(dá)Siglec-15,由此可得到該 蛋白。
[0113] 人Siglec-15 cDNA的核苷酸序列已經(jīng)以登錄號(hào)NM_213602登記在GenBank中。 小鼠Siglec-15 cDNA的核苷酸序列已經(jīng)以登錄號(hào)XM_884636登記在GenBank中。此外， Siglec-15有時(shí)被稱為⑶33抗原-樣3、⑶33分子-樣3、⑶33-樣3或⑶33L3,這些都表 示相同的分子。
[0114] 可以如下得到Siglec-15 cDNA :通過(guò)例如所謂的PCR方法，其中使用表達(dá) Siglec-15 cDNA的cDNA文庫(kù)作為模板，并使用特異性擴(kuò)增Siglec-15 cDNA的引物，進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（在下文中稱作"PCR"）（Saiki，R. K.，等人，Science, (1988) 239， 487-49)。
[0115] 順便一提，具有下述特征的多核苷酸也視作Siglec-15 cDNA:它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下 與包含編碼人或小鼠Siglec-15的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且 編碼具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚缘牡鞍?。此外，具有下述特征的多核苷酸也視?Siglec-15 cDNA :它是從人或小鼠Siglec-15基因座轉(zhuǎn)錄的剪接變體，或與其互補(bǔ)序列在 嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚缘牡鞍住?br> [0116] 此外，具有下述特征的蛋白也視作Siglec-15 :它包含這樣的氨基酸序列，所述序 列包含在人或小鼠Siglec-15的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加， 或通過(guò)從該序列除去信號(hào)序列所得到的氨基酸序列，且具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘?性。此外，具有下述特征的蛋白也視作Siglec-15 :它包含由從人或小鼠Siglec-15基因座 轉(zhuǎn)錄的剪接變體編碼的氨基酸序列，或包含在其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添 加的氨基酸序列，且具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?br> [0117] 2.異常骨代謝的檢測(cè) 對(duì)來(lái)自各種人骨組織的測(cè)試樣品組中的Siglec-15基因表達(dá)水平的分析顯示該基因 在巨細(xì)胞瘤（GCT)中的表達(dá)水平顯著增加，所述巨細(xì)胞瘤是破骨細(xì)胞樣多核巨大細(xì)胞大 量出現(xiàn)的骨腫瘤，且其特征是在臨床上發(fā)現(xiàn)骨溶解性的骨破壞（Bullough等，Atlas of Orthopedic Pathology 第 2 版， 第 17. 6-17.8 頁(yè)，Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992))。
[0118] 還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時(shí)，Siglec-15基因的表達(dá)水 平增加。
[0119] 因此，認(rèn)為Siglec-15與諸如GCT等其中骨吸收增加的人病理學(xué)有關(guān)。換而言之， 通過(guò)測(cè)量Siglec-15基因和/或Siglec-15在各細(xì)胞和/或各組織中的表達(dá)水平，能夠確 定伴隨Siglec-15的過(guò)表達(dá)的異常骨代謝狀態(tài)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"異常骨代謝"是指特征 在于凈骨流失的障礙，其具體例子包括但不限于：骨質(zhì)疏松癥（絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性 骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥）、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā) 性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、假體關(guān)節(jié)周 圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和成骨不全。
[0120] 在本發(fā)明中，用于檢測(cè)Siglec-15基因和/或Siglec-15的表達(dá)水平的"測(cè)試樣 品"是指從測(cè)試對(duì)象得到的下述組織的樣品：骨髓、骨、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臟、口 腔、咽、唇、舌、牙銀、鼻咽、食道、胃、小腸、大腸、結(jié)腸、肝臟、膽囊、胰臟、鼻、肺、軟組織、皮 膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結(jié)、肌肉、脂肪組織等，或從測(cè)試對(duì)象得到的血液、體 液、排泄物等，臨床樣本等，但是，在本發(fā)明中，更優(yōu)選血液或骨髓。
[0121] 關(guān)于已知與破骨細(xì)胞分化有關(guān)的RANKL，已經(jīng)生產(chǎn)了敲除的小鼠，并已經(jīng)分析了當(dāng) 已經(jīng)喪失RANKL 功能時(shí)的表型（Young-Yun Kong,等人，Nature (1999) 397，第 315-323 頁(yè)）。通過(guò)以與上述相同的方式生產(chǎn)缺失Siglec-15的敲除的小鼠，可以分析當(dāng)已經(jīng)喪失 Siglec-15功能時(shí)的表型。
[0122] 3.抗-Siglec-15抗體的制備 可以如下獲得本發(fā)明的抗Siglec-15的抗體：根據(jù)常規(guī)的方法，用Siglec-15或選自 Siglec-15的氨基酸序列的任意多肽免疫動(dòng)物，并采集和純化體內(nèi)產(chǎn)生的抗體。用作抗 原的Siglec-15的生物物種不限于人，也可以用從諸如小鼠或大鼠等除人以外的動(dòng)物得 到的Siglec-15免疫動(dòng)物。在這種情況下，通過(guò)測(cè)試抗體與得到的異源Siglec-15和人 Siglec-15的結(jié)合之間的交叉反應(yīng)性，可以選擇可適用于人疾病的抗體。
[0123]此外，根據(jù)已知的方法(例如，Kohler 和 Milstein, Nature, (1975) 256，第 495-497 頁(yè)；Kennet, R?編，Monoclonal Antibody,第 365-367 H，PrenumPress，N. Y. (1980))，通過(guò)使生產(chǎn)抗Siglec-15抗體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交 瘤，可以得到單克隆抗體。這樣的方法的一個(gè)具體例子描述在WO 09/48072 (2009年4月 16日公開）和WO 10/117011 (2010年10月14日公開）。但是，得到單克隆抗體的方法對(duì) 應(yīng)于已經(jīng)充分確定的領(lǐng)域，并且不限于上述具體例子。
[0124] 順便一提，要用作抗原的Siglec-15可以通過(guò)基因工程得到，其中使宿主細(xì)胞生 產(chǎn)Siglec-15基因。具體地，生產(chǎn)能夠表達(dá)Siglec-15基因的載體，將得到的載體引入宿主 細(xì)胞中以表達(dá)該基因，然后純化表達(dá)的Siglec-15。
[0125] 如此建立的雜交瘤株的例子包括在本說(shuō)明書中描述的雜交瘤#24A3。此外，在本 說(shuō)明書中，由雜交瘤#24A3生產(chǎn)的抗體被稱作"#24A3抗體"或簡(jiǎn)稱"#24A3"。此外，在本說(shuō) 明書中，除了 #24A3抗體以外的抗體也以相同方式用它們的抗體名稱來(lái)表示。含有#24A3 抗體的重鏈可變區(qū)的部分片段具有包含序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基1-121的氨 基酸序列。此外，含有#24A3抗體的輕鏈可變區(qū)序列的部分片段具有包含序列表中SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基1-109的氨基酸序列。
[0126] 本發(fā)明的抗體不僅包括上述抗Siglec-15的單克隆抗體，而且包括以降低對(duì)人類 等的異種抗原性為目的而人工修飾得到的重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。 使用已知的方法，可以制備這些抗體。
[0127] 作為嵌合抗體，可以例舉這樣的抗體，其中抗體可變區(qū)和恒定區(qū)源自不同的物種， 例如，其中使小鼠_或大鼠_衍生的抗體可變區(qū)與人-衍生的恒定區(qū)相連的嵌合抗體（參 見 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，6851-6855，（1984))。作為源自大鼠抗-小鼠抗 體#24A3的嵌合抗體的一個(gè)例子，可以例舉這樣的抗體，其包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有 包含序列表中的SEQ ID NO: 8的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含 序列表中的SEQ ID NO: 10的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列。
[0128] 作為人源化抗體，可以例舉通過(guò)只將互補(bǔ)性決定區(qū)（⑶R)整合到人-衍生的抗體 中所得到的抗體（參見Nature (1986) 321，第522-525頁(yè)）；以及通過(guò)CDR-移植法將框 架的氨基酸殘基的一部分和CDR序列移植到人抗體中所得到的抗體（W0 90/07861)。
[0129] 在本發(fā)明的抗體中包括從#24A3抗體衍生出的人源化抗體，只要所述人源化抗體 具有#24A3的所有6類CDR序列并且具有抑制破骨細(xì)胞形成的活性。此外，#24A3抗體的 重鏈可變區(qū)具有：包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列的⑶RHl (RYDVS)，包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列的CDRH2 (VIHPGSGGTGYNEKFKA)，和包含由SEQ ID NO: 33表 示的氨基酸序列的⑶RH3 (RGLNSGYWFFDF)。此外，#24A3抗體的輕鏈可變區(qū)具有：包含由 SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列的CDRLl (KASQNVGSNVD)，包含由SEQ ID NO: 35表示 的氨基酸序列的⑶RL2 (ESTNRYT)，和包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列的⑶RL3 (MQSNFFPFT)。這些⑶R的氨基酸序列也顯示在圖15中。
[0130] 此外，在本發(fā)明的抗體中也包括這樣的CDR修飾的人源化抗體，其包括用另一種 氨基酸殘基對(duì)每個(gè)CDR中的1-3個(gè)氨基酸殘基的取代，只要它具有抑制破骨細(xì)胞形成的活 性即可。作為⑶RH3中的氨基酸的取代的一個(gè)例子，可以例舉這樣的⑶RH3,其包括由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列中的一個(gè)氨基酸的取代。優(yōu)選的是包含由SEQ ID NO: 49表 示的氨基酸序列（RGLNKGYWFFDF)的⑶RH3。該⑶R的氨基酸序列也顯示在圖15中。
[0131] 作為大鼠抗體#24A3的人源化抗體的一個(gè)例子，可以例舉重鏈和輕鏈的任意組 合，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含序列表中的SEQ ID NO: 12 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 14 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 16 的 氨基酸殘基20-140、SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-140、SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 22 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 38 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 40 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 42 的氨基酸殘基 20-140 或 SEQ ID NO: 44 的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序 列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129、SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129、SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129、SEQ ID NO: 30的氨基酸殘基21-129、SEQ ID NO: 46的氨 基酸殘基21-129或SEQ ID NO: 48的氨基酸殘基21-129。
