專利名稱：用于產(chǎn)生7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩的方法
用于產(chǎn)生7-甲氧基-3-脫乙?；^孢瘞吩的方法 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩(I)的方法，
所述7-曱氧基-3-脫乙?；^孢噻吩是頭孢西丁合成的中間體， 所述方法是使用生物催化劑的創(chuàng)新方法。
頭孢西丁屬于頭霉素類，即p-內(nèi)酰胺抗菌素類，其特征在于在頭 孢烷環(huán)的7位存在一個甲氧基。
在US4297488中描述了上述抗生素，其說明包含使用各種試劑的 多種脫乙酰化中間體氨曱?；牟煌铣陕肪€，所述合成路線在羧基 和/或氨基上使用不同的保護基團。其還描述，盡管反應(yīng)很慢(6-15 小時)而且沒有對于所獲得產(chǎn)物質(zhì)量的評論，使用來源于柑橘類水果 皮的乙酰酯酶，經(jīng)過酶促水解能產(chǎn)生這些衍生物中的某些。在 Tetrahedron Lett 46， 4653-6 ( 1973 )中，該同一作者也對相似方 法進行了描述，即使用保護的中間體如對硝基千基酯，在其上進行脫 保護和酶促水解反應(yīng)，因此產(chǎn)生羧酸形式的7-甲氧基-3-脫乙?；^ 孢噻吩。然后，用氯磺?；惽杷狨ヌ幚碓摦a(chǎn)物獲得頭孢西丁。
在現(xiàn)代化學(xué)中，工業(yè)規(guī)模通常應(yīng)用的合成路線是以7-ACA("7-氨 基頭孢烷酸)作為原料，生產(chǎn)光學(xué)純的頭孢西丁，并且所述合成路線 包含四個主要步驟，并優(yōu)選以下列順序進行
1. 7位氨基的?；?br> 2. 在7a位引入甲氧基3. 3位乙?；某?br> 4. 在先前的步驟3中獲得的羥基基團的氨曱?；?br> 步驟1相當(dāng)于一種頭孢菌素、即頭孢噻吩的合成。然后通過甲氧 基化使其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的頭孢噻啶以生成中間體II (步驟2):
然后脫乙?；苫衔颕。
盡管其它順序是可能的，但是由于無需針對氨基或羧基使用保護 基團，所以前述步驟是有優(yōu)勢的，并因此使必要的操作的數(shù)目最小化， 從而使得節(jié)省了原料。
例如，WO2004/083217A1 (第6頁)中描述在冷卻到-45。C的水-甲醇混合物中使用氬氧化鈉的所述中間體II的皂化反應(yīng)；在用酸堿中 和后，在水解的整個過程中維持該溫度，并且僅在反應(yīng)結(jié)束后升高溫 度。
在適度的溫度經(jīng)蒸餾除去甲醇之后，化合物I作為二芐基乙二胺 鹽被分離；因此明顯的是，即1)為了滿足用于所述反應(yīng)的極低溫度 的需要而使用甲醇是合理的，并且2)在分離所述產(chǎn)物之前，除去所 述溶劑是必要的。
如EP1748049A2中所描述的，可選擇地，能以經(jīng)酸化作用的非解
離形式或作為堿性鹽、例如四丁銨在溶劑中提取所述產(chǎn)物。
通過如上述的專利所描述的異氰酸酯基團，或如US4292427中的 實施例所描述的其它異氰酸酯基團的氨甲?；瑥幕衔颕中獲得頭 孢西丁。
在所有情況下，因為P-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性和在極端堿性條件 下操作的需要，所以在極低溫度下進行化合物I的脫乙?；苫?物II，以防止產(chǎn)物降解；因此使用有機溶劑以降低所述溶液的水點。
因此，這些方法要求數(shù)千升的溶液冷卻到-45t:量級的溫度，通過使用制冷機或制冷液(例如液氮)使這些溫度在整個反應(yīng)期間得以維
持；這導(dǎo)致了大量的能源成本。然后，在真空下，通過加熱到+30/+40 x:蒸餾除去所述溶劑，其帶有進一步的大量能源消耗(對于加熱所述 溶液以及所述真空泵和冷凝器制冷操作兩者而言)。
