專利名稱：一種基于抗原-抗體反應(yīng)的可控的金納米棒組裝的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于抗原-抗體反應(yīng)的可控的金納米棒組裝的方法，屬于納米免
疫技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金納米棒由于具有豐富的表面等離子共振所衍生出來的許多性質(zhì)，當(dāng)今分散的金 納米棒廣泛的應(yīng)用于許多領(lǐng)域。例如用于光學(xué)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、納米傳感器、生物成像、控制基因 輸送和光熱治療腫瘤等。 抗原-抗體免疫反應(yīng)是最為常見的生物識(shí)別反應(yīng)之一，常常應(yīng)用于免疫反應(yīng)。當(dāng) 今，科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展要求用到組裝的金納米棒，一維、二維，甚至三維功能化結(jié)構(gòu)。因?yàn)榻M 裝的金納米棒不僅擁有單一金納米棒的性質(zhì)，更衍生出許多群體性質(zhì)。這些光學(xué)和電子學(xué) 的性質(zhì)是單個(gè)金納米棒所不具有的，這些性質(zhì)的產(chǎn)生是由于組裝后的金納米棒每個(gè)單體和 其相鄰的金納米棒所作用產(chǎn)生的。 金納米棒組裝有2種方式(1)端面對(duì)端面組裝，(2)側(cè)面靠側(cè)面組裝。組裝的方 法主要是通過靜電作用或共價(jià)偶聯(lián)；通過核酸分子的雜交；金納米棒上修飾高聚物在選擇 性溶劑下自我作用；最后就是通過生物識(shí)別的方法，如生物素_親和素，抗原_抗體作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作方法簡(jiǎn)單并快速的金納米棒實(shí)現(xiàn)可控組裝的方法， 用于端面對(duì)端面組裝及側(cè)面靠側(cè)面組裝。 通過不同方法將抗原抗體定向的偶聯(lián)到金納米棒的端面或側(cè)面，在通過抗原抗體
間的識(shí)別反方實(shí)現(xiàn)金納米棒的組裝。實(shí)驗(yàn)以慶大霉素抗原及抗體來闡述。包括以下內(nèi)容 (1)慶大霉素抗體及包被原與金納米棒的側(cè)面偶聯(lián)； (2)金納米棒在抗原抗體作用下的側(cè)面靠側(cè)面組裝； (3)抗體與金納米棒的頂端偶聯(lián)修飾； (4)包被原與金納米棒的頂端偶聯(lián)修飾； (5)金納米棒在抗原抗體作用下的端面對(duì)端面的組裝。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于抗原-抗體反應(yīng)的可控的金納米棒組裝的方法，包 括金納米棒側(cè)面組裝或金納米棒端面組裝；
(l)金納米棒側(cè)面組裝 a抗體修飾金納米棒100ii g/mL的慶大霉素抗體O. 5mL逐滴加入用0. lmol/L 的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH 8. 5-8.8、0. 5mL、2n mol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37。C反應(yīng) lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在pH 7. 4、含0. 5%聚乙二醇 PEG20000的0. 01mol/L PBS中，制得慶大霉素抗體修飾的金納米棒探針；
b.包被原修飾金納米棒方法與抗體修飾金納米棒偶聯(lián)類似，100 ii g/mL的慶大 霉素包被原O. 5mL逐滴加入用0. lmol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH5、0. 5mL、2n mol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37t:反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原，重懸 在pH 7. 4、含0. 5% PEG20000的0. Olmol/L PBS中，制得慶大霉素包被原修飾的金納米棒 探針； c.在抗原-抗體作用下的金納米棒側(cè)面靠側(cè)面組裝 10 ii L修飾慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10 ii L修飾慶大霉素抗體的金 納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0. 5h后反應(yīng)結(jié)束，取10 ii L反應(yīng)液稀釋5倍后透射電鏡表 征產(chǎn)物； 或(2)金納米棒端面組裝
a.抗體的修飾 抗體的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和慶大霉素抗體的結(jié)合，操作步驟如下
①含1. 625mg硫辛酸的乙醇溶液0. 3mL與0. 4mL的慶大霉素抗體混合；
②將75 ii L的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述步驟①溶液中后室溫 反應(yīng)4h ; ③用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換3次透析液；
④將硫辛酸修飾的慶大霉素抗體放在fC備用；