[0132] 作為一個(gè)優(yōu)選組合，可以例舉：包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨 基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-140,且所 述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨 基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129;包含 重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所 述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨 基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-140,且所 述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨 基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129;包含 重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所 述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16的氨 基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基20-140,且所 述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨 基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129;包含 重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所 述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 18的氨 基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基20-140,且所 述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨 基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129;包含 重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包 含SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129;或包含重鏈和輕鏈的抗體， 所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 22的 氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列 包含SEQ ID NO: 30的氨基酸殘基21-129。
[0133] 作為一個(gè)更優(yōu)選的組合，可以例舉：包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含 SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的 氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘 基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 12的氨 基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-234 的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基 20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234的氨基 酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-466 的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列； 包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-466的氨基酸 序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈 和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且 所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的 抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈 具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所 述重鏈具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含 SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具 有包含SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含 SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 26的 氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 18的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘 基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 20的氨 基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234 的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基 20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-234的氨基酸 序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基20-466的 氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；或 包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 22的氨基酸殘基20-466的氨基酸 序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 30的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列。
[0134] 作為另一個(gè)更優(yōu)選的組合，可以例舉：包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含 如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-140， 且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24 的氨基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈 可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如 下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基21-129; 包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序 列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈 可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗 體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 38 的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序 列包含SEQ ID NO: 48的氨基酸殘基21-129;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含 如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 40的氨基酸殘基20-140， 且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 46 的氨基酸殘基21-129 ;包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈 可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 42的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如 下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129; 或包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈含有包含如下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，所述氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 44的氨基酸殘基20-140,且所述輕鏈含有包含如下氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-129。
[0135] 作為最優(yōu)選的組合，可以例舉：包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基 酸殘基21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14 的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸殘基 21-234的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 14的氨基 酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基21-234 的氨基酸序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 38的氨基酸殘基 20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 48的氨基酸殘基21-234的氨基酸 序列；包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 40的氨基酸殘基20-466的 氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 46的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；包 含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 42的氨基酸殘基20-466的氨基酸序 列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列；或包含重鏈 和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 44的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且 所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基21-234的氨基酸序列。
[0136] 此外，本發(fā)明的抗體包括人抗體。人抗-Siglec-15抗體是指僅由源自人染色體的 抗體基因序列編碼的人抗體。通過(guò)使用生產(chǎn)人抗體的小鼠的方法可以獲得人抗-Siglec-15 抗體，所述小鼠具有含有人抗體的重鏈和輕鏈基因的人染色體片段（參見Tomizuka，K. 等人，Nature Genetics (1997) 16，第 133-143 頁(yè)；Kuroiwa, Y?等人，Nucl. Acids Res. (1998) 26，第3447-3448頁(yè)；Yoshida, H?等人，Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10,第 69-73 頁(yè)（Kitagawa, Y. , Matsuda, T.和 Iijima, S?編），Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K?等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97,第 722-727 頁(yè)，等）。
[0137] 具體地可以如下建立這種生產(chǎn)人抗體的小鼠。通過(guò)制備敲除的動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物，并使這些動(dòng)物交配，建立遺傳修飾的動(dòng)物，其中已經(jīng)破壞了內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈 基因基因座，并替代地，經(jīng)由酵母人工染色體（YAC)載體等已經(jīng)導(dǎo)入了人免疫球蛋白重鏈和 輕鏈基因基因座。