由于溶劑務(wù)燃性、可能的操作者中毒、蒸汽向環(huán)境的釋放以及由 于產(chǎn)生含有甲醇的水性流出物的缺點，因此還必須考慮溶劑、例如甲 醇的使用涉及危險，所述溶劑必須適當(dāng)處理。
因此，更加生態(tài)相容性的路線是非常合乎需要的，例如僅在常溫 的水中就發(fā)生的水解反應(yīng)。為了在合理的時間完成這樣的水解反應(yīng)， 并且避免產(chǎn)物降解，需要催化劑，例如酶。
已經(jīng)知道頭孢菌素類(不是作為化合物II的頭霉素類)的酶促脫 乙?；幸欢螘r間了 ，并且已經(jīng)描述了與不同來源的酶的反應(yīng)。
例如Gilbert等在GB1121308 (Glaxo， 1964 )中所描述的來源于 麥芽的乙酰酯酶，Jeffery等在Biochem， J. 81，第591-6頁(1961) 中所描述的存在于柑橘類果皮中的酶。
上述US4297488描述了由來源于柑橘類水果的乙酰酯酶催化的各 種頭孢西丁合成中間體的酶促水解；然而，因為所述催化劑的不良表 現(xiàn)，其中描述的方法不適用于工業(yè)規(guī)模。這是一種比活度很低的酶， 其涉及極長的反應(yīng)時間(描述為6-15小時)，難以生產(chǎn)，因為其源于 受季節(jié)變化影響難以再制的來源。此外，它以溶解的形式應(yīng)用，不是 循環(huán)的，并且既沒有描述酶的純化也沒有描述酶的固定。沒有描述獲 得的乙?；苌锏漠a(chǎn)率及其質(zhì)量。
從 Jcre/z/on/u邁c力r/soge/2w邁(或斗支頂頭抱((7e/7力a/o^por/w/n acre仿o/ /咖))以及棒狀鏈霉菌(5Yrepf呵ces c/flra//geri/s)中 頭孢菌素C的生物合成路線中所涉及的那些開始，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它對頭 孢菌素類有效的酶；這些被認(rèn)為是不合需要的酶活性，因其導(dǎo)致脫乙 ?；^孢菌素C, 一個發(fā)酵副產(chǎn)物的形成。應(yīng)該注意的是，在yocar力'a /ac^頂o^/ra;^和棒狀鏈霉菌中頭霉素類的生物合成不包含在頭霉素 上所述乙?；?JC解作用(P. Liras， Antonie van Leeuwenhoek 75，1999，第109-24頁)；因此，在頭霉素類上乙酰酯酶的活性是未知的， 甚至在產(chǎn)生頭霉素的微生物中。
已經(jīng)描述了在7-ACA或頭孢菌素C上的乙?；拿复呋猓?是沒有描述在頭霉素類上的乙?；拿复呋猓惶貏e地
1) 由枯草桿菌產(chǎn)生的酯酶(Abbott和Fukuda， Antimicrob Agents Chemother 8， 3，第282—8頁，1975和Appl Microbiol, 30， 3， 第413-8頁1975 )以固定的形式用于水解7-ACA為3-脫乙?；?7-ACA。 所述酶足夠有效和穩(wěn)定，但是傾向于從固定載體上脫離。其他作者
(Takimoto等Appl Microbiol Technol 65，第263—7頁，2004 )描 述了在重組的大腸桿菌中該酶的發(fā)酵，其純化和在固體載體上的固定 及其生產(chǎn)3-脫乙酰基-7-ACA的應(yīng)用。
2) Politino等在Appl Environm Microbiol 63， 12，第4807-11 頁，1997中描述了紅冬孢酵母產(chǎn)生對7-ACA有活性的酶，其可以以非 發(fā)酵生物質(zhì)(靜息細胞)的形式或作為一個分離和純化酶的形式在該 反應(yīng)中用作催化劑。但是，該酶對于頭孢噻吩所表現(xiàn)出的水解活性是 低的，僅為對于7-ACA的34°/。。沒有描述頭霉素類的水解。Chiang等