b.抗體修飾金納米棒端面 采用晶種生長(zhǎng)法合成金納米棒首先要經(jīng)過7500rpm離心15min去除溶液中多余 的Vc、 AgN03和小的球形粒子金納米棒后，利用pH 3. 8、含有0. 1%聚乙二醇PEG20000的 0. 005mol/L十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶液進(jìn)行重懸，重懸液用lmol/L HC1調(diào)整至pH 3. 8，在金納米棒的制備過程中CTAB起著非常關(guān)鍵的作用，CTAB主要是分布在金納米棒的 側(cè)面從而金納米棒的側(cè)面帶有正電荷而金納米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修飾 的抗體會(huì)修飾到金納米棒的端面而非側(cè)面上。0. 5mL、2n mol/L重懸后的金納米棒溶液GNRs 逐滴滴加到由50 ii L稀釋到lmL的硫辛酸修飾的慶大霉素抗體稀釋液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h， 反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min，運(yùn)用pH 3. 8、含有0. 1% PEG20000的0. 005mol/LCTAB溶 液lmL中進(jìn)行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最后用pH3. 8、含0. 1% PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 ii L進(jìn)行重分散，此偶聯(lián)物置于4t:保存；
c.包被原的修飾 包被原的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和包被原的結(jié)合，步驟如下
①含1. 625mg的硫辛酸的乙醇溶液0. 3mL與0. 2mL的慶大霉素包被原溶液混合；
②將75 ii L的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述步驟①溶液中后室溫 反應(yīng)4h ; ③用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次；
④將硫辛酸修飾后的慶大霉素包被原放在4t:備用；
d.包被原修飾金納米棒端面 包被原和金納米棒的偶聯(lián)與(b)抗體和金納米棒的偶聯(lián)相似，只是在包被原的量 上有區(qū)別，硫辛酸修飾的慶大霉素包被原60iiL用940iiL的pH 3.80、含有0. 1%PEG20000 的005mol/L CTAB溶液進(jìn)行稀釋； 將pH 3. 8、0. 5mL、2n mol/L重懸后的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾 的慶大霉素包被原的稀釋液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min，運(yùn)用pH3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液lmL中進(jìn)行重分散，用該溶液洗滌兩遍， 最后用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 y L進(jìn)行重分散，此偶聯(lián)
物置于4t:保存； e.在抗原-抗體作用下的金納米棒端面對(duì)端面的組裝 10 L硫辛酸修飾的慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10 L硫辛酸修飾慶 大霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0. 5h后反應(yīng)結(jié)束，取lOii L反應(yīng)液稀釋5 倍后透射電鏡表征產(chǎn)物。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種新的金納米棒組裝的方法，通過不同方法 將抗原抗體定向的偶聯(lián)到金納米棒的端面或側(cè)面，在通過抗原抗體間的識(shí)別反方實(shí)現(xiàn)金納 米棒的組裝。組裝過程在液體環(huán)境中反應(yīng)，操作方法簡(jiǎn)單，條件溫和并快速的實(shí)現(xiàn)金納米棒 的可控組裝，在一定時(shí)間內(nèi)就能生成大規(guī)模的組裝產(chǎn)物。


圖1基于抗原-抗體反應(yīng)的組裝金納米棒的透射電鏡圖。A、金納米棒的側(cè)面對(duì)側(cè) 面組裝，B、金納米棒的端面對(duì)端面組裝。 圖2基于抗原_抗體反應(yīng)的組裝金納米棒的紫外可見圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1慶大霉素抗體及包被原與金納米棒的側(cè)面偶聯(lián) a.抗體與金納米棒偶聯(lián)0. 5mL、 100 ii g/mL的慶大霉素抗體逐滴加入用0. lmol/L 的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH 8. 5-8. 8的0. 5mL、2n mol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37"反應(yīng) lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在0. 01mol/L、pH 7. 4的PBS中 (含0. 5% PEG2000)，制得慶大霉素抗體修飾的金納米棒探針； b.包被原與金納米棒偶聯(lián)方法與抗體與金納米棒偶聯(lián)類似，O. 5mL、100iig/mL 的慶大霉素包被原逐滴加入用0. lmol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH 5、0. 5mL、2n mol/L的金納米棒 溶液中，室溫震蕩混勻，37t:反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原， 重懸在0. 01mol/L、 pH 7. 4的PBS中(含0. 5% PEG20000)，制得慶大霉素包被原修飾的金 納米棒探針； 實(shí)施例2在抗原抗體作用下的金納米棒側(cè)面靠側(cè)面組裝 10 L修飾慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10 L修飾慶大霉素抗體的金 納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0. 5h后反應(yīng)結(jié)束，取10 L反應(yīng)液稀釋5倍后透射電鏡表 征產(chǎn)物。 實(shí)施例3抗體與金納米棒的頂端偶聯(lián)修飾
