專利名稱：一種5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2′-去氧-5′-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種的合成新工藝，屬于生物醫(yī)藥診斷試劑的制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物素標(biāo)記的核苷三磷酸化合物在分子生物學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明 涉及5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷及其類似 物的制備工藝。
合成路線中最關(guān)鍵步驟為三磷酸化反應(yīng)，Ter6z Kov6cs等(Tetrahedron Lett.1988,29， 4525-4528. Angew. Chew. Int. Ed. 1998, 37(20)， 2872-2875. Nucleic Acids Research. 2001, 29(7)， 1565 —1573.)報(bào)道了三磷酸化反應(yīng)條件，他們純化分離產(chǎn)品的方法 均采用S印hadex層析或者制備高壓液相層析，嚴(yán)重限制了產(chǎn)品的大量制備，Wlassoff等 (Bioconjugate Chem. 1995， 6， 352-360.)報(bào)道了三磷酸鋰鹽的制備方法。
張禮和等人(北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1987， 19 (5)， 334—336。北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1990， 22 (3)， 209—212。)使用的合成路線以2'-去氧一5' —三磷酸尿嘧啶核苷為起始原料，5 位丙烯胺基取代以后與生物素酰氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)得到5-[3-(生物素酰 氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2'-去氧-5'-三磷酸尿嘧啶核苷，原料本身就不易得，再加上 帶有三磷酸根，在常溫條件下穩(wěn)定性都很差，所以反應(yīng)都要盡可能在低溫和短時(shí)間內(nèi)完成， 并且以后每一步反應(yīng)物純化均要S印hadex層析或者制備高壓液相層析，同樣限制了產(chǎn)品的 大量制備。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯 基-2'-去氧-5'-三磷酸尿噴啶核苷及其類似物的合成和純化方法，適用于大量合成。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是將圖l所述化合物(a)和質(zhì)子綿加入到單
口瓶中，加入磷酸三甲酯溶解后為淡黃色溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴控制溫度在1(TC以下，加入 三氯氧磷后反應(yīng)液立即由清澈變渾濁(粉色)，溫度控制在10'C以下反應(yīng)2-10hr后，加入焦 磷酸三正丁胺鹽的腿F溶液和三正丁胺的混合液，在低于l(TC的溫度下反應(yīng)3min后加入碳 酸三乙胺鹽緩沖溶液終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌lhr后，真空旋干溶劑。將粗產(chǎn)品溶解在5 20ml氨 水中，0 3(TC溫度下磁力攪拌反應(yīng)2 20hr后真空旋干溶劑，加入10 30ml純凈水溶解，
3二氯甲烷(30ml)萃取3遍，將水相真空旋干，得到的粗品通過柱層析，洗脫劑為丙醇，異 丙醇，氨水，水按不同比例混合，純化得到化合物2的純品。
將硼酸一硼酸鈉緩沖溶液(pH8-10)加入到盛有化合物2的單口瓶中，0 25'C下加入 生物素酰氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯的DMF溶液，0 25'C下反應(yīng)，真空旋干溶劑，得到 的粗品通過柱層析(洗脫劑為丙醇，異丙醇，氨水，水按不同比例混合)純化得到純品。
將5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷溶解在 水中，慢慢加入高氯酸鋰的丙酮溶液，大量白色固體析出后，離心機(jī)離心分層后，取出上層 清液，加入丙酮洗滌剩余固體，重復(fù)三次后，將固體常溫真空抽干，得到最終白色固體產(chǎn)品， 結(jié)構(gòu)分別通過1H醒R， HPLC-MS得到驗(yàn)證。最終產(chǎn)品化學(xué)純度大于95%。
本發(fā)明所涉及的三磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)品的純化工藝包括但不僅限于上述化合物，可適用 于通式化合物，如圖2所示。
其中X:為氫、羥基等取代基團(tuán)； Y:為氫、羥基等取代基團(tuán)； R:5位取代的尿噴啶或5位取代胞嘧啶等基團(tuán)； R,為H， Li， Na， K等。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖1是5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷及其 類似物的合成的工藝路線。
圖2是適用于本純化工藝的三磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物通式。
具體實(shí)施例方式
1)圖1中化合物(b)的制備
將化合物(a) (300mg)和質(zhì)子綿(237mg， 1. llmmol)加入到25ml單口瓶中，加入磷酸三 甲酯(2. 6ml)溶解后為淡黃色溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴控制溫度在0。C，加入三氯氧磷(120ul)， 反應(yīng)液立即由清澈變渾濁(粉色)，溫度控制在l(TC以下反應(yīng)2.5hr后，加入焦磷酸三正丁 胺鹽的DMF溶液(0.5M) (9ml)和三正丁胺(lml)的混合液，l(TC以下反應(yīng)3min后加入70ml 碳酸三乙胺鹽緩沖溶液(0. 1M)終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌lhr后，真空旋干溶劑，得到504mg粗品。將粗品溶解在16ml氨水中，20'C溫度下磁力攪拌反應(yīng)10hr后真空旋干溶劑，加入20ml 純凈水溶解，二氯甲烷(30ml)萃取3遍，將水相真空旋干，得到的粗品通過柱層析(洗脫 劑為異丙醇氨水水=11: 7: 2， Rf = 0. 1)純化得到純品90mgC12H20N30"P3 = 523. 22， MS:524[M+H]+，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分別通過"P麗R， 'H醒R， HPLC-MS得到驗(yàn)證。