(US 2002/0048781BMS， 2002 )也使用同樣的酶，其描述了一抹能表 達來自紅冬孢酵母屬的乙酰酉旨酶的重組Acremonium chrysogenum用于 在發(fā)酵肉湯中直接產(chǎn)生脫乙?；^孢菌素C。
3) Venturi等在Appl Environ Microbiol 64， 2，第789-92 頁，1998中描述了另一個乙酰酯酶，所述乙酰酯酶是由短小芽胞桿菌 產(chǎn)生的木聚糖酯酶， 一種與木聚糖降解有關(guān)的酶，其還顯示出對7-ACA 和頭孢菌素C的活性；其它出版物描述了在大腸桿菌中同樣酶的表達。 沒有描述對頭霉素類的活性。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，頭霉素的乙?；拿复偎鈴膩頉]有以工 業(yè)規(guī)模應(yīng)用；而且，盡管有大量可得的關(guān)于頭孢菌素類中相似反應(yīng)的 文獻，但是沒有描述可用于頭霉素類的足夠有效和穩(wěn)定的酶。
本發(fā)明的一個方面是制備式I化合物的方法，其中式n化合物經(jīng) 歷乙?；?，其特征在于在pH值5-9之間(優(yōu)選6-8之間)，溫度在-10。C和+45。C之間(優(yōu)選0"C和+201C之間)，在由至少一種具有乙
?；?水解活性的酶組成的生物催化劑存在下，在水中進行所述水解， 且最后通過公知的方法從反應(yīng)介質(zhì)中分離所述酶。
特別地，該生物催化劑可從選自紅冬孢酵母、短小芽孢桿菌、大
腸桿菌、Acremonium chrysogenum和棒狀鏈霉菌的微生物中獲得，并 且可以游離蛋白或固定在固體栽體上的形式存在，或由所述微生物細 胞自身組成。在反應(yīng)結(jié)束后，可以分離和再利用所述生物催化劑，而 所述化合物I可以作為有機堿的鹽通過沉淀或通過在溶劑中提取從所 述水溶液中分離。優(yōu)選地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述有機堿選自二爺基乙二胺 及其鹽。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，新方法呈現(xiàn)出許多優(yōu)勢，可概括如下
由于避免使用有害的溶劑(例如甲醇)和強腐蝕溶液(例如氫氧 化鈉)，具有更高的工作安全性，
通過在室溫工作節(jié)省了大量能源，從而避免為了達到和維持通常 用于這些情況中的低溫(例如低于-45'C)而需要消耗的大量能源，
通過避免在真空下的溶劑蒸餾(一個需要大量時間的步驟)具有 更高的生產(chǎn)率。
獲得了與通過目前公知的方法可獲得的產(chǎn)物質(zhì)量相當(dāng)或比其更好 的產(chǎn)物。
詳細描述
從市售的優(yōu)品質(zhì)和低價的原料頭孢噻吩開始制備中間體II;可以 通過已知的方法從7-ACA生產(chǎn)同樣的頭孢噻吩。通過已知的方法操作， 使用氯化劑和甲醇鈉，在極低溫度進行甲氧基化反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后， 可以堿性金屬的鹽或有機堿的鹽分離所述化合物II，或可以在水中以 羧酸鹽的形式提取所述化合物II。在W02004/083217實施例1步驟i 描述了 一條方便的合成路線。
為了所述酶的脫乙?；褂酶鞣N催化劑，所述催化劑通過已 知方法或如下列實施例所描述的制備。如WO2004/083217中所描述的，反應(yīng)產(chǎn)物(化合物I)作為二千 基乙二胺鹽被分離，或依照在EP 1748049A2中所描述的步驟，反應(yīng)產(chǎn) 物(化合物I)或作為a)非解離形式的酸，或b)四丁胺鹽在有機溶劑 中被提取。
以已知方法操作，通過與氯磺?；惽杷狨シ磻?yīng)，從化合物I獲 得頭孢西丁，從而獲得適合藥用的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)物。
在下列實施例中說明所述方法，但是認(rèn)為其是非限制性的。
實施例1