[0138] 此外，根據(jù)基因工程技術(shù)，通過(guò)使用分別編碼這樣的人抗體的重鏈和輕鏈的cDNA， 并優(yōu)選使用包含該cDNA的載體，轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，培養(yǎng)生產(chǎn)重組人單克隆抗體的轉(zhuǎn)化體，由 此也可從培養(yǎng)上清液獲得該抗體。在這里，例如，可以使用真核細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸 如CHO細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞作為宿主。
[0139] 此外，還已知獲得從人抗體文庫(kù)篩選出來(lái)的噬菌體展示-衍生的人抗體的方法 (參見 Wormstone, I. M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7)，第2301-2308 頁(yè)；Carmen, S?等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002)，I (2)，第 189-203 頁(yè)；Siriwardena, D?等人，Opthalmology (2002) 109 (3)，第 427-431 頁(yè)，等）。
[0140] 例如，可以使用噬菌體展示法，其中在噬菌體表面上表達(dá)人抗體的可變區(qū)作為單 鏈抗體（scFv)，并選擇結(jié)合抗原的噬菌體（Nature Biotechnology (2005)，23，（9)， 第1105-1116頁(yè)）。通過(guò)分析基于與抗原的結(jié)合所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼 結(jié)合抗原的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果確定了結(jié)合抗原的scFv的DNA序列，通過(guò) 制備具有該序列的表達(dá)載體，并將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦幸员磉_(dá)它，可以獲得人抗體 (W0 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12,第 433-455 頁(yè)，Nature Biotechnology (2005) 23 (9),第 1105-1116 頁(yè)）。
[0141] 通過(guò)在實(shí)施例3或10等中所述的方法，可以評(píng)價(jià)上述抗體的結(jié)合抗原的性質(zhì)，并 可以選擇優(yōu)選的抗體。作為對(duì)比抗體的性質(zhì)時(shí)的另一個(gè)指標(biāo)的一個(gè)例子，可以例舉抗體的 穩(wěn)定性。示差掃描量熱法0SC)是能夠快速且準(zhǔn)確地測(cè)量熱變性中點(diǎn)溫度（Tm)的方法，所 述熱變性中點(diǎn)溫度是蛋白的相對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的有利指標(biāo)。通過(guò)使用DSC測(cè)量Tm值并對(duì)比該 值，可以對(duì)比熱穩(wěn)定性的差異。已知，抗體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯示出與抗體的熱穩(wěn)定性的某種關(guān) 聯(lián)性（Lori Burton,等人，Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, 第265-273頁(yè)），通過(guò)使用熱穩(wěn)定性作為指標(biāo)，可以選擇出優(yōu)選的抗體。用于選擇抗體的其 它指標(biāo)的例子如下：在適當(dāng)宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量較高，在水性溶液中的聚集性較低。例如，顯 示出最高產(chǎn)量的抗體不總是顯示出高熱穩(wěn)定性，因此，通過(guò)基于上述指標(biāo)做出綜合性評(píng)價(jià) 來(lái)選擇最適合施用給人的抗體是必要的。
[0142] 此外，還已知這樣的方法，其中使用適當(dāng)?shù)慕宇^，連接抗體的全長(zhǎng)重鏈和輕鏈序 列，由此得到單鏈免疫球蛋白（Lee, H-S,等人，Molecular Immunology (1999) 36，第 61-71 頁(yè)；Shirrmann, T?等人，mAbs (2010)，2，（1)第 1-4 頁(yè)）。通過(guò)二聚化這樣的 單鏈免疫球蛋白，得到的二聚體可以具有與本身是四聚體的抗體類似的結(jié)構(gòu)和活性。此外， 本發(fā)明的抗體可以是具有單個(gè)重鏈可變區(qū)且不具有輕鏈序列的抗體。這樣的抗體被稱作 單結(jié)構(gòu)域抗體（SdAb)或納米體（nanobody)，實(shí)際上，在駱駝和羊駝中觀察到它，且已經(jīng)報(bào) 道具有抗原結(jié)合親和力（Muyldemans S?等人，Protein Eng. (1994) 7(9)，1129-35， Hamers- Casterman C?等人，Nature (1993) 363 (6428) 446-8)。上述抗體還可以視作 根據(jù)本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段的類型。
[0143] 此外，通過(guò)控制糖基化(其中聚糖結(jié)合到本發(fā)明的抗體上)，可能增強(qiáng)抗體-依賴 性的細(xì)胞毒性活性。關(guān)于控制抗體的糖基化的技術(shù)，已知WO 99/54342、WO 00/61739、WO 02/31140等。但是，所述技術(shù)不限于此。
[0144]在首先分離抗體基因并然后將該基因?qū)脒m當(dāng)宿主中來(lái)制備抗體的情況下，可以 使用適當(dāng)宿主和適當(dāng)表達(dá)載體的組合。抗體基因的具體例子包括編碼在本說(shuō)明書中描述的 抗體的重鏈序列的基因和編碼其輕鏈序列的基因的組合。當(dāng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，可能將重鏈 序列基因和輕鏈序列基因插入相同的表達(dá)載體中，且也可能分別插入不同的表達(dá)載體中。 在使用真核細(xì)胞作為宿主的情況下，可使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真核微生物。作為動(dòng)物 細(xì)胞，可以例舉（1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，猿COS細(xì)胞（Gluzman，Y.，Cell，（1981) 23， 第175-182頁(yè)，ATCC CRL-1650)的二氫葉酸還原酶-缺陷株（Urlaub, G.和0^8丨11，1. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77，第 4126-4220 頁(yè)），鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3 (ATCCNo. CRL-1658)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CH0細(xì)胞；ATCC: CCL-61)。此外，在使用原 核細(xì)胞的情況下，例如，可以例舉大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。通過(guò)轉(zhuǎn)化，向這些細(xì)胞中導(dǎo)入 靶抗體基因，并在體外培養(yǎng)這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可得到該抗體。在上述的培養(yǎng)方法中，產(chǎn)率有 時(shí)可能隨抗體的序列而變化，因此，有可能通過(guò)使用產(chǎn)量作為指標(biāo)，在具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性 的抗體中選擇可以容易地生產(chǎn)作為藥物的抗體。
[0145] 本發(fā)明的抗體的同種型沒有限制，其例子包括IgG (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、 IgA (IgAl、IgA2)、IgD和IgE，且其優(yōu)選的例子包括IgG和IgM，且其更優(yōu)選的例子包括IgGl 和 IgG2。
[0146] 此外，本發(fā)明的抗體可以是具有抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體抗原結(jié)合片段或其修 飾的片段。通過(guò)用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶處理抗體，或根據(jù)基因工程技術(shù)修 飾抗體基因，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)修飾的基因，可以得到抗體的片段。在這些抗體片 段中，具有全長(zhǎng)抗體分子的全部或一些功能的片段可以稱為所述抗體的抗原結(jié)合片段。作 為抗體的功能，通?？梢岳e抗原結(jié)合活性、中和抗原活性的活性、增強(qiáng)抗原活性的活性、 抗體-依賴性的細(xì)胞毒性活性、補(bǔ)體-依賴性的細(xì)胞毒性活性以及補(bǔ)體-依賴性的細(xì)胞的 細(xì)胞毒性活性。根據(jù)本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段的功能是對(duì)Siglec-15的結(jié)合活性，優(yōu) 選抑制破骨細(xì)胞形成的活性，更優(yōu)選抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合過(guò)程的活性。
[0147] 抗體片段的例子包括Fab、F (ab'）2、Fv、單鏈Fv (scFv，其中重鏈和輕鏈的Fv分 子通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^相連）、雙抗體、線性抗體、以及由抗體片段組成的多特異性抗體。此外， Fab'（通過(guò)在還原條件下處理F (ab'）2而得到的抗體可變區(qū)中的單價(jià)片段）也視作抗體片 段。
[0148] 此外，本發(fā)明的抗體可以是對(duì)至少兩種不同抗原具有特異性的多特異性抗體。通 常，這樣的分子結(jié)合兩種抗原（即，雙特異性抗體)，但是，本文使用的"多特異性抗體"包括 具有對(duì)兩種或更多種(例如，3種）抗原的特異性的抗體。
[0149] 本發(fā)明的多特異性抗體可以是全長(zhǎng)抗體或這樣的抗體的片段(例如，F(xiàn)(ab'）2雙特 異性抗體)。通過(guò)連接兩類抗體的重鏈和輕鏈（HL對(duì))，可以制備雙特異性抗體，或者通過(guò)融 合生產(chǎn)不同單克隆抗體的雜交瘤，以制備生產(chǎn)雙特異性抗體的融合細(xì)胞，也可以制備雙特 異性抗體（Millstein 等人，Nature (1983) 305，第 537-539 頁(yè)）。
[0150] 本發(fā)明的抗體可以是單鏈抗體(也稱為scFv)。通過(guò)經(jīng)由多肽接頭連接抗體的重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，可以獲得單鏈抗體（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Il3 (Rosenburg 和 Moore 編，Springer Verlag, New York,第 269_315 頁(yè) (1994)，Nature Biotechnology (2005)，23，第 1126-1136 頁(yè)）。此外，通過(guò)經(jīng)由多肽接頭 連接兩個(gè)scFv分子生成的BiscFv片段，也可用作雙特異性抗體。
[0151] 制備單鏈抗體的方法是在本【技術(shù)領(lǐng)域】中已知的（參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 4,946, 778、5, 260, 203、5,091，513、5,455,030 等）。在該 scFv 中，通過(guò)不形成綴合物的 接頭，優(yōu)選通過(guò)多肽接頭，連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)（Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)，85，第 5879-5883 頁(yè)）。在 scFv 中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可 變區(qū)可以源自相同抗體或不同抗體。作為用于連接可變區(qū)的多肽接頭，例如使用由12-19 個(gè)殘基組成的給定單鏈肽。
[0152] 可如下獲得編碼scFv的DNA:使用編碼全部氨基酸序列或所需的部分氨基酸序列 (選自上述抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)及其輕鏈或輕鏈可變區(qū)）的DNA作為模板，并使用限定 其兩端的引物對(duì)，通過(guò)PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)組合編碼多肽接頭部分的DNA和限定其兩端 的引物對(duì)，以便將其兩端分別連接重鏈和輕鏈，進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。
[0153] 此外，一旦制備編碼scFv的DNA以后，根據(jù)常規(guī)方法，可以獲得包含該DNA的表達(dá) 載體以及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主。此外，通過(guò)使用獲得的宿主，根據(jù)常規(guī)方法，可以獲得 scFv。通過(guò)以與上述相同的方式獲得基因并表達(dá)該基因，可以在宿主中生產(chǎn)其抗體片段。