A.抗體的修飾 抗體的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和抗體的結(jié)合，具體操作步驟如下
①0. 3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1. 625mg)與0. 4mL的抗體混合。
②將75 ii L的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述溶液中后室溫反應(yīng)4h。
③用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換3次透析液。
④將修飾后的抗體放在fC備用。
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B.抗體和金納米棒端面偶聯(lián) 采用晶種生長(zhǎng)法合成金納米棒首先要經(jīng)過7500rpm離心15min去除溶液中多余的 Vc、 AgN03和小的球形粒子金納米棒后利用pH 3. 8、0. 005M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 含有O. 1%聚乙二醇(PEG)的溶液進(jìn)行重懸。重懸液的pH值用lmol/L HC1進(jìn)行調(diào)整。在金 納米棒的制備過程中CTAB起著非常關(guān)鍵的作用。CTAB主要是分布在金納米棒的側(cè)面從而 金納米棒的側(cè)面帶有正電荷而金納米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修飾的抗體會(huì) 修飾到金棒的端面而非側(cè)面上。0. 5mL重分散的2n mol/L GNRs逐滴滴加到由50 y L修飾 后抗體稀釋到lmL的抗體的稀釋液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min， 運(yùn)用lmL的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1 % PEG20000的溶液進(jìn)行重分散。用該溶液洗 滌兩遍。最后用50 ii L的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1% PEG20000的溶液進(jìn)行重分散。
此偶聯(lián)物置于4t:保存。 實(shí)施例4包被原與金納米棒的頂端偶聯(lián)修飾
A.包被原修飾 包被原的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和包被原的結(jié)合，具體操作步驟如下
①0. 3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1. 625mg)與0. 2mL的慶大霉素包被原 溶液混合。 ②將75 ii L的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述溶液中后室溫反應(yīng)4h。
③用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次。
④將修飾后的包被原放在4t:備用。 B.包被原和金納米棒端面偶聯(lián) 包被原和金納米棒的偶聯(lián)與抗體和金納米棒的偶聯(lián)相似，只是在包被原的量上有 區(qū)別，即加入的包被原60 y L后用940 ii L的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1% PEG20000的
溶液進(jìn)行稀釋。 將pH 3. 8、0. 5mL、2n mol/L重懸后的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾 的慶大霉素包被原的稀釋液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min，運(yùn)用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液lmL中進(jìn)行重分散，用該溶液洗滌兩遍， 最后用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 y L進(jìn)行重分散，此偶聯(lián)
物置于4t:保存。 實(shí)施例5在抗原抗體作用下的金納米棒端面對(duì)端面的組裝 10 ii L修飾慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10 ii L修飾慶大霉素抗體的金 納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0. 5h后反應(yīng)結(jié)束，取10 ii L反應(yīng)液稀釋5倍后透射電鏡表 征產(chǎn)物。
權(quán)利要求