7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩的化學(xué)合成
將通過已知步驟制備的、且作為酸具有約69%滴定度(約等于500 毫摩爾)的300g環(huán)己胺鹽形式的7-甲氧基頭孢噻吩(溶液A)加入到 1升水和1. 15升甲醇的混合物中。將該混合物冷卻到-37X:。
分別地，在300ml水中制備160g的30%氫氧化鈉的水溶液，并冷 卻到+5"C，然后將其緩慢傾入溶液A，并且在加入完成之后在-45iC /-35t:之間維持溫度約一個小時。通過HPLC分析監(jiān)測反應(yīng)動力學(xué)當(dāng) 殘留的7-甲氧基頭孢噻吩低于0. 7g/1時，加入90g的80%的乙酸中斷 反應(yīng)，同時維持溫度在-5X:之內(nèi)。監(jiān)測pH，其必須為中性，如有必要， 并校正至6. 8-7. 0。在真空下將混合物加熱到+30/+35匸進行蒸餾直到 獲得濃度約為100g/l的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩，然后用碳脫 色。為了達到約為80g/l的濃度，將體積稀釋至大約1.9升，然后加 入300ml乙酸乙酯和130g二節(jié)基乙二胺雙乙酸鹽，加入少量固體產(chǎn)物 以觸發(fā)沉淀。將混合物冷卻到0/+5C并且維持該溫度直到母液中產(chǎn) 物濃度低于10g/l為止，然后經(jīng)布氏漏斗過濾。用水、接著用乙酸乙 酯洗滌固體，然后在85%乙酸乙酯/15%丙酮混合物中搗碎得到無水產(chǎn) 物。
獲得約208g 7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩二芐基乙二胺鹽，作 為酸其滴定度約為70%，等于380毫摩爾，摩爾產(chǎn)率為76%。實施例2
使用紅冬孢酵母生物質(zhì)7-甲氧基-3-脫乙?；^孢漆吩的酶促水
如文獻中所描述的，使紅冬孢酵母ATCC 10657在燒瓶或發(fā)酵罐 中從接種開始生長72小時，取回全部肉湯樣本用于監(jiān)測產(chǎn)生的乙酰酯 酶的量。以國際單位(IU)表示所述酶活性，其等于每分鐘轉(zhuǎn)化的底 物的微摩爾，并且通過7-ACA (在水中20g/l )的水解確定；反應(yīng)的溫 度控制在+25X:，通過自動滴定(pH-stat, Crison Instruments SA， Barcelona, Spain )加入0. 1M NaOH使pH控制在6.5。生長肉湯在 10000 r. p. m.離心15分鐘，將沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液中并再次離心， 以獲得具有每克約6-10 IU比活性的糊狀濕細胞。
將40. 8g的7-曱氧基頭孢噻吩環(huán)己胺鹽溶解在約250ml水中，并 用3N的氫氧化銨校正pH至7. 0,設(shè)置滴定器以維持pH為7. 0，將溫 度控制在+20。C，并加入50g的紅冬孢酵母屬細胞糊。在約1小時30 分后，反應(yīng)完成，通過離心分離細胞以獲得約340ml的7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻吩溶液，其用碳脫色并經(jīng)紙過濾。加入55ml乙酸乙酯 和17. 7g 二千基乙二胺雙乙酸鹽，如實施例1中所述分離產(chǎn)物。
獲得約28g 7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩二卡基乙二胺鹽，作 為酸其滴定度約為70%，等于51毫摩爾，摩爾產(chǎn)率為77%。
紅冬孢酵母屬細胞對于各種水解循環(huán)而言可再次利用。
實施例3
用來自紅冬孢酵母的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩 的酶促水解