[0154] 可以使本發(fā)明的抗體多聚化，以增加其對(duì)抗原的親和性。待多聚化的抗體可以是 一類抗體，或識(shí)別相同抗原的多個(gè)表位的多個(gè)抗體。作為多聚化抗體的方法，可以例舉的是 使IgG CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合兩個(gè)scFv分子，結(jié)合抗生蛋白鏈菌素，導(dǎo)入螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序 等。
[0155] 本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，它是具有不同氨基酸序列的多類抗-Siglec-15 抗體的混合物。作為多克隆抗體的一個(gè)例子，可以例舉具有不同CDR的多類抗體的混合物。 培養(yǎng)生產(chǎn)不同抗體的細(xì)胞的混合物，并從得到的培養(yǎng)物純化抗體可用作這樣的多克隆抗體 (參見 WO 2004/061104)。
[0156] 本發(fā)明的抗體可以是與上述抗體的重鏈和/或輕鏈相比具有80%至99%同源性的 抗體。通過(guò)組合與上述重鏈氨基酸序列具有高同源性的序列以及與上述輕鏈氨基酸序列具 有高同源性的序列，可能選擇這樣的抗體：其具有與上述抗體中的每一種相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合 親和力、抑制破骨細(xì)胞形成的活性和/或抑制破骨細(xì)胞性骨吸收的活性。所述同源性通常 是80%或更多的同源性，優(yōu)選地90%或更多的同源性，更優(yōu)選地95%或更多的同源性，和最 優(yōu)選地99%或更多的同源性。此外，通過(guò)組合包括重鏈和/或輕鏈氨基酸序列中的一個(gè)至 幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，也可能選擇具有與上述抗體中的 每一種相當(dāng)?shù)乃蟹N類活性的抗體。要取代、缺失和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目通常是 10個(gè)或更少，優(yōu)選地5-6個(gè)或更少，更優(yōu)選地2-3個(gè)或更少，和最優(yōu)選地1個(gè)。
[0157] 順便一提，已知的是，缺失由哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的抗體的重鏈的羧基端處的 任意賴氨酸殘基（Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))，且還已知的是， 缺失下述2個(gè)氨基酸殘基：在這樣的重鏈的羧基端處的甘氨酸和賴氨酸，并將位于羧基端 處的任意脯氨酸殘基新酰胺化（Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。但是， 重鏈序列的這樣的缺失和修飾不會(huì)影響抗體的抗原結(jié)合親和力和效應(yīng)子功能（補(bǔ)體激活、 抗體依賴性的細(xì)胞毒性活性等）。因此，本發(fā)明還包括進(jìn)行上述修飾的抗體，并且可以例舉 其中已經(jīng)缺失了重鏈羧基端處的1個(gè)或2個(gè)氨基酸的缺失變體，通過(guò)它們的酰胺化得到的 缺失變體（例如，其中在羧基端位點(diǎn)處的脯氨酸殘基已經(jīng)被酰胺化的重鏈），等。但是，其中 根據(jù)本發(fā)明的抗體的重鏈的羧基端殘基已經(jīng)被缺失的缺失變體不限于上述變體，只要它具 有抗原結(jié)合親和力和效應(yīng)子功能即可。構(gòu)成本發(fā)明的抗體的2個(gè)重鏈可以包含全長(zhǎng)重鏈和 選自上述缺失變體的任意一個(gè)重鏈，或可以包含從其中選擇的相組合的任意2個(gè)重鏈。每 個(gè)缺失變體的相對(duì)量可以被在根據(jù)本發(fā)明的抗體的生產(chǎn)中使用的哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的類 型和培養(yǎng)條件影響，但是，一個(gè)實(shí)施例是這樣的情況：作為根據(jù)本發(fā)明的抗體的主要組分，2 條重鏈兩者均包括在羧基端處的1個(gè)氨基酸殘基的缺失。
[0158] 使用 Blast 算法 2. 2. 2 版（Altschul, Stephen F.，Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)，使用默認(rèn)參數(shù)， 可以確定2個(gè)氨基酸序列之間的同源性。通過(guò)訪問(wèn)網(wǎng)站www. ncbi. nlm. nih. gov/blast, 也可以通過(guò)因特網(wǎng)使用Blast算法。順便一提，通過(guò)Blast算法，計(jì)算同一性和確定性 (positivity)的2類百分比值。所述同一性是，當(dāng)要確定其同源性程度的2個(gè)氨基酸序列 中的氨基酸殘基彼此匹配時(shí)的值，所述確定性是還考慮具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基所 得到的值。在本說(shuō)明書中，將當(dāng)氨基酸殘基彼此匹配時(shí)的同一性值用作同源性值。
[0159] 還可以使用與不同類型的分子(諸如聚乙二醇（PEG)，作為抗體的修飾物質(zhì)）中的 任一種結(jié)合的抗體。
[0160] 此外，本發(fā)明的抗體可以是任一種這樣的抗體和另一種藥物之間形成的綴合物的 形式(免疫綴合物)。這樣的抗體的例子包括其中抗體綴合到放射性物質(zhì)或具有藥理作用的 化合物上的那些（Nature Biotechnology (2005) 23，第 1137-1146 頁(yè)）。
[0161] 可以將所得抗體純化至同質(zhì)。使用常規(guī)的蛋白分離和純化方法，可以進(jìn)行抗體的 分離和純化。例如，通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇和組合柱色譜法、過(guò)濾器過(guò)濾、超濾、鹽析、透析、制備 聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等，可以分離和純化抗體（Strategies for protein Purification and Charcterization:A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak等人 編，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies:A Laboratory Manual. Harlow and David Lane 編，Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但是方法不限于 此。
[0162] 這些色譜法的例子包括親和色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過(guò)濾色譜 法、反相色譜法和吸附色譜法。
[0163] 使用液相色譜法，諸如HPLC或FPLC，可以進(jìn)行這些色譜法。
[0164] 作為用于親和色譜法的柱子，可以例舉蛋白A柱和蛋白G柱。
[0165] 例如，作為使用蛋白A柱的柱子，可以例舉HyperD、P0R0S、瓊脂糖FF (Pharmacia)等。
[0166] 此外，通過(guò)使用其上固定有抗原的載體，利用抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性，也可純化抗 體。
[0167] 4.含有抗-Siglec-15抗體的藥物 從在上面的"3.抗-Siglec-15抗體的制備"部分中所述的方法得到的抗-Siglec-15 抗體，可以獲得中和Siglec-15的生物活性的抗體。這些中和Siglec-15的生物活性的抗 體會(huì)在體內(nèi)抑制Siglec-15的生物活性，S卩，破骨細(xì)胞的分化和/或成熟，因此可用作藥 物，用作由破骨細(xì)胞的異常分化和/或成熟造成的異常骨代謝的治療劑和/或預(yù)防劑。異 常骨代謝可以是任何以凈骨流失（骨質(zhì)減少或骨質(zhì)溶解）為特征的障礙。一般而言，用 抗-Siglec-15抗體的治療和/或預(yù)防應(yīng)用于需要抑制骨吸收的情況?？捎每?Siglec-15 抗體治療和/或預(yù)防的異常骨代謝的例子包括：骨質(zhì)疏松癥（絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性 骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥）、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā) 性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、假體關(guān)節(jié)周 圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和成骨不全，但是，異常 骨代謝不限于此，只要它是伴有破骨細(xì)胞造成的凈骨流失的疾病即可。作為上述藥物使用 的抗-Siglec-15抗體的例子包括通過(guò)在"3.抗-Siglec-15抗體的制備"中所述的方法從 #24A3抗體制備的嵌合抗體和人源化抗體。此外，共享與#24A3抗體相同表位的嵌合抗體、 人源化抗體和人抗體也可用作藥物。通過(guò)觀察這些抗體是否結(jié)合Siglec-15的相同的特定 部分肽，可以證實(shí)某種抗-Siglec-15抗體是否共享與#24A3抗體相同的表位。此外，如果 某種抗-Siglec-15抗體與#24A3抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Siglec-15,則也可確定這些抗體共享相同 的表位。
[0168] 通過(guò)例如抑制過(guò)表達(dá)Siglec-15的細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的活性，可以確定 抗-Siglec-15抗體的中和Siglec-15的生物活性的體外活性。例如，在不同的濃度，向小 鼠單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系RAW 264. 7細(xì)胞或RAW 264細(xì)胞添加抗-Siglec-15抗體，并可 以確定抑制通過(guò)RANKL或TNF- a的刺激向破骨細(xì)胞分化的活性。此外，在不同的濃度，向 骨髓-衍生的原代培養(yǎng)細(xì)胞添加抗-Siglec-15抗體，可以確定抑制通過(guò)RANKL、TNF- a或 活性維生素D3的刺激向破骨細(xì)胞分化的活性。此外，在不同的濃度，向正常人破骨細(xì)胞前 體細(xì)胞（Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，可從Sanko Junyaku Co., Ltd.，目錄號(hào)2T-110得到)添加抗-Siglec-15抗體，可以確定抑制通過(guò)RANKL和M-CSF的 刺激向破骨細(xì)胞分化的活性。通過(guò)使用酒石酸鹽-抗性的酸性磷酸酶（TRAP)活性的抑制 為指標(biāo)，可以確定這樣的對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。此外，通過(guò)使用TRAP-陽(yáng)性的多核破 骨細(xì)胞形成的抑制（即破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制）為指標(biāo)，也可以確定對(duì)破骨細(xì)胞分化的 抑制效應(yīng)。此外，在使用股骨-和/或脛骨_衍生的細(xì)胞的陷窩測(cè)定實(shí)驗(yàn)（Takada等人， Bone和Mineral, (1992) 17，347-359)中，通過(guò)以不同濃度向股骨-和/或脛骨-衍生的 細(xì)胞添加抗-Siglec-15抗體，并觀察牙質(zhì)切片上的陷窩形成，可以確定抑制破骨細(xì)胞的骨 吸收的體外活性。作為用于確定抑制破骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨吸收的體外活性的系統(tǒng)，也可以使 用涂有銪-綴合的人膠原的板?？梢匀缦率褂脤?shí)驗(yàn)動(dòng)物確認(rèn)抗-Siglec-15抗體對(duì)異常骨 代謝的體內(nèi)治療或預(yù)防效應(yīng)：例如，將抗-Siglec-15抗體施用給骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型或 過(guò)表達(dá)Siglec-15的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并測(cè)量破骨細(xì)胞的任何變化。作為骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模 型，可以例舉切除卵巢的大鼠和切除卵巢的猴?？梢匀缦麓_定抗-Siglec-15抗體對(duì)骨吸收 活性的抑制作用：將抗-Siglec-15抗體施用給這樣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，然后測(cè)量骨礦物質(zhì)密度或 骨代謝標(biāo)志物。骨代謝標(biāo)志物的例子包括、但不限于：骨吸收標(biāo)志物諸如尿的脫氧吡啶啉、 尿的I型膠原的N-端肽（NTX)、尿的I型膠原的C-端肽（CTX)、血液NTX、血液CTX和血液 酒石酸鹽抗性的酸性磷酸酶（TRAP5b)，以及骨形成標(biāo)志物諸如血液骨堿性磷酸酶（BAP)、 血液骨鈣素（BGP)和前膠原I型C-肽（PlNP)。
[0169] 這樣得到的中和Siglec-15的生物活性的抗體可用作藥物，特別是用作治療或預(yù) 防異常骨代謝的藥物組合物，所述異常骨代謝例如骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨 破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞，或用作這樣的疾病的免疫學(xué)診斷的抗體。
