專利名稱：：納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)可以容易獲得有效成分被純化的珍珠蛋白或珍珠肽的方法，特別涉及一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法。
背景技術(shù)：
：不論珍珠或珍珠母，外套膜外表皮細(xì)胞是其形成的唯一基礎(chǔ)物質(zhì)。市售微米級(jí)珍珠粉或珍珠母粉，95%99%由霰石晶型碳酸鈣外加少數(shù)的方解石晶型碳酸鈣組成，只含1%~5%多糖和蛋白質(zhì)的有機(jī)基質(zhì)。因此，在化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)，想以珍珠有機(jī)基質(zhì)的有效成分作為調(diào)劑時(shí)，市售微米級(jí)珍珠粉或珍珠母粉，因有機(jī)基質(zhì)含量不高或不穩(wěn)定或未被純化，難以直接被實(shí)施利用。雖然本件申請(qǐng)人公司負(fù)責(zé)人已成功研發(fā)出納米級(jí)珍珠粉，如臺(tái)灣專利發(fā)明證書第201397號(hào)"一種食用珍珠粉制法"的專利案，但其仍屬直接食用好消化吸收的階段，若要在產(chǎn)業(yè)上利用其珍珠的有效成分，則會(huì)因珍珠有機(jī)基質(zhì)含量不明確及未被純化，仍然難以在具有經(jīng)濟(jì)效益等條件下被實(shí)施。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，是取納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液，經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物；再利用膠體過(guò)濾分離方式，分離出分子量分級(jí)的珍珠蛋白及分級(jí)的珍珠肽。使化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)由此獲得有效成分被純化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。其中優(yōu)選在所述膠體過(guò)濾分離之前，分別將第一及第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物先進(jìn)行硫酸銨沉淀與透析。本發(fā)明的次一目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其中，所述納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，總共加水之量要使珍珠粉重量與水體積之比為1:10(例如20g珍珠粉以200mL水萃取)，在室溫下用攪拌機(jī)進(jìn)行24小時(shí)的攪拌，使納米珍珠粉在水中充分萃取。本發(fā)明的再一目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其中，納米珍珠水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)，是將納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿『笾糜谛D(zhuǎn)容器中，以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm的高速旋轉(zhuǎn)離心方式產(chǎn)生懸浮液，并在懸浮液去除雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置(CentriprepCentrifugalFilter)的離心濃縮分離方式，分離出水溶性分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物。本發(fā)明的次再一目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其中，納米珍珠非水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)，是將納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm時(shí)所產(chǎn)生的離心力，再取珍珠粉沉淀物，加70%曱醇萃取，加70%甲醇之量要使珍珠粉沉淀物重量與70%曱醇體積之比為1:10(例如20g珍珠粉沉淀物以200mL的70%曱醇萃取)，在4。