如實施例1中所述獲得的紅冬孢酵母生物質(zhì)經(jīng)EDTA(乙二胺四乙 酸)處理后裂解，獲得含有乙酰酯酶活性的水溶液，所述水溶液按照 文獻中已知的方法(Politino等Appl. Environ, Microbiol, 63， 12， 第4807-11頁，1997 ),通過羧甲基Sepharose經(jīng)色i普純化。
將按照實施例1制備的870g的7-甲氧基-頭孢噻吩二芐基乙二胺鹽溶解，校正pH到7. O，將體積稀釋到總共為6000ml，然后加入200ml 的乙酰酯酶溶液，并且用3N氫氧化銨通過自動滴定將pH維持在7。 反應(yīng)結(jié)束時，使用帶有Nanomax膜以及l(fā)OOOODa截止點的Millipore ProScale儀器，通過超濾從所述產(chǎn)物中分離所述酶。從滲透物中獲得 約5升7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢瘞吩溶液，如實施例1所述將其分 離，含有所述酶的濃縮物用于在下一個水解循環(huán)的再次利用。如實施 例1所述分離化合物1。
實施例4
用重組的大腸桿菌生物質(zhì)的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩的酶 促水解
來自短小芽胞桿菌的酶乙酰基木聚糖酯酶在通過如Venturi等在 Microbiology 146，第1585-91頁(2000 )中所描述的方法獲得的重 組大腸桿菌中表達。
如實施例3中所描述的，使用340g的大腸桿菌生物質(zhì)作為催化劑 水解7-甲氧基-頭孢噻吩；反應(yīng)結(jié)束時，通過超濾分離7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢瘞吩溶液，如實施例1中所述分離二節(jié)基乙二胺鹽形式 的產(chǎn)物。
超濾截留物是部分裂解的大腸桿菌細胞和游離酶的懸浮液，其在 隨后的循環(huán)可再次利用。
實施例5
用固定在環(huán)氧樹脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻 吩的酶促水解
通過在1000bar使用細胞破碎壓榨機(Constant Systems Ltd.) 破壞細胞，然后在20000 r.p.m.離心30分鐘，從而使如實施例4中 所描述的重組大腸桿菌中產(chǎn)生的木聚糖酯酶部分純化。通過用lOKDa 膜ProScale Millipore儀器超濾進行透析由此獲得的上清液，然后 如文獻(Venturi et al. ， Microbiology 146，第1585-91頁，2000 )所描述的，在Sepharose Q Fast Flow樹脂上進行色i普分析。
通過超濾濃縮部分純化的酶，然后用pH為8的IO倍體積的1.2M LHP04溶液稀釋，接著固定在環(huán)氧樹脂Sepabeads EC-EP ( Diaion SpA， Mitsubishi)上，每克樹脂120 IU的裝載量。攪動所述樹脂懸浮液 48小時，然后經(jīng)布氏漏斗過濾，并用IO倍體積的水洗滌(每克樹脂 10ml);獲得活性約為70 IU/克的固體催化劑。
將100g的7-曱氧基-頭孢噻吩環(huán)己胺鹽溶于總體積為450ml的水 中，然后使用作為催化劑的66g固定酶進行水解，并使用3N氫氧化銨 通過自動滴定維持pH恒定在7。
2.5小時后反應(yīng)完成，經(jīng)燒結(jié)玻璃漏斗過濾酶，通過加入50g的 二千基乙二胺雙乙酸鹽，并如實施例1中所述搮作，分離7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩。
獲得69. 6g產(chǎn)物，其作為酸7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩滴定 度為70. 8%，摩爾產(chǎn)率為78°/。。
所述催化劑可以在多次反應(yīng)循環(huán)中再次利用。
實施例6
用固定在氨基樹脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻 吩的酶促水解
如實施例5中所描述的，將如實施例4中所述的在重組大腸桿菌 中產(chǎn)生的來自短小芽胞桿菌的酶乙酰酯酶進行純化。
將100g的Sepabeads EC-HA樹脂(Diaion)用水充分洗滌，然后 懸浮于100ml pH值為7的0. 2M磷酸鹽緩沖液中。加入UOml的25% 戊二醛水溶液，并且于攪拌下放置16小時，然后加入總共12000 IU 的純化酶溶液。3小時后，混合物經(jīng)布氏漏斗過濾，并用水充分清洗。 獲得活性為55 IU/克的催化劑。
如實施例5中所描述的，使用84克固定的乙酰酯酶進行水解。如 實施例1中所描述的，反應(yīng)3小時后，濾除所述酶并且所述二芐基乙 二胺鹽沉淀。獲得的產(chǎn)物在四倍體積的異丙醇(重量/體積)中懸浮并過濾，獲得68g的7-曱氧基-3-脫乙?；^孢噻吩二千基乙二胺鹽， 其滴定度為70.5%,相當(dāng)于摩爾產(chǎn)率為76%。
所述催化劑可以在多次反應(yīng)循環(huán)中再次利用。
實施例7
用固定在乙醛酰樹脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢 瘞吩的酶促水解
用水充分洗滌100g的Sepabeads EC-HA樹脂(Diaion)，然后加 入800ml的0. 05M偏高碘酸鈉溶液；在1. 5小時后所述混合物經(jīng)布氏 漏斗過濾，并用水充分洗滌。將所述樹脂懸浮于700ml pH值為10的 50mM碳酸氫鹽緩沖液中，然后加入如實施例5中純化的12000 IU的
1小時后，加入1400ml的lmg/ml的硼氫化鈉水溶液，讓其反應(yīng) 30分鐘，然后經(jīng)多孔擋流板過濾，并用水充分洗滌。獲得活性為38 IU/ 克的催化劑。
如實施例5中所述進行水解反應(yīng)；3.5小時后，中斷反應(yīng)并分離 產(chǎn)物。獲得65g的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩二芐基乙二胺鹽， 其滴定度為70%,相當(dāng)于摩爾產(chǎn)率為73%。
所述催化劑可以在多次反應(yīng)循環(huán)中再次利用。
實施例8
來自二氯曱烷溶液的7-甲氧基-頭孢噻吩的酶促水解 如WO2004/083217A1中所述，在二氯甲烷和甲醇中使用N-氯代-琥珀酰亞胺和曱醇鈉進行頭孢噻吩的甲氧基化反應(yīng)。在用水溶液洗滌 后，獲得82g/1酸7-甲氧基-頭孢噻吩的二氯甲烷溶液。
用約300ml水提取500ml 二氯甲烷溶液，用10% (w/v)的碳酸鈉 水溶液進行滴定以獲得最終pH為8. 0;分離所述相，并且用少量水洗 滌亞甲基相獲得355ml的109g/l水性的產(chǎn)物溶液，相當(dāng)于提取率為 94%。在+25"C真空下蒸餾水相消除溶劑殘余物。如實施例6中所描述的，用40g的酶水解所述水相，并用10%(w/v) 的碳酸鈉水溶液控制pH值，2小時后，中斷反應(yīng)并分離產(chǎn)物。獲得33g 的7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩二爺基乙二胺鹽，其滴定度為 70. 8%。所述催化劑可以在多次反應(yīng)循環(huán)中再次利用。
實施例9
在不分離中間體的情況下合成頭孢西丁
如實施例8中所述制備7-曱氧基-3-脫乙?；^孢噻吩，獲得濃 度為80g/l的水溶液，其用2g碳脫色。按照EP1748049A2中所描述的 步驟，過濾后，加入固體NaCl直到飽和，并用溴化四丁基銨的二氯曱 烷溶液提取所述溶液。在四氫呋喃中用氯代磺酰異氰酸酯實施氨基曱 ?；?，分離酸頭孢西丁，然后如相同專利所述，將所述頭孢西丁轉(zhuǎn)化 為相應(yīng)的鈉鹽。
獲得13g頭孢西丁鈉。
實施例10
作為酸或鈉鹽的7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻吩的分離 如實施例6中所述進行反應(yīng)；水解結(jié)束時，過濾所述催化劑并再 次利用，然后酸化水溶液直到7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩開始沉 淀。使沉淀持續(xù)30分鐘，然后加入鹽酸直到pH值為2.5，冷卻到+4 。C。所述混合物經(jīng)布氏漏斗過濾獲得白色固體狀的7-甲氧基-3-脫乙 酰基頭孢漆吩。用乙酸乙酯提取母液，分離相并向有機相中加入2-乙 基己酸鈉，獲得7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩鈉鹽的沉淀。
實施例11
在水混懸液中7-甲氧基-頭孢噻吩的酶促水解
將130g的7-甲氧基頭孢噻吩環(huán)己胺鹽懸浮于300ml水中，然后 加入10。/。(w/v)的碳酸鈉水溶液使pH值為7;獲得懸浮液，向其中加 入如實施例6所述制備的100g固定酶。將溫度控制在+20C且pH值恒定條件下實施反應(yīng)；隨著水解進行觀察到底物完全溶解。持續(xù)該過程 直到獲得低于0.5g/l的7-甲氧基-頭孢噻吩殘余物，然后如實施例1 中所述濾除所述催化劑并分離產(chǎn)物。獲得98. 3g的7-甲氧基-3-脫乙 ?；^孢噻吩二千基乙二胺鹽，其滴定度為70%,摩爾產(chǎn)率為85%。
實施例12
通過7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩的二卡基乙二胺鹽的熱沉淀 分離7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩
如實施例中11所述進行反應(yīng)。唯一的區(qū)別是在加入所述二千基乙 二胺雙乙酸鹽前將水/乙酸乙酯混合物加熱到+35"C。為了引發(fā)7-甲氧 基-3-脫乙?；^孢蓉吩二節(jié)基乙二胺鹽的沉淀，將溫度維持在+30/35 "C約30分鐘，并在過濾前逐漸冷卻到+4X:。獲得約為85%的摩爾產(chǎn)率。
實施例13
用于沉淀7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩的二爺基乙二胺的應(yīng)用 如實施例11中所述進行反應(yīng)。唯一的區(qū)別是向7-曱氧基-3-脫乙 ?；^孢噻吩水溶液中加入10 vol。/。的甲醇，然后加入乙酸乙酯，在 加入二千基乙二胺堿之前，加熱到+30/35。C。在過濾前將混合物逐漸 冷卻到+4。C。獲得約為85%的摩爾產(chǎn)率。使用乙醇、異丙醇或甘油替 代曱醇獲得相似的結(jié)果。
實施例14
作為溫度的函數(shù)的乙酰酯酶活性
制備乙酸乙酯(O. 5ml)在pH值為7的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶 液(50ml),然后用IOO微升來自大腸桿菌中的重組短小芽胞桿菌的 乙酰基木聚糖酯酶實施水解，所述乙?；揪厶酋ッ溉鐚嵤├?所述 使用游離非固定蛋白制備。
在溫度+10t:到+35。C之間，在通過自動滴定的恒定pH下進行各項 測試，在反應(yīng)的最初IO分鐘期間，基于堿的加入速率，計算每次測試所述酶的水解活性。
通過用0. IN的NaOH滴定經(jīng)所述酯水解釋放的乙酸量，并通過以 下公式計算，將所述活性表示為每ml溶液的國際單位(IU): IU-[平均NaOH消耗量(ml/min) xl00xf]/樣本體積(ml) 其中f=0. IN的碳酸鈉滴定度的校正因子
平均消耗量-在滴定的最初10分鐘內(nèi)0. IN的NaOH的消耗量，以 ml/rain表示
樣本體積-乙酰酯酶溶液的體積，以ml表示。