[0170] 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的治療中，一個(gè)主要的難題是伴隨該疾病的發(fā)生的骨流 失。業(yè)已報(bào)道在伴隨RA的這種骨流失中破骨細(xì)胞起主要作用。認(rèn)為作為破骨細(xì)胞誘導(dǎo)（分 化和成熟）和活化以及RA中的骨破壞的原因最重要的細(xì)胞因子是RANKL和TNF- a(Romas E.等人，Bone 30，第340-346頁(yè)，2002)。作為RANKL的誘餌受體的0CIF/0PG可抑制 由RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，但是不抑制由TNF-a誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。另一方面，根 據(jù)本發(fā)明的抗-Siglec-15抗體會(huì)有效地抑制由RANKL和TNF-a兩者誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形 成。因此，預(yù)期本發(fā)明的抗-Siglec-15抗體可以比RANKL阻滯劑（0CIF/0PG、抗-RANKL抗 體等）更強(qiáng)烈地抑制RA等中的TNF-a誘導(dǎo)的骨流失和骨破壞。
[0171] 作為一個(gè)例子，對(duì)于異常骨代謝的治療或預(yù)防，抗-Siglec-15抗體可以單獨(dú)施用 或與骨疾病的至少一種其它治療劑組合施用。作為另一個(gè)例子，抗-Siglec-15抗體可以 與治療有效量的異常骨代謝的治療劑組合施用?？膳c抗-Siglec-15抗體組合施用的其它 治療劑的例子包括但不限于：二膦酸鹽（例如，阿屈膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊 卡膦酸鹽、帕米膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來(lái)膦酸鹽）、活性維生素D 3、降鈣素及其衍生物、激 素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌）、 鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非留體類抗炎藥（例如，塞來(lái)考昔和羅非昔布）、可溶性的 TNF受體（例如，依那西普）、抗-TNF-a抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段（例如，英夫利 昔單抗）、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白）抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I 受體拮抗劑（例如，阿那白滯素）、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段（例如， 托珠單抗）、抗-RANKL抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段（例如，地舒單抗）和OCIF (破 骨細(xì)胞生成抑制因子）。根據(jù)異常骨代謝的狀態(tài)或希望的治療和/或預(yù)防程度，可以施用 2或3或更多種其它治療劑，并且這些其它治療劑可以通過(guò)封裝在同一制劑中全部一起施 用。其它治療劑和抗-Siglec-15抗體還可以通過(guò)封裝在同一制劑中全部一起施用。另 夕卜，抗-Siglec-15抗體和其它治療劑還可以通過(guò)封裝在分開制劑中全部一起施用。此外， 其它藥物劑和抗-Siglec-15抗體還可以接連地分開施用，也就是說(shuō)，在施用其它治療劑以 后，可以施用含有抗-Siglec-15抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段作為活性成分的治療劑， 或者在施用含有抗-Siglec-15抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段作為活性成分的治療劑以 后，可以施用其它治療劑。在基因治療中施用的情況下，可以將蛋白性的骨疾病治療劑的基 因和抗-Siglec-15抗體的基因插入到相同啟動(dòng)子區(qū)或不同啟動(dòng)子區(qū)的下游，且可以導(dǎo)入 到相同載體或不同載體中。
[0172] 通過(guò)使骨疾病治療劑與抗-Siglec-15抗體或其片段綴合，可以制備如在M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress"， Advanced Drug Delivery Reviews，（2001) 53，171-216中所述的革巴向藥物綴合物。為達(dá)到該目的， 可使用除抗體分子外的任何抗體片段，只要其沒有完全失去識(shí)別破骨細(xì)胞的能力，其例 子包括諸如Fab、F(ab'）2和Fv等片段。在本發(fā)明中，也可以以相同的方式使用抗體和 片段?？?Siglec-15抗體或其片段與骨疾病治療劑形成的綴合物可以是在下述文獻(xiàn)中 所述的多種形式中的任一種：M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress，'，Advanced Drug Delivery Reviews，(2001) 53，171-216，G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques"Academic Press, California (1996)，Putnam 和 J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity^Advances in Polymer Science (1995) 122，55-123等。也就是說(shuō)，可以例舉這樣的綴合物，其中抗-Siglec-15 抗體和骨疾病治療劑彼此化學(xué)地直接綴合，或經(jīng)由諸如寡肽等間隔物綴合，以及經(jīng)由適當(dāng) 的藥物載體而形成的綴合物。藥物載體的例子包括脂質(zhì)體和水溶性聚合物。經(jīng)由這種藥 物載體形成的綴合物的更具體例子包括：這樣的綴合物，其中將抗體和骨疾病治療劑摻入 脂質(zhì)體中，并將脂質(zhì)體與抗體彼此綴合；和這樣的綴合物，其中骨疾病治療劑與水溶性聚合 物(分子量為約1，000-100, 〇〇〇的化合物）化學(xué)地直接綴合，或經(jīng)由諸如寡肽等間隔物綴 合，并將抗體與水溶性聚合物綴合。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以實(shí)現(xiàn)抗體(或其 片段）與骨疾病治療劑或藥物載體(諸如脂質(zhì)體或水溶性聚合物）的綴合，所述方法例如描 述在下述文獻(xiàn)中的方法：G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques''Academic Press, California (1996), Putnam 和 J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity"Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的方法，可以實(shí)現(xiàn)骨疾病治療劑在脂質(zhì)體中的摻入，所述方法例如描述在下述文獻(xiàn)中 的方法：D. D. Lasic "Liposomes:From Physics to Applications，'Elsevier Science Publishers B. V.，Amsterdam (1993)等。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以實(shí)現(xiàn)骨 疾病治療劑與水溶性聚合物的綴合，所述方法例如描述在下述文獻(xiàn)中的方法：D. Putnam和 J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity，'Advances in Polymer Science (1995)122, 55-123。除上述方法外，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，通過(guò)基因工 程，可以制備抗體(或其片段）與蛋白性的骨疾病治療劑(或其片段）的綴合物。
[0173] 本發(fā)明也提供了藥物組合物，其含有治療和/或預(yù)防有效量的抗-Siglec-15抗體 和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。
[0174] 本發(fā)明也提供了藥物組合物，其含有治療和/或預(yù)防有效量的抗-Siglec-15抗 體、治療和/或預(yù)防有效量的至少一種骨疾病治療劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶 齊U、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。骨疾病治療劑的例子包括但不限于：二膦酸鹽（例如，阿屈 膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊卡膦酸鹽、帕米膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來(lái)膦酸鹽）、活 性維生素0 3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普 黃酮、維生素1(2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非甾體類抗炎藥（例如，塞 來(lái)考昔和羅非昔布）、可溶性的TNF受體（例如，依那西普）、抗-TNF- a抗體或所述抗體的 抗原結(jié)合片段（例如，英夫利昔單抗）、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白）抗體或所述 抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I受體拮抗劑（例如，阿那白滯素）、抗-IL-6受體抗體或所述抗 體的抗原結(jié)合片段（例如，托珠單抗）、抗-RANKL抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段（例如， 地舒單抗）和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子）。
[0175] 在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中可接受的、用于制劑中的物質(zhì)優(yōu)選地在其施用量和 施用濃度對(duì)被施用藥物組合物的人沒有毒性。
[0176] 本發(fā)明的藥物組合物可以包含能改變或維持其pH、滲透壓、粘度、透明度、顏色、 等張性、無(wú)菌狀態(tài)、穩(wěn)定性、溶解度、釋放速率、吸收速率或滲透性的藥用物質(zhì)。這樣的藥用 物質(zhì)的例子包括但不限于：氨基酸諸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨 酸；抗微生物劑；抗氧化劑諸如抗壞血酸、硫酸鈉和亞硫酸氫鈉；緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬 酸鹽、硼酸鹽緩沖劑、碳酸氫鈉和Tris-HCl溶液；填充劑諸如甘露醇和甘氨酸；螯合劑諸 如四乙酸乙二胺（EDTA);絡(luò)合劑諸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、環(huán)糊精和羥丙基-0-環(huán) 糊精；增量劑諸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物諸如單糖類和二糖類；著色劑； 矯味劑；稀釋劑；乳化劑；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷；防腐劑諸如低分子量多肽、成鹽 抗衡離子、苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙 酯、氯己定、山梨酸和過(guò)氧化氫；溶劑諸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇諸如甘露醇和山 梨醇；助懸劑；表面活性劑諸如脫水山梨糖醇酯、聚山梨酯（諸如聚山梨酯20和聚山梨酯 80)、三硝基甲苯（Triton)、氨丁三醇、卵磷脂和膽固醇；穩(wěn)定性增強(qiáng)劑諸如蔗糖和山梨醇； 彈性增強(qiáng)劑諸如氯化鈉、氯化鉀和甘露醇和山梨醇；轉(zhuǎn)運(yùn)劑；賦形劑；和/或藥物佐劑。這些 為了藥用加入的物質(zhì)的量?jī)?yōu)選為抗-Siglec-15抗體重量的0. 01-100倍，特別優(yōu)選0. 1-10 倍。根據(jù)組合物應(yīng)用的疾病、應(yīng)用的施用途徑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)卮_定制劑中藥 物組合物的優(yōu)選配方。
[0177] 藥物組合物中的賦形劑和載體可以是液體或固體形式。適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體可以 是注射用水、生理鹽水、人工腦脊液或腸胃外施用中常用的其它物質(zhì)。此外，中性生理鹽水 或含有血清白蛋白的生理鹽水也可以用作載體。藥物組合物可以含有PH7. 0-8. 5的Tris 緩沖液、PH4. 0-5. 5的乙酸鹽緩沖液或pH 3. 0-6. 2的檸檬酸鹽緩沖液。此外，這樣的緩沖 液可以補(bǔ)充山梨醇或其它化合物。本發(fā)明的藥物組合物的例子包括含有抗-Siglec-15抗 體的藥物組合物、以及含有抗-Siglec-15抗體和至少一種骨疾病治療劑的藥物組合物。將 本發(fā)明的藥物組合物制成凍干產(chǎn)品或液體形式，作為具有所選擇的組成和所需的純度的藥 物。也可以使用適當(dāng)?shù)馁x形劑(如蔗糖)，使含有抗-Siglec-15抗體的藥物組合物以及含有 抗-Siglec-15抗體和至少一種異常骨代謝治療劑的藥物組合物形成凍干產(chǎn)品。
[0178] 本發(fā)明的藥物組合物可以制成用于腸胃外施用或用于經(jīng)口服施用的胃腸道吸收。 制劑的組成和濃度可根據(jù)施用方法確定。本發(fā)明的藥物組合物中所含的抗-Siglec-15抗 體對(duì)Siglec-15的親和力越高，也就是說(shuō)，其對(duì)Siglec-15的解離常數(shù)（Kd值）越低，則 抗-Siglec-15抗體可以表現(xiàn)出的藥物效能越多(甚至在減少給人的劑量時(shí))。因此，基于該 考慮，也可以確定本發(fā)明的藥物組合物對(duì)人的劑量。對(duì)于劑量，在給人施用人抗-Siglec-15 抗體的情況下，可以以約〇. 1-100 mg/kg (每1~180天一次）的劑量施用抗體。
[0179] 本發(fā)明的藥物組合物的劑型的例子包括：包括輸注在內(nèi)的注射劑、栓劑、經(jīng)鼻劑、 舌下劑和經(jīng)皮吸收劑。 實(shí)施例
[0180] 在下文中，參考實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明不限于此。應(yīng)當(dāng)指 出，除非另有說(shuō)明，在下述實(shí)施例中的與基因操作有關(guān)的各個(gè)操作均根據(jù)在"Molecular Cloning"（Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年出版）中所述的方法進(jìn)行，或在使用市售的試劑或試劑盒的情況 下，根據(jù)附隨的說(shuō)明書使用它們。
[0181] 實(shí)施例1 含有可溶性人Siglec-15蛋白的培養(yǎng)溶液的制備及其純化 通過(guò)用PCR法擴(kuò)增人Siglec-15細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域cDNA，并將所述cDNA整合進(jìn)pDN0R221 載體（由Invitrogen Corporation制造）中，制備輸入克隆。從該輸入克隆，通過(guò)重組進(jìn) pDONM中而得到表達(dá)質(zhì)粒（可溶性人Siglec-15/pDONM)，所述pDONM是被設(shè)計(jì)成使得V5 表位標(biāo)簽和6 X His標(biāo)簽添加至插入物的C端的目標(biāo)載體。將可溶性人Siglec-15/pDONM 轉(zhuǎn)染進(jìn)293-F細(xì)胞中，并對(duì)所述細(xì)胞在6-12%的CO 2濃度在37°C進(jìn)行旋動(dòng)培養(yǎng)96小時(shí)（4 天）。將培養(yǎng)溶液收集并離心，以制備含有可溶性人Siglec-15蛋白的培養(yǎng)物上清液。對(duì)如 此得到的培養(yǎng)物上清液使用Ni-Sepharose HP柱（由Amersham Biosciences, Inc?制造） 進(jìn)行部分純化，隨后使用Resource Q柱（由Amersham Biosciences, Inc?制造）進(jìn)行分 級(jí)分離。然后，通過(guò)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳（在還原條件下）和銀染色，進(jìn)行可溶性人 Siglec-15蛋白的檢測(cè)和純度測(cè)定。所以，經(jīng)證實(shí)，具有約35 kDa的分子量的蛋白（可溶性 人Siglec-15蛋白）被有效地純化并濃縮在沒有吸附至Resource Q柱的蛋白級(jí)分中。
[0182] 實(shí)施例2 生產(chǎn)大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3的雜交瘤的建立和純化的抗體的制備 用在實(shí)施例1中生產(chǎn)的純化的可溶性人Siglec-15蛋白免疫大鼠。收集用于試驗(yàn)的血 液并證實(shí)抗體滴度增加以后，將大鼠安樂(lè)死，然后切離脾。根據(jù)融合小鼠（大鼠）脾細(xì)胞和 骨髓瘤細(xì)胞的普通方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。通過(guò)篩選選擇35個(gè)具有高抗體滴度的克隆，然后 進(jìn)行第一個(gè)和第二個(gè)克隆規(guī)程。所以，本發(fā)明的發(fā)明人成功地建立了 #24A3作為具有高抗 體滴度的雜交瘤。將建立的雜交瘤以I X IO7個(gè)細(xì)胞/小鼠腹膜內(nèi)地植入裸鼠中。植入以 后，當(dāng)觀察到腹水的充分積累時(shí)，收集腹水，并對(duì)IgG級(jí)分進(jìn)行純化。通過(guò)上述操作，制備了 大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3。
[0183] 實(shí)施例3 評(píng)價(jià)大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3對(duì)人Siglec-15蛋白的結(jié)合活性 3-1)人Siglec-15 V-組結(jié)構(gòu)域的表達(dá)和純化 將編碼蛋白的DNA整合進(jìn)載體pDEST14 (Invitrogen, Corporation, 目錄號(hào) 11801-016)中，在所述蛋白中，His標(biāo)簽和因子Xa識(shí)別序列被連接至人Siglec-15 V-組 結(jié)構(gòu)域（一種多肽，其包含具有登錄號(hào)NP_998767的NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的氨基酸序列 的氨基酸殘基39-165)的N-端側(cè)。使用該質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, Inc.,目錄號(hào) 71136-4)，并在 TB 培養(yǎng)基（Invitrogen, Corporation,目錄 號(hào)22711-022)中培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過(guò)超聲，將細(xì)菌細(xì)胞勻漿化，將得到的勻漿離心，并使用 HisTrap HP柱（GE Healthcare Ltd.，目錄號(hào)17-5247-01)純化上清液。此后，用因子Xa (New England BioLabs Inc.，目錄號(hào) P8010L)切割 His 標(biāo)簽，并然后使用 Mono S5/50 GL 柱（GE Healthcare Ltd.，目錄號(hào) 17-5168-01)和Superdex 75 10/300柱（GE Healthcare Ltd.，目錄號(hào)17-5174-01)純化人Siglec-15 V-組結(jié)構(gòu)域，直到通過(guò)電泳得到分子量為14 kDa的單條帶。
[0184] 3-2)大鼠#32A3和人Siglec-15 V-組結(jié)構(gòu)域之間的解離常數(shù)的測(cè)量 使用 Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，如下測(cè)量大鼠 #24A3 抗體 和人Siglec-15 V-組結(jié)構(gòu)域之間的解離常數(shù)：將所述抗體固定化為配體，并使用所述抗原 作為分析物。此外，將大鼠#32A1抗體用作對(duì)照抗體。關(guān)于其制備方法和其重鏈和輕鏈序 列的信息，在WO 09/48072和WO 10/117011中描述了大鼠#32A1抗體。順便一提，生產(chǎn)大 鼠#32A1抗體的雜交瘤#32A1于2008年8月28日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研 究所特許生物寄托中心（International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,位于：Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566,日本)，并已經(jīng)在抗-Siglec-15 雜交瘤 #32A1的名稱下獲得登錄號(hào)FERM BP-10999。
[0185] 通過(guò)胺偶聯(lián)方法，以約50 RU,將#32A1或#24A3抗體結(jié)合至傳感器芯片CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，這經(jīng)由固定化在其上面的抗-小鼠IgG抗體（GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)實(shí)現(xiàn)。使用 HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7. 4，0? 15 M NaCl，3mMEDTA，0.05%表面活性劑P20)作為運(yùn)行緩沖液。在具有與其結(jié)合的抗體的芯 片上，以90 ii L/min的流速添加抗原溶液的稀釋系列（0. 003-2 nM)進(jìn)行233秒，隨后，監(jiān) 測(cè)解離相3600秒。作為再生溶液，以10 ii L/min的流速加入3 M MgCl2進(jìn)行30秒。在數(shù) 據(jù)分析中，使用分析軟件（Biacore T200 Evaluation軟件，1.0版）的1:1結(jié)合模型，并計(jì) 算結(jié)合速率常數(shù)（kon)、解離速率常數(shù)（koff)和解離常數(shù)（KD; KD = koff/kon)。根據(jù)結(jié) 果，#32A1 具有 I. 5E-10 [M]的 KD 值，且 #24A3 具有 7. 0E-11 [M]的 KD 值，因此，#24A3 具 有比#32A1大約2倍的親和力。
[0186] 實(shí)施例4 編碼大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3的可變區(qū)的cDNA的擴(kuò)增及其堿基序列 分析 4-1) #24A3的重鏈和輕鏈的N-端氨基酸序列的鑒別 為了鑒別#24A3的重鏈和輕鏈的N-端氨基酸序列，通過(guò)SDS-PAGE分離在實(shí)施例2中 制備的#24A3。將凝膠中的蛋白從分離以后的凝膠轉(zhuǎn)移至Sequi-Blot PVDF膜（Bio-Rad Laboratories, Inc.)。將膜用洗漆緩沖液（25 mM NaCl, 10 mM硼酸鈉緩沖液pH 8.0)洗 滌，此后通過(guò)浸入染料溶液（50%甲醇，20%乙酸，0. 05%考馬斯亮藍(lán)）中保持5分鐘進(jìn)行 染色，隨后用90%甲醇脫色。將在PVDF膜上顯影的與重鏈對(duì)應(yīng)的帶（具有較小遷移率的帶） 和與輕鏈對(duì)應(yīng)的帶（具有較大遷移率的帶）的部分切離。將與重鏈對(duì)應(yīng)的帶在少量0.5% 聚乙烯吡咯烷酮/100 mM乙酸溶液中在37°C溫育30分鐘，隨后用水洗滌。隨后，使用Pfu 焦谷氨酸氨基肽酶試劑盒（TaKaRa Bio，Inc.)除去經(jīng)修飾的N-末端殘基，隨后用水洗滌 并風(fēng)干。然后，嘗試通過(guò)自動(dòng)Edman方法（參見Edman等人（1967) Eur. J. Biochem. 1， 80)使用 Procise cLC Protein Sequencer Model 492cLC (Applied Biosystems, Inc.) 來(lái)鑒別它們各自的N-端氨基酸序列。根據(jù)結(jié)果，與#24A3的重鏈對(duì)應(yīng)的帶的N-端氨基酸 序列為VQLQQSGAELTKP，與其輕鏈對(duì)應(yīng)的帶的N-端氨基酸序列為DIVMTQSPTSMSIS。
[0187] 4-2)從生產(chǎn)#24A3的雜交瘤制備mRNA 為了擴(kuò)增含有#24A3的可變區(qū)的cDNA，使用mRNA分離試劑盒（Roche Applied Science, Inc.)從生產(chǎn)#24A3的雜交瘤制備mRNA。
[0188] 4-3) cDNA (5, -RACE-Ready cDNA)的合成 使用100 ng在上面4-2)中制備的mRNA，用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech Laboratories, Inc.)，進(jìn)行cDNA (5，-RACE-Ready cDNA)的合成。
[0189] 4-4)通過(guò)5' -RACE PCR擴(kuò)增含有#24A3重鏈可變區(qū)的cDNA和序列確定 作為用于通過(guò)PCR法擴(kuò)增#24A3重鏈基因可變區(qū)的cDNA的引物，使用UPM (通用引 物A混合物，SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒附帶）和具有序列5' -CTCCAGAGTTCCAGGTC ACGGTGACTGGC-3'（RG2AR3)的寡核苷酸。作為 UPM，使用 SMARTer RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒 (Clontech Laboratories, Inc.)附帶的一個(gè)，并基于數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠重鏈（IgG2a)恒定區(qū) 的序列來(lái)設(shè)計(jì)RG2AR3。
[0190] 使用該引物組合和在上面4-3)中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作為模板， 通過(guò)5' -RACE PCR來(lái)擴(kuò)增含有#24A3重鏈可變區(qū)的cDNA。根據(jù)SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增 試劑盒（Clontech Laboratories, Inc.)附帶的方案，使用 Touchdown PCR程序，使用 KOD -Plus- (T0Y0B0，Co.，Ltd.)作為聚合酶進(jìn)行 PCR。
[0191] 將通過(guò)5'-RACE PCR擴(kuò)增的含有重鏈可變區(qū)的cDNA使用MinElute PCR純化試劑 盒（QIAGEN, Inc.)進(jìn)行純化，并然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒（Invitrogen Corporation)進(jìn)行克隆，并進(jìn)行含有重鏈可變區(qū)的克隆cDNA的核苷酸序列的序列分析。
[0192]作為序列引物，使用具有序列 5' -CTCCAGAGITCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'（RG2AR3) 的寡核苷酸和NUP (巢式通用引物A: SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒附帶），所述RG2AR3 基于數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠重鏈恒定區(qū)的序列而設(shè)計(jì)。
[0193]使用基因測(cè)序儀（ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)或 Applied Biosystems 3730x1 Analyzer (Applied Biosystems))進(jìn)行序列分析，并且在序 列反應(yīng)中使用 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。
[0194] 編碼#24A3重鏈可變區(qū)的cDNA的經(jīng)確定的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 1表示，并且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 2表示。SEQ ID NO: 1的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列也顯示在圖1中。
[0195] 從核苷酸序列確定的#24A3重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與在上面4-1)中確定的 N-端氨基酸序列匹配。
[0196] 4-5)通過(guò)5' -RACE PCR來(lái)擴(kuò)增含有#24A3輕鏈可變區(qū)的cDNA和序列確定 作為用于通過(guò)PCR法擴(kuò)增#24A3輕鏈基因可變區(qū)的cDNA的引物，使用UPM (通用引物 A混合物，SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒附帶）和具有序列5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACAC CATCTC-3'（RKR5)的寡核苷酸。作為 UPM，使用 SMARTer RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒（Clontech Laboratories, Inc.)附帶的一個(gè)，并基于數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠輕鏈恒定區(qū)的序列來(lái)設(shè)計(jì)RKR3。
[0197] 使用該引物組合和在上面4-3)中合成的cDNA(5' -RACE-Ready cDNA)作為模板， 通過(guò)5' -RACE PCR來(lái)擴(kuò)增含有#24A3輕鏈可變區(qū)的cDNA。根據(jù)SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增 試劑盒（ClontechH Laboratories, Inc.)附帶的方案，使用 Touchdown PCR程序，使用 KOD -Plus- (T0Y0B0，Co.，Ltd.)作為聚合酶進(jìn)行 PCR。
[0198] 將通過(guò)5'-RACE PCR擴(kuò)增的含有輕鏈可變區(qū)的cDNA使用MinElute PCR純化試劑 盒（QIAGEN, Inc.)進(jìn)行純化，并然后使用Zero Blunt T0P0 PCR克隆試劑盒（Invitrogen Corporation)進(jìn)行克隆，并進(jìn)行含有輕鏈可變區(qū)的克隆cDNA的核苷酸序列的序列分析。
[0199]作為序列引物，使用具有序列 5' -TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'（RKR5)的 寡核苷酸和NUP (巢式通用引物A: SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒附帶），所述RKR5基 于數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠輕鏈恒定區(qū)的序列而設(shè)計(jì)。
[0200] 使用基因測(cè)序儀（ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)或 Applied Biosystems 3730x1 Analyzer (Applied Biosystems))進(jìn)行序列分析，并且在序 列反應(yīng)中使用 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。
[0201] 編碼#24A3輕鏈可變區(qū)的cDNA的經(jīng)確定的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3表示，并且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 4表示。SEQ ID NO: 3的核苷酸序列和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列也顯示在圖2中。從核苷酸序列確定的#24A3輕鏈可變區(qū)的氨基酸序 列與在上面4-1)中確定的N-端氨基酸序列匹配。
[0202] 實(shí)施例5 大鼠抗-人Siglec-15單克隆抗體#24A3的人嵌合抗體的基因表達(dá)構(gòu)建體的制備 5-1)嵌合的和人源化的輕鏈表達(dá)載體pCMA-LK的構(gòu)建 用限制性酶 XbaI 和 PmeI 消化質(zhì)粒 pcDNA3. 3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corporation) 得到的約5. 4 kb的片段使用In-Fusion Advantage PCR克隆試劑盒（Clontech Laboratories，Inc.)連接到含有編碼人K鏈分泌信號(hào)的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 5 表示的人K鏈恒定區(qū)的DNA片段，由此制備pcDNA3. 3/LK。
[0203] 通過(guò)使用pcDNA3. 3/LK作為模板以及還使用下述引物集合，進(jìn)行PCR，并將得 到的約3. 8 kb的片段磷酸化，隨后自我連接，由此構(gòu)建嵌合的和人源化的輕鏈表達(dá)載體 pCMA-LK，其具有信號(hào)序列、克隆位點(diǎn)和在CMV啟動(dòng)子下游的人K鏈恒定區(qū)。

【權(quán)利要求】
1. 一種抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于： 重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述⑶RH3 包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或在其中包含1-3個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列； 且 輕鏈序列含有具有⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID NO: 36表不的氨基酸序列。
2. -種抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于： 重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述⑶RH3 包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列；且 輕鏈序列含有具有⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID NO: 36表不的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含 有由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基1-121的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基1-109的輕鏈可變區(qū)序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的抗體的抗原結(jié)合片段，所述片段選自：Fab、F(ab'）2、Fab' 和Fv。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的抗體，其特征在于是scFv。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于 所述抗體是嵌合抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有由 SEQ ID NO: 8表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 10 表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于所述抗 體是人源化的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的抗體，其中所述重鏈具有人免疫球蛋白G2重鏈的恒定 區(qū)，且所述輕鏈具有人免疫球蛋白κ輕鏈的恒定區(qū)。
10. -種抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨細(xì)胞性骨吸收的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片 段，其特征在于包含： (a)選自下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列： al)包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a2)包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a3)包含由SEQ ID NO: 16表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a4)包含由SEQ ID NO: 18表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a5)包含由SEQ ID NO: 20表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a6)包含由SEQ ID NO: 22表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a7)包含由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a8)包含由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； a9)包含由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； alO)包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列； all)與選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； al2)與選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； 和 al3)在選自al)至alO)的任一個(gè)氨基酸序列中包括一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加的氨基酸序列；和 (b)選自下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列： bl)包含由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b2)包含由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b3)包含由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b4)包含由SEQ ID NO: 30表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b5)包含由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b6)包含由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的氨基酸序列； b7)與選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列具有具有至少95%的同源性的氨基酸序列； b8)與選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列具有具有至少99%的同源性的氨基酸序列； 和 b9)在選自bl)至b6)的任一個(gè)氨基酸序列中包括一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失 或添加的氨基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-129的輕鏈可變區(qū)序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或抗體的功能片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示 的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段，其特征在于包含：含有 由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466的重鏈序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-234的輕鏈序列。