C攪拌12小時(shí)，使珍珠粉中的非水溶性有機(jī)基質(zhì)在曱醇中充分萃取，再以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液，并經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，同樣通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物(外管)及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物(內(nèi)管)；且萃取的有機(jī)基質(zhì)甲醇液以減壓濃縮機(jī)濃縮去除甲醇后再冷凍干燥濃縮。本發(fā)明的另一目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的裝置，該裝置包括溶解槽、攪拌機(jī)、離心分離機(jī)、離心濃縮濾膜、沉淀與透析器、膠體過(guò)濾分離器。其中，所述離心濃縮濾膜裝置，是由一圓管形容器、一濾液收集管、一栓鈕及一氣密蓋所構(gòu)成；所述圓管形容器，用于雜質(zhì)過(guò)濾后懸浮液填裝，具有滿液標(biāo)線；所述濾液收集管，設(shè)在圓管形容器內(nèi)，底端內(nèi)部具有濾膜膜架，上端頸口具有排液凹槽；所述栓鈕，鎖固在圓管形容器上部限定濾液收集管；所述氣密蓋，組合在栓鈕上端；由此所述離心濃縮濾膜裝置以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm時(shí)所產(chǎn)生的離心力，即可由濾膜膜架對(duì)懸浮液的過(guò)濾濃縮作用，能以離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物(外管)及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物(內(nèi)管)。本發(fā)明的又一目的是提供一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的裝置，其中，分離出蛋白分子量分級(jí)的所述膠體過(guò)濾分離方式，可以利用一膠體過(guò)濾器，是一管柱內(nèi)填裝多孔性凝膠顆粒構(gòu)成，形成網(wǎng)狀篩孔。所述凝膠可以是Polydextran葡聚糖膠體溶液凝結(jié)構(gòu)成，利用分子流經(jīng)其內(nèi)部網(wǎng)狀篩孔時(shí)，大分子只流經(jīng)凝膠與管柱間孔隙排除在篩孔之外，因而快速流出管柱；小分子進(jìn)入凝膠內(nèi)篩孔中，在管柱中停滯時(shí)間較長(zhǎng)，較慢流出管柱，因而區(qū)分出大小不同的分子；由不同型號(hào)的凝膠選擇運(yùn)用，使分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物，可再作分子量大小區(qū)分，得到分子量分級(jí)的珍珠蛋白，以及使分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物，可再作分子量大小區(qū)分，得到分子量分級(jí)的珍珠肽。本發(fā)明的有益效果是納米珍珠粉的有機(jī)基質(zhì)(有效成分)，能便利地由本發(fā)明方法加以萃取，并可進(jìn)一步將其分離出分子量分級(jí)的珍珠蛋白與分級(jí)的珍珠肽，且可再經(jīng)由生物活性測(cè)試得到更具顯著效果的單一成分，并僅須圖譜等鑒定流程的建立，即可大量提供化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)，作符合經(jīng)濟(jì)效益的最佳利用。圖1為本發(fā)明方法流程圖2為本發(fā)明方法離心濃縮濾膜裝置實(shí)施例構(gòu)造示意圖；圖3為本發(fā)明方法硫酸銨沉淀法示意圖；圖4為本發(fā)明方法膠體過(guò)濾分離方式實(shí)施例構(gòu)造示意圖；圖5為本發(fā)明方法納米珍珠粉蛋白以SephadexG25凝膠進(jìn)行層析后的蛋白質(zhì)含量分布；圖6為以本發(fā)明方法得到的微米珍珠粉蛋白以SephadexG25凝膠進(jìn)行層析后的蛋白質(zhì)含量分布；圖7為本發(fā)明方法納米珍珠粉經(jīng)由飽和疏酸銨沉淀后得到的蛋白質(zhì)，以SephadexG25凝膠進(jìn)行層析，收集于不同管的SDS-PAGE電泳分析圖(4~9管)；SephadexG25凝膠進(jìn)行層析，收集于不同管的SDS-PAGE電泳分析圖(10~15管)；圖9為本發(fā)明方法所萃取分離出的分子量大于5kDa與小于5kDa的蛋白質(zhì)，以SDS-PAGE驗(yàn)證所得到的示意圖IO為本發(fā)明方法所萃取的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物，加入人類皮膚纖維母細(xì)胞24小時(shí)后所測(cè)得的細(xì)胞增生情況示意圖11為本發(fā)明方法所萃取的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物與熊果素對(duì)酪氨酸酶抑制效果的統(tǒng)計(jì)分析圖12為本發(fā)明方法所萃取的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物的生物活性評(píng)估的流程示意圖13為本發(fā)明方法所得到的分子量分級(jí)的珍珠蛋白及分級(jí)的珍珠肽，其再次生物活性測(cè)試及鑒定的流程示意圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明1-納米珍珠粉；1A-珍珠4分沉淀物；11、11A-懸浮液；12A-第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物；12B-第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物；13A-純化的珍珠蛋白；13B-純化的珍珠肽；20、20A-攪拌機(jī)；30-旋轉(zhuǎn)容器；40-離心濃縮濾膜裝置；41-圓管形容器；410-滿液標(biāo)線；42-濾液收集管；420-濾膜膜架；421-頸口；422-排液凹槽；43-栓4丑；44-氣密蓋；50-月交體過(guò)濾器；51-管柱；52-凝膠。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說(shuō)明。一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，如圖1所示，是取納米珍珠粉1先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液11,經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置40的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B;分別將第一及第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A、12B,利用膠體過(guò)濾分離方式，分離出分子量分級(jí)的珍珠蛋白13A及分級(jí)的珍珠肽13B;使化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)，由此可以獲得有效成分被純化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，如圖1所示，納米珍珠粉1先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿。渲惺且?0g珍珠粉總共以200mL水萃取，在室溫下用攪拌機(jī)20進(jìn)行24小時(shí)的攪拌，使納米珍珠粉1可在水中充分萃取。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，如圖1所示，將納米珍珠粉1先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，在攪拌完成后置于旋轉(zhuǎn)容器30中，以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm的高速旋轉(zhuǎn)離心方式產(chǎn)生懸浮液11,并在懸浮液11去除雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置(CentriprepCentrifugalFilter)40的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，如圖1、2所示，該離心濃縮濾膜裝置40,是由一圓管形容器41、一濾液收集管42、一栓鈕43及一氣密蓋44所構(gòu)成；該圓管形容器41,用于雜質(zhì)過(guò)濾后懸浮液11填裝，具有滿液標(biāo)線410;該濾液收集管42,設(shè)在圓管形容器41內(nèi)，底端內(nèi)部具有濾膜膜架420,上端頸口421具有排液凹槽422;該栓鈕43,鎖固在圓管形容器41上部限定濾液收集管42;該氣密蓋44，組合在栓鈕43上端；由此該離心濃縮濾膜裝置40以轉(zhuǎn)速每分鐘3000轉(zhuǎn)(3000卬m)時(shí)所產(chǎn)生的離心力，即可由濾膜膜架420對(duì)懸浮液11的過(guò)濾濃縮作用，能以離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，通過(guò)膠體過(guò)濾分離方式來(lái)分離蛋白質(zhì)分子量，可先進(jìn)行碌b酸銨沉淀與透析，是將已制備出的珍珠水溶性有機(jī)基質(zhì)以水回溶(IOmg/mL)，在冰浴下邊搖晃邊逐滴加入飽和石克酸銨水溶液4吏蛋白質(zhì)沉淀。將溶液分裝在50mL離心管，在4。C下高速14000rpm離心40分鐘。收集沉淀溶于最少量的水，裝入透析袋。將收集到的沉淀置于2L的純水進(jìn)行透析，每12小時(shí)更換緩沖液，透析48小時(shí)，之后再進(jìn)行膠體過(guò)濾分離蛋白質(zhì)分子量。其原理，如圖3所示，硫酸銨(ammoniumsulfate):硫酸銨是一中性鹽，對(duì)蛋白質(zhì)有相當(dāng)好的安定作用，其吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。外加大量離子(如硫酸銨)，滯留的水分子會(huì)被抽出，與新加入的離子產(chǎn)生水合，因而暴露出蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)；蛋白質(zhì)分子間，因此得以非極性基團(tuán)互相結(jié)合，造成大的沉淀粒子，稱為鹽析。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，如圖1、4所示，該膠體過(guò)濾分離方式，是用凝膠層析原理進(jìn)行，其設(shè)備包括一膠體過(guò)濾器50，是由一管柱51內(nèi)填裝多孔性凝膠52顆粒，該凝膠可以是Polydextran葡聚糖膠體溶液凝結(jié)構(gòu)成，利用分子流經(jīng)其內(nèi)部網(wǎng)狀篩孔時(shí)，大分子只流經(jīng)凝膠52與管柱51間孔隙排除在篩孔之外，因而快速流出管柱51;小分子進(jìn)入凝膠52內(nèi)篩孔中，在管柱51中停滯時(shí)間較長(zhǎng)，較慢流出管柱51，因而區(qū)分出大小不同的分子；可選擇不同型號(hào)的凝膠52,例如使用SephadexG25的polydextran凝膠。SephadexG25可區(qū)分分子量在5kDa以下，因此可以劃分珍珠有機(jī)基質(zhì)中分子量小于5kDa與大于5kDa的蛋白質(zhì)。珍珠粉經(jīng)由飽和石危酸銨沉淀出蛋白質(zhì)后，以SephadexG25凝膠層析進(jìn)行分離。緩沖溶液為10mMKH2PO4，每lmL收集一管，每管稱之為一級(jí)分，共收集15管，即級(jí)分1~級(jí)分15。數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。其結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean土SD)表示，n=3。*表示P〈0.05。如圖5、圖6、表l、表2所示，納米珍珠粉層析出的蛋白質(zhì)其級(jí)分4級(jí)分6(占蛋白質(zhì)分布比率51.6%)與級(jí)分10~級(jí)分13(占蛋白質(zhì)分布比率10.3%)出現(xiàn)明顯蛋白質(zhì)分布；微米珍珠粉層析出的蛋白質(zhì)其級(jí)分4級(jí)分6(占蛋白質(zhì)分布比率55.5%)出現(xiàn)明顯蛋白質(zhì)分布，其級(jí)分10之后無(wú)明顯的分布，但突然在級(jí)分15出現(xiàn)一個(gè)較濃的蛋白質(zhì)分布(4.6%)。實(shí)驗(yàn)至此，雖然尚未對(duì)每個(gè)層析出的級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析測(cè)試，但以SephadexG25凝膠層析是根據(jù)分子量大小作為分離原理來(lái)看，用相同緩沖溶液沖洗，納米珍珠蛋白與微米珍珠蛋白出現(xiàn)不一樣的蛋白質(zhì)濃度分布(納米珍珠蛋白級(jí)分10-級(jí)分11出現(xiàn)比微米珍珠蛋白較多的分布)，顯示納米珍珠蛋白小分子的含量比微米珍珠蛋白的含量多。表1納米珍珠粉蛋白以SephadexG25凝膠進(jìn)行層析后的蛋白質(zhì)含量分布表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。其結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P〈0.05。表2微米珍珠粉蛋白以SephadexG25凝膠進(jìn)行層析后的蛋白質(zhì)含量分布表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。其結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P〈0.05。經(jīng)由SephadexG25凝膠層析處理后的SDS-PAGE圖，如圖7、圖8所示，可經(jīng)由生物活性測(cè)試，選取有效的納米珍珠蛋白(肽)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析分子量測(cè)試，納米珍珠蛋白(肽)經(jīng)過(guò)SephadexG25層析后，每1mL收集一管，每管稱之為一級(jí)分，共收集15管，級(jí)分1~級(jí)分15的SDS電泳圖，以log(分子量)對(duì)相對(duì)移動(dòng)距離作圖，求得分子量。級(jí)分4級(jí)分6的分子量約在610kDa,命名為級(jí)分A;級(jí)分7級(jí)分9分子量約在46kDa，命名為級(jí)分B;級(jí)分10級(jí)分13分子量約在23.8kDa,命名為級(jí)分C。根據(jù)上述實(shí)施例，其中，如圖l所示，納米珍珠粉l先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液11,得到珍珠粉沉淀物1A。本發(fā)明的另一實(shí)施例中，是將所述珍珠粉沉淀物加70%曱醇使之充分萃取，其中是以20g珍珠粉沉淀物以200mL的70%曱醇萃取，于4。C下攪拌12小時(shí)，再以高速3000rpm旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液11A,并經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，同樣通過(guò)離心濃縮濾膜裝置40的離心濃縮分離方式，可分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B，萃取的有機(jī)基質(zhì)甲醇液以減壓濃縮機(jī)濃縮去除曱醇后再以冷凍干燥濃縮，得到珍珠粉中的非水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取物，再經(jīng)凝膠層析處理，同樣可得到如上所述的不同分子量級(jí)分的珍珠蛋白(肽)。根據(jù)上述實(shí)施例，為證實(shí)本發(fā)明方法的可行及為獲知納米珍珠粉與微米珍珠粉，在同樣用本發(fā)明方法所得到的珍珠有機(jī)基質(zhì)，其(有效成分)效果的差別，做以下驗(yàn)證并得到結(jié)果1.納米珍珠粉與微米珍珠粉的懸浮液，經(jīng)過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離后，以SDS-PAGE驗(yàn)證，如圖9,成功分離(區(qū)別)出分子量大于5kDa與小于5kDa的蛋白質(zhì)。此可代表濾膜功能發(fā)揮。且一般微米珍珠粉萃取出的有機(jī)基質(zhì)在顏色上呈現(xiàn)偏黃，而納米珍珠粉萃取的有機(jī)基質(zhì)在顏色上呈現(xiàn)乳白色；經(jīng)由濃縮濾膜分離出小于5kDa的有機(jī)基質(zhì)相較于大于5kDa的有機(jī)基質(zhì)呈現(xiàn)出較為粘稠狀的質(zhì)感。結(jié)果顯示的確可以此法萃取出珍珠中的有機(jī)基質(zhì)。2.將1mg的珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物溶于水，以Bradford蛋白bindingassay方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。此定量方法利用CoomassieBrilliantBlueG-250會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，在G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，G-250的顏色會(huì)從紅色轉(zhuǎn)變成為藍(lán)色，此時(shí)在595nm波長(zhǎng)下，會(huì)有較高的吸收，以便檢測(cè)。經(jīng)由此法測(cè)定納米珍珠水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取物的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)每lmg約含蛋白質(zhì)14.43而微米珍珠水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取物的蛋白質(zhì)含量較少，每1mg約含蛋白質(zhì)7.48pg(表3)。推測(cè)其原因?yàn)閷⒄渲榉奂{米化后，導(dǎo)致碳酸釣結(jié)晶霰石薄板破裂，霰石板破裂內(nèi)(intracrystalline)主要成分蛋白質(zhì)釋出。納米珍珠非水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取物的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)每lmg約含蛋白質(zhì)16.84ng;而微米珍珠非水溶性有機(jī)基質(zhì)萃取物的蛋白質(zhì)含量，每1mg約含蛋白質(zhì)14.06pg(表4)，顯示珍珠粉甲醇萃取物無(wú)論是納米級(jí)或是微米級(jí)其蛋白質(zhì)含量比珍珠水萃物更多。表3本發(fā)明方法珍珠水萃物蛋白質(zhì)含量表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.珍珠有機(jī)基質(zhì)對(duì)纖維母細(xì)胞增生的影響(以下實(shí)驗(yàn)按照表5分類代碼)表5本發(fā)明方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的珍珠萃取物分類代碼表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>水溶性有機(jī)基質(zhì)在進(jìn)行珍珠水萃物對(duì)纖維母細(xì)胞林增生率實(shí)驗(yàn)之前，我們已先行將珍珠水萃物以CentriprepYM3超離心濾膜，以分子量做出約略區(qū)分，把水溶性的珍珠有機(jī)基質(zhì)分為大于5kDa與小于5kDa兩部分。因此實(shí)驗(yàn)中除了設(shè)計(jì)評(píng)估微米珍珠粉與納米珍珠粉水溶性有機(jī)基質(zhì)對(duì)纖維母細(xì)胞增生率的影響，也同時(shí)設(shè)計(jì)評(píng)估相同粒子等級(jí)的珍珠粉，分子量大于5kDa的有機(jī)基質(zhì)與分子量小于5kDa的有機(jī)基質(zhì)對(duì)纖維母細(xì)胞增生率的影響。如圖10及表6所示為序列濃度(0、0.5、1、2、4mg/mL)的珍珠水萃取物(pearl1、2、3、4)處理人類皮膚纖維母細(xì)胞林24小時(shí)的細(xì)胞增生率變化的情形，細(xì)胞增生率變化以(％ofcontrol)表示。數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P〈0.05。結(jié)果顯示珍珠水萃物pearl4,也就是萃取自納米珍珠粉分子量小于5kDa的水溶性有機(jī)基質(zhì)，在lmg/mL的濃度下，對(duì)纖維母細(xì)胞處理24小時(shí)之后產(chǎn)生較明顯促進(jìn)增生的功效，增生率提高為132%。投予珍珠水萃物pear13(萃取自納米珍珠粉分子量大于5kDa的水溶性有機(jī)基質(zhì))的纖維母細(xì)胞也有大約130%的增生率。表6珍珠水萃取物對(duì)人類皮膚纖維母細(xì)胞林24小時(shí)的細(xì)胞增生情況示意圖Hs680mg/mL0.5mg/mL1mg/mL2mg/mL4mg/m3Lpearl1100±0109±1.6114±1.6111±1.6117.75±1.7pearl2100±0110.7±2.1110.2±1.7101±0.8102±0.8pearl3100±0113.2±1.7130.2±1.7120.2±2.2119.7±1.7pearl4100±0126.7±1.7133±0.8103.5±1.3106.7±1.7數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P化05。相同濃度下(1mg/mL)的微米珍珠粉有機(jī)基質(zhì)，不論是珍珠水萃物pearl1(分子量大于5kDa的)或pearl2(分子量小于5kDa)其促進(jìn)增生效果較不明顯，其增生率分別為114%與110%。當(dāng)將投予細(xì)胞的珍珠水萃物濃度往上提高至2mg/mL與4mg/mL時(shí)，可見到原先在濃度1mg/mL下增生率提高比較明顯的pearl3和pearl4增生率反而下降；pearl2也有同樣情況；pearl1在濃度4mg/mL下，增生率反而提升至118%。將此結(jié)果對(duì)照其他相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，軟體動(dòng)物貝殼有機(jī)基質(zhì)萃取物對(duì)細(xì)胞增生率的影響，并非與濃度呈正比，而是會(huì)在某個(gè)濃度下使細(xì)胞增生率明顯提高，當(dāng)以此濃度為基準(zhǔn)逐漸提高有機(jī)基質(zhì)濃度時(shí)，細(xì)胞增生率并不會(huì)隨著濃度提高而上升，甚至?xí)虼硕陆怠?.珍珠有機(jī)基質(zhì)對(duì)黑色素生成的影響水溶性有機(jī)基質(zhì)在進(jìn)行評(píng)估珍珠水萃物影響酪氨酸酶(tyrosinase)活性(dopachrome生成)實(shí)驗(yàn)之前，我們已先行將珍珠水萃物以CentriprepYM3超離心濾膜，以分子量做出約略區(qū)分，把水溶性的珍珠有機(jī)基質(zhì)分為大于5kDa與小于5kDa兩部分。因此實(shí)驗(yàn)中除了設(shè)計(jì)評(píng)估微米珍珠粉與納米珍珠粉水溶性有機(jī)基質(zhì)對(duì)tyrosinase活性的影響，也同時(shí)設(shè)計(jì)評(píng)估相同粒子等級(jí)的珍珠粉，分子量大于5kDa的有機(jī)基質(zhì)與分子量小于5kDa的有機(jī)基質(zhì)對(duì)tyrosinase活性的影響。圖11及表7所示為不同時(shí)間下，濃度2mg/mL的珍珠水萃物與熊果素(Arbutin)對(duì)酪氨酸酶抑制效果的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P<0.05。