對表示的酶活性對反應(yīng)溫度繪圖，得到如附圖l所示的圖。 如實施例5到7中所述，使用固定在樹脂上的蛋白獲得相似的結(jié)果。
實施例15
作為PH的函數(shù)的乙酰酯酶活性
按照實施例14中所描述的步驟，溶液溫度控制在+25'C，通過自 動滴定維持pH恒定將在5-9之間。如實施例14中所述計算水解活性， 并將活性以IU/ml對操作pH繪圖，獲得附圖2的曲線。
實施例16
作為pH和溫度的函數(shù)的7-甲氧基-頭孢噻吩的水解動力學(xué) 如實施例6中所述制備200g/1的7-甲氧基-頭孢噻吩溶液，并用 來自大腸桿菌中的重組短小芽胞桿菌的乙?；揪厶酋ッ杆猓?br> 在pH為5. o-9. o之間并溫度在-iox:到+35r;之間操作。在溫度低于o
r的情況下，向水溶液中加入IO vol。/。的甘油。
進行反應(yīng)，直到獲得的7-曱氧基-頭孢噻吩的殘余物低于lg/1終 止反應(yīng)。
附圖3顯示的僅僅是一些反應(yīng)動力學(xué)。取決于反應(yīng)條件，可獲得 的產(chǎn)物產(chǎn)率和質(zhì)量受可能的產(chǎn)物降解的影響。用固定乙酰酯酶的7-曱氧基-頭孢噻吩的水解
按照實施例5中所描述的步驟，如實施例5-7中所述使用固定在 樹脂上的乙酰酯酶，并且在pH為5并+35C下操作。反應(yīng)終止時，停 止攪拌，傾析所述催化劑，然后通過虹吸作用分離溶液，并且如實施 例11中所述分離化合物I，獲得7-甲氧基-3-脫乙?；^孢噻吩，其 滴定度為69%。在pH為9,溫度為-10t:下操作，并向水溶液中加入 10%甘油得到相似結(jié)果。
實施例18
從7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻吩合成頭孢西丁 例如象W02004/083217A1中所述，通過與氯代磺酰基異氰酸酯反 應(yīng)，將通過實施例1 (樣本A)和實施例12 (樣本B)所描述的步驟獲 得的兩個7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻吩二爺基乙二胺鹽的樣本轉(zhuǎn)化 為頭孢西丁。獲得相同的摩爾產(chǎn)率。


圖l是對表示的酶活性對反應(yīng)溫度繪圖。 圖2是將活性以IU/ml對操作pH繪圖。 圖3是顯示的僅僅是一些反應(yīng)動力學(xué)。
權(quán)利要求
1. 制備式I化合物的方法，其中使式II化合物經(jīng)歷乙?；?，其特征在于所述水解在pH為5-9之間，溫度為-10℃和+45℃之間，在由至少一種具有水解乙?；钚缘拿附M成的催化劑存在下，在水中進行。
2. 如權(quán)利要求1所要求保護的方法，其特在于所述催化劑由固 定在固體載體上的酶組成。
3. 如權(quán)利要求1所要求保護的方法，其特征在于所述酶是由選 自紅冬孢酵母、短小芽胞桿菌、大腸桿菌、Acremonium chrysogenum 和棒狀鏈霉菌的微生物獲得的。
4. 如權(quán)利要求1所要求保護的方法，其特征在于通過沉淀從水 性反應(yīng)介質(zhì)中獲得作為有機堿的鹽的所述式I化合物。
5. 如權(quán)利要求4所要求保護的方法，其特征在于所述有機堿選 自二節(jié)基乙二胺和其鹽。
6. 如權(quán)利要求1所要求保護的方法，其特征在于所述水解溫度 在0X:和+22X:之間，所迷pH在6-8之間。
全文摘要
用于通過水解生產(chǎn)7-甲氧基-3-脫乙酰基頭孢噻吩的方法，其在水中發(fā)生并且用酶催化。通過已知的方法，由該化合物可以獲得頭孢西丁。
文檔編號C07D501/00GK101418331SQ20081016980
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者A·R·塔格利亞尼, G·古阿斯塔勒格納米, G·弗格利亞托, R·蒙古齊 申請人:艾斯.多伯法股份公司