25. 根據(jù)權(quán)利要求11-24中的任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包 括從其羧基端末端的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸缺失。
26. -種藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-25所述的抗體或所述 抗體的抗原結(jié)合片段。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其特征在于是異常骨代謝的治療劑和/或預(yù) 防劑。
28. -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的藥物組合物，其特征在于包含至少一種根 據(jù)權(quán)利要求1-25所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段和至少一個(gè)選自下述的成員：二 膦酸鹽、活性維生素 D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào) 節(jié)劑）、依普黃酮、維生素 K2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非甾體類抗炎 藥、可溶性TNF受體、抗-TNF-α抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激 素相關(guān)的蛋白）抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或 所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細(xì)胞 生成抑制因子）。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的藥物組合物，其中所述異常骨代謝選自：骨質(zhì)疏松 癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破 壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、假體關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨 破壞、骨佩吉特病、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和成骨不全。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì)疏松癥。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏 松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏 松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
33. -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的方法，其特征在于施用至少一種根據(jù)權(quán)利 要求1-25所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的藥物組 合物。
34. -種用于治療和/或預(yù)防異常骨代謝的方法，其特征在于同時(shí)地或接連地施用至 少一種根據(jù)權(quán)利要求1-25所述的抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或根據(jù)權(quán)利要求27所述 的藥物組合物和至少一個(gè)選自下述的成員：二膦酸鹽、活性維生素 D3、降鈣素及其衍生物、 激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素 K2 (四烯甲萘醌）、 鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素）、非留體類抗炎藥、可溶性TNF受體、抗-TNF- α抗體或所述 抗體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白）抗體或所述抗體的抗原結(jié)合 片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或 所述抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子）。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述異常骨代謝是 骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述異常骨代謝是骨質(zhì) 疏松癥。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng) 后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā) 性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
38. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-25中的任一項(xiàng)所述的抗體。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 1表示的 核苷酸序列的核苷酸1-363的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列的核 苷酸1-327的核苷酸序列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 7表示的 核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 9表示的核苷酸序列的 核苷酸61-702的核苷酸序列。
41. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的多核苷酸，其特征在于包含： (a)選自下述核苷酸序列的多核苷酸： al)包含由SEQ ID NO: 11表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a2)包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a3)包含由SEQ ID NO: 15表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a4)包含由SEQ ID NO: 17表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a5)包含由SEQ ID NO: 19表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a6)包含由SEQ ID NO: 21表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a7)包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a8)包含由SEQ ID NO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； a9)包含由SEQ ID NO: 41表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； alO)包含由SEQ ID NO: 43表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列； all)與選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； al2)與選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； al3)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含選自al)至alO)的任 一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和 al4)核苷酸序列，其包括選自al)至alO)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸 殘基的取代、缺失或添加；和 (b)選自下述核苷酸序列的多核苷酸： bl)包含由SEQ ID NO: 23表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b2)包含由SEQ ID NO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b3)包含由SEQ ID NO: 27表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b4)包含由SEQ ID NO: 28表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b5)包含由SEQ ID NO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b6)包含由SEQ ID NO: 47表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列； b7)與選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列； b8)與選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列； b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含選自bl)至b6)的任一 個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和 blO)核苷酸序列，其包括在選自bl)至b6)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)核苷 酸的取代、缺失或添加。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 27表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
45. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
46. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
47. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
48. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
49. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
50. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 25表不的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
51. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
52. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
53. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 45表不的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
54. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
55. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表不的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由 SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
56. -種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求38-55所述的任一個(gè)多核苷酸。
57. -種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求38-55所述的任一個(gè)多核苷酸。
58. -種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求56所述的載體。
59. -種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-25中的任一項(xiàng)所述的抗體，所述方法包括：培養(yǎng)根據(jù)權(quán) 利要求57或58所述的宿主細(xì)胞，和從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物純化所述抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/46GK104321430SQ201380028016
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】晝間由晴, 長(zhǎng)谷川淳 申請(qǐng)人:第一三共株式會(huì)社