2) 5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2' _去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷的制備
將15ml硼酸一硼酸鈉緩沖溶液(pH8. 5)加入到盛有中間體3 (40mg)的100ml單口 瓶中，2(TC下加入生物素酰氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(150mg溶解在15mlDMF中)的 DMF溶液，2(TC下反應(yīng)3hr后真空旋干溶劑，得到的粗品通過柱層析(洗脫劑為異丙醇氨 水水=11: 7: 2， Rf = 0. l)純化得到純品50mg C28H45N60,7P3S = 862. 67， MS:863[M+H]+。 lH_NMR( S ， 300MHz， D20):7 . 94 (s， 1H， C4H) ， 6. 39(t， 1H， d. H) ， 6. 27 6. 35 (m， 2H， CH=CH) ， 4.67 (m， 1H, C3. H)， 4.37 4. 61(m, 2H， Biotin ，—) ， 4.21 (m， 3H， C4, H， C5. H， C5， . H) ， 3.91 (m， 1H， C=C—CH2)， 3.28 (m， 1H， Biotin S—CH)， 3.17 (t， 2H， C—CH2—N)， 2.73 3.00 (ddd， 2H， Biotin S—CH2) ， 2.38 (m， 2H， C2. H， C2. . H) ， 2. 18 2. 33 (m， 4H， 0=C—CH2)， 1.33 1.67 (m， 12H， CH2)。
31PNMR (D20) :S=—6. 16(d， yP)， 一11. 15 (d， a p)， 一21.51 (t， PP)。
3) 5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基_2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的 制備
將5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2'-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷(36mg， 0.042mmo1)溶解在3ml純凈水中，慢慢加入llml高氯酸鋰的丙酮溶液，大量白色固體析出， 離心分層后，取出上層清液，加入8ml丙酮洗滌剩余固體，重復(fù)三次后，將固體常溫真空抽 干，得到20mg白色固體產(chǎn)品C28H41Li4N6017P3S=886.41， MS:863[M-4Li++5H]+，結(jié)構(gòu)分別通過 力NMR， 3IPNMR， HPLC-MS得到驗(yàn)證。最終產(chǎn)品化學(xué)純度大于95%。
質(zhì)譜測定產(chǎn)品分子量C28H41Li4N6017P3S=886.41， MS:863[M-4Li++5H]+。
tH核磁共振氫譜歸屬:'H-NMR(S， 300MHz， D20):7 . 94 (s， 1H， C4H) ， 6.39 (t， 1H， d. H)， 6. 27 6. 35 (m， 2H， CH=CH) ， 4.67 (m， 1H， C3'H) ， 4. 37 4. 61 (m， 2H， Biotin nchCH\N) ， 4.21 (m， 3H， C4'H， C5. H， C5. . H) ， 3.91 (m， 1H， OC—CH2) ， 3. 28 (m， 1H， Biotin S—CH)， 3.17 (t， 2H， C_CH2—N)， 2. 73 3. 00 (ddd， 2H， Biotin S—CH》，2.38 (m， 2H， C2. H， C2. . H)， 2. 18 2.33 (m， 4H， 0=C_CH2) ， 1.33 1.67 (m， 12H， CH2)。
3'P核磁共振磷譜歸屬31PNMR (D20) : S =_6. 16 (d， yP)， 一11. 15 (d， a P)，
—21.51 (t， PP)。
權(quán)利要求
1.一種5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的合成工藝，其特征是包括以下合成步驟1)以5-(3-三氟乙酰胺基)-丙烯基-2’-脫氧脲嘧啶核苷為起始物在磷酸三甲酯，三氯氧磷和焦磷酸三正丁胺鹽等試劑作用下進(jìn)行三磷酸化，其產(chǎn)物處理后用氨水作用脫去胺基保護(hù)基生成化合物2；2)化合物2用硅膠柱層析，用不同比例的醇和氨水系統(tǒng)洗脫線化；3)化合物2與生物素酰氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)生成化合物3；4)化合物3用硅膠柱層析，用不同比例的醇和氨水系統(tǒng)洗脫線化；5)化合物3在高氯酸鋰丙酮溶液中發(fā)生沉淀，得到目標(biāo)產(chǎn)物5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征是使用三磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物的純化工藝，該 化合物的純化工藝通過常規(guī)硅膠柱色譜完成，洗脫劑為丙醇，異丙醇，氨水，水按不同比例 混合，可適用于通式化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的合成方法，以簡便易得的2′-脫氧尿苷和生物素酰氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯為原料經(jīng)過5步反應(yīng)得到目標(biāo)化合物的鋰鹽與現(xiàn)有合成工藝相比，本發(fā)明的合成方法合成原料容易獲得、收率較高、反應(yīng)條件溫和且容易控制、分離純化方法容易操作，適用于大量制備。
文檔編號C07H19/00GK101684134SQ20081016694
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者曄 劉, 劉延春, 吳勁昌, 牟紅濤, 陽 蔡 申請人:北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司