如結(jié)果所示，pearl3(納米珍珠粉水萃物，大于5kDa)濃度1mg/mL,在37°C、PH6.8條件下，與20mM酪氨酸以及383units/mL酪氨酸酶反應(yīng)30分鐘之后，相較于空白，可減少約24%的dopachrome生成；反應(yīng)1小時(shí)之后，仍可以抑制約19%的dopachrome生成。相同劑量的熊果素在反應(yīng)30分鐘后，其抑制能力達(dá)53%;反應(yīng)l小時(shí)之后，抑制能力仍有21%。比較之后發(fā)現(xiàn)，pearl4在反應(yīng)30分鐘后，其約有熊果素五分之四的抑制能力；反應(yīng)1小時(shí)之后，其抑制能力與熊果素相當(dāng)。表7珍珠水萃取物與熊果素對(duì)酪氨酸酶抑制效果統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>數(shù)據(jù)以SigmaPlot2000軟體進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean士SD)表示，n=3。*表示P〈0.05。水萃物pearl1、pearl2、pearl4在反應(yīng)30分鐘后，抑制酪氨酸酶活性14%~15%,約是熊果素抑制能力的七分之二；反應(yīng)1小時(shí)之后，抑制酪氨酸酶活性約為2%~7%。因此，依上述驗(yàn)證結(jié)果，如圖1,本發(fā)明方法所得到的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B(這二者均既指水萃取物，也指甲醇萃取物，其測(cè)試評(píng)估方法相同)，如圖12,可以在通過(guò)一項(xiàng)生物活性評(píng)估流程后，確定其有效成分具有顯著效果；而這項(xiàng)生物活性評(píng)估流程，包括1.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，以Bradfordassay測(cè)定蛋白質(zhì)含量為每lmg萃取物約含蛋白質(zhì)14.43pg。2.酪氨酸酶抑制能力評(píng)估，與市售美白成分相比測(cè)定對(duì)酪氨酸酶抑制能力，證實(shí)其阻斷Melanin(黑色素)生成途徑，提高酪氨酸酶活性的抑制能力；3.細(xì)胞增生評(píng)估，以人類纖維母細(xì)胞抹，進(jìn)行MTT以及膠原蛋白測(cè)定，證實(shí)可提高人類皮膚纖維母細(xì)胞的增生；4.紫外線吸收能力評(píng)估，測(cè)定對(duì)UVA、UVB的最大吸收波長(zhǎng)；除此之外，第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12A及第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物12B,在利用膠體過(guò)濾分離法分離(區(qū)分)后，如圖13所示，其分子量分級(jí)的珍珠蛋白13A及分級(jí)的珍珠肽13B,可再次進(jìn)行生物活性測(cè)試，得到具有更顯著效果的單一成分，并可以由SDS-PAGE電泳圖，HPLC分析圖鐠，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定圖作為鑒定。由此可見，納米珍珠粉的有機(jī)基質(zhì)(有效成分)，能便利的由本發(fā)明方法加以萃取，并可進(jìn)一步將其分離出分子量分級(jí)的珍珠蛋白與分級(jí)的珍珠肽，且可再經(jīng)由生物活性測(cè)試得到更具顯著效果的單一成分，并僅須圖譜等鑒定流程的建立，即可大量提供化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)，作符合經(jīng)濟(jì)效益的最佳利用。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其特征在于取納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液，經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物；分別將第一及第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物，利用膠體過(guò)濾分離方式，分離出分子量分級(jí)的珍珠蛋白及分級(jí)的珍珠肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其特征在于所述納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，總共加水之量要使珍珠粉重量與水體積之比為1:10,在室溫下用攪拌機(jī)進(jìn)行12小時(shí)的攪拌，使珍珠粉在水中充分萃取。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其特征在于所述納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿『笾糜谛D(zhuǎn)容器中，以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm的高速旋轉(zhuǎn)離心方式產(chǎn)生懸浮液，并在懸浮液去除雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其特征在于進(jìn)行膠體過(guò)濾并結(jié)合SDS-PAGE電泳，其后合并得到的級(jí)分4~級(jí)分6,其分子量約在610kDa,命名為級(jí)分A;合并級(jí)分7~級(jí)分9，分子量約在46kDa,命名為級(jí)分B;合并級(jí)分10級(jí)分13,分子量約在23.8kDa，命名為級(jí)分C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其方式取懸浮液，其珍珠粉沉淀物，可再以70%甲醇攪拌萃取，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液，并經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，同樣通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，可分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，其特征在于所述珍珠粉沉淀物于70%甲醇中攪拌，加70%甲醇之量要使珍珠粉沉淀物重量與70%甲醇體積之比為1:10，在4。C的環(huán)境溫度下攪拌12小時(shí)，使珍珠粉中的非水溶性有機(jī)基質(zhì)在甲醇中充分萃取。7.—種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的裝置，其特征在于該裝置包括溶解槽、攪拌機(jī)、離心分離機(jī)、離心濃縮濾膜、沉淀與透析器、膠體過(guò)濾分離器。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的裝置，其特征在于，所述離心濃縮濾膜裝置，是由一圓管形容器、一濾液收集管、一栓鈕及一氣密蓋所構(gòu)成；所述圓管形容器，用于雜質(zhì)過(guò)濾后懸浮液填裝，具有滿液標(biāo)線；所述濾液收集管，設(shè)在圓管形容器內(nèi)，底端內(nèi)部具有濾膜膜架，上端頸口具有排液凹槽；所迷栓鈕，鎖固在圓管形容器上部限定濾液收集管；所述氣密蓋，組合在栓鈕上端；以所述離心濃縮濾膜裝置以轉(zhuǎn)速每分鐘3000rpm時(shí)所產(chǎn)生的離心力，即可由濾膜膜架對(duì)懸浮液的過(guò)濾濃縮作用，能以離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的裝置，其特征在于，所述膠體過(guò)濾分離方式，是一膠體過(guò)濾器，由一管柱內(nèi)填裝多孔性凝膠顆粒，所述凝膠可以是Polydextran葡聚糖膠體溶液凝結(jié)構(gòu)成的，利用分子流經(jīng)其內(nèi)部網(wǎng)狀篩孔時(shí)，大分子只流經(jīng)凝膠與管柱間孔隙排除在篩孔之外，因而快速流出管柱；小分子進(jìn)入凝膠內(nèi)篩孔中，在管柱中停滯時(shí)間較長(zhǎng)，較慢流出管柱，因而區(qū)分出大小不同的分子。全文摘要一種納米珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取與分子量分級(jí)的方法，是取納米珍珠粉先后兩次加水?dāng)嚢枋怪浞州腿?，以高速旋轉(zhuǎn)離心方式取懸浮液，經(jīng)雜質(zhì)過(guò)濾后，通過(guò)離心濃縮濾膜裝置的離心濃縮分離方式，分離出分子量大于5kDa的第一珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有機(jī)基質(zhì)萃取物；進(jìn)一步以硫酸銨沉淀法分離出珍珠蛋白與無(wú)法沉淀出的蛋白質(zhì)，并以SephadexG25凝膠依照蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行層析，得到三個(gè)級(jí)分級(jí)分A，級(jí)分B，級(jí)分C。使化妝品、食品等產(chǎn)業(yè)，可以由此獲得有效成分被純化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。文檔編號(hào)C07K1/00GK101381400SQ200810169588公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日發(fā)明者丁云川,馮源鳳,洪永豐,陳明德,龍鳳娣申請(qǐng)人:晶旺生物科技股份有限公司