一種基于抗原-抗體反應(yīng)的可控的金納米棒組裝的方法，其特征是包括金納米棒側(cè)面組裝或金納米棒端面組裝；(1)金納米棒側(cè)面組裝a.抗體修飾金納米棒100μg/mL的慶大霉素抗體0.5mL逐滴加入用0.1mol/L的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH 8.5-8.8、0.5mL、2n mol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37℃反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在pH 7.4、含0.5％聚乙二醇PEG20000的0.01mol/L PBS中，制得慶大霉素抗體修飾的金納米棒探針；b.包被原修飾金納米棒100μg/mL的慶大霉素包被原0.5mL逐滴加入用0.1mol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH 5、0.5mL、2n mol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37℃反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原，重懸在pH 7.4、含0.5％PEG20000的0.01mol/L PBS中，制得慶大霉素包被原修飾的金納米棒探針；c.在抗原-抗體作用下的金納米棒側(cè)面靠側(cè)面組裝10μL修飾慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10μL修飾慶大霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37℃孵育0.5h后反應(yīng)結(jié)束，取10μL反應(yīng)液稀釋5倍后透射電鏡表征產(chǎn)物；或(2)金納米棒端面組裝a.抗體的修飾抗體的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和慶大霉素抗體的結(jié)合，操作步驟如下①含1.625mg硫辛酸的乙醇溶液0.3mL與0.4mL的慶大霉素抗體混合；②將75μL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述步驟①溶液中后室溫反應(yīng)4h；③用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換3次透析液；④將硫辛酸修飾的慶大霉素抗體放在4℃?zhèn)溆茫籦.抗體修飾金納米棒端面采用晶種生長(zhǎng)法合成金納米棒首先要經(jīng)過7500rpm離心15min去除溶液中多余的Vc、AgNO3和小的球形粒子金納米棒后，利用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶液進(jìn)行重懸，重懸液用1mol/L HCl調(diào)整至pH 3.8，0.5mL、2n mol/L重懸后的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到由50μL稀釋到1mL的硫辛酸修飾的慶大霉素抗體稀釋液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min，運(yùn)用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液1mL中進(jìn)行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最后用pH3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液50μL進(jìn)行重分散，此偶聯(lián)物置于4℃保存；c.包被原的修飾包被原的修飾采用碳二亞胺法進(jìn)行硫辛酸和包被原的結(jié)合，步驟如下①含1.625mg的硫辛酸的乙醇溶液0.3mL與0.2mL的慶大霉素包被原溶液混合；②將75μL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述步驟①溶液中后室溫反應(yīng)4h；③用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次；④將硫辛酸修飾后的慶大霉素包被原放在4℃?zhèn)溆?；d.包被原修飾金納米棒端面硫辛酸修飾的慶大霉素包被原60μL用940μL的pH 3.80、含有0.1％PEG20000的005mol/L CTAB溶液進(jìn)行稀釋；將pH 3.8、0.5mL、2n mol/L重懸后的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾的慶大霉素包被原的稀釋液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后6000rpm離心10min，運(yùn)用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液1mL中進(jìn)行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最后用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液50μL進(jìn)行重分散，此偶聯(lián)物置于4℃保存；e.在抗原-抗體作用下的金納米棒端面對(duì)端面的組裝10μL硫辛酸修飾后的慶大霉素包被原的金納米棒溶液中加入10μL硫辛酸修飾慶大霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37℃孵育0.5h后反應(yīng)結(jié)束，取10μL反應(yīng)液稀釋5倍后透射電鏡表征產(chǎn)物。
全文摘要
一種基于抗原-抗體反應(yīng)的可控的金納米棒組裝的方法，屬于納米免疫技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過不同方法將抗原抗體定向的偶聯(lián)到金納米棒的端面或側(cè)面，在通過抗原抗體間的識(shí)別反方實(shí)現(xiàn)金納米棒的組裝。組裝過程在液體環(huán)境中反應(yīng)，操作方法簡(jiǎn)單，條件溫和并快速的實(shí)現(xiàn)金納米棒的可控組裝，在一定時(shí)間內(nèi)就能生成大規(guī)模的組裝產(chǎn)物。
文檔編號(hào)B82B3/00GK101696972SQ20091003579
公開日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者彭池方, 徐麗廣, 朱穎越, 胥傳來, 陳偉, 馬偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué);