棄去洗脫出的液體；
[0112] (19)重復(fù)上一步驟；
[0113] (20)將過(guò)濾忍放入新的收集管（試劑盒中提供）中。向過(guò)濾忍中屯、加入 100y195°C預(yù)熱的洗脫液或不含核酸酶的水，最大轉(zhuǎn)速離屯、20-30S收集RNA溶解液。
[0114] 2. 2mRNA提取 [011引參見(jiàn)實(shí)施例1。
[0116] 3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0117] 3.ImiRNA逆轉(zhuǎn)錄
[011引RT體系的配制：5XmiSc;ript HiSpec Buffer 4Ji1 ;10XNucleics Mix 2Ji1 ; miScript Reverse Transcriptase Mix 2 y I ；RNA lug；Nuclease-free &0補(bǔ)平至 20y1。ABI 9700型PCR儀上37°C保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95°C 5min終止反應(yīng)。 加入80y1Nuclease-free &0稀釋至100y1儲(chǔ)存在-20°C冰箱。
[0119] 3. 2mRNA逆轉(zhuǎn)錄
[0120] 采用如P神敵的的磨'IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號(hào) 18080-044) 進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：
[012。 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)1yg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用 25y1反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1yg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入W下組分：
[0122] 5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 5yl，10mmol/ldNTP1.25yl，0.lmmol/1DTT2. 5^1， 30ymmol/lOligodT2yl，200U/ylMMLV1.25yl，模板RNAlyg，加入滅菌水至總體系 25y1。42°C解育I小時(shí)，72°C10分鐘，短暫離屯、。cDNA保存放-20°C冰箱備用。
[012引4巧光定量PCR
[0124] 4. 1miRNA的RT-PCR體系：
[0125]
[0126] miRNAs的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，W snRNA U6作為內(nèi)參。
[0127]擴(kuò)增程序：95°CIOmin;40 個(gè)循環(huán)（95°C10s，60°C30s)。
[0128] 4. 2mRNA的RT-PCR體系：
[0131]mRNAs的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，W0 -actin作為內(nèi)參。
[0132]反應(yīng)體系：用化werSYBR@GreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號(hào) 4367659) 進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5° 10min，（95°C15sec， 60°C60sec)X45 個(gè)循環(huán)。
[0133] 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0134] 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增 效率相近，極限平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說(shuō)明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物 溶解曲線都是單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；采用化iginProS. 1軟件進(jìn)行 分析。統(tǒng)計(jì)方法均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P<0. 05 (差異顯著）和P<0.Ol(差異非常顯著）定 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析癌組織和癌旁組織中miR-632表達(dá)水平，結(jié)果顯示癌組織中miR-632 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，前者是后者的近4倍（具體見(jiàn)圖1);鼻咽癌組織中VPSll的表 達(dá)明顯低于癌旁組織，前者是后者的約=分之一（具體見(jiàn)圖2)。
[0135] 實(shí)施例4miR-632與VPSll調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證
[0136] 材料準(zhǔn)備：
[0137] 人鼻咽癌細(xì)胞株C肥購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì) 胞資源中屯、。
[0138] 引物設(shè)計(jì)：
[0139]VPSll擴(kuò)增引物：
[0140]正向引物：5' -CTCCTCAACTGCTATACC-3' 沈QIDNO4
[0141]反向引物：5' -GACTTCACTCTCACTCTT-3' 沈QIDNO5
[0142] 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度78bp。
[0143] 1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0144] 鼻咽癌細(xì)胞株采用含10 %胎牛血清和1 %青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，在 37°C，5%C〇2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于RNA抽提或下一步實(shí) 驗(yàn)。
[0145] 2.miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
[0146] 采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作按照Lipofectamin?2000試劑說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前24h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的5-8F及6-10B細(xì)胞接種到12孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約 2X104,常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞融合度為50-60 %是進(jìn)行試驗(yàn)。將20nM/40nM/80nM miRNAmimic加入到IOOulOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用IOOulOpti-MEM培養(yǎng)基稀 釋2ulLipofectamin?2000脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫解育5min;混合化ti-MEM-脂質(zhì)體與 化ti-MEM-miRNAs，室溫解育20min，W形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng) 基中，輕輕混勻，培養(yǎng)化后更換完全培養(yǎng)基。其中，非特異性的miR序列作為陰性對(duì)照。培 養(yǎng)4化后提取細(xì)胞總RNA或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0147] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0148] 將miR-632mimics轉(zhuǎn)染至人鼻咽癌細(xì)胞株中，4化后提取細(xì)胞總RNA，空白對(duì)照為 未轉(zhuǎn)入miRNA的人鼻咽癌細(xì)胞株細(xì)胞，非特異性的miRNA序列作為陰性對(duì)照。定量PCR檢 測(cè)預(yù)測(cè)祀基因VPSll的mRNA的水平變化。結(jié)果顯示與對(duì)照相比實(shí)驗(yàn)組VPSll基因表達(dá)水 平下調(diào)約35%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VPSll是miR-632的祀基因，鼻咽癌細(xì)胞株中miR-632的上調(diào) 引起VPSll基因的下調(diào)。
[0149] 雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各 種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動(dòng)來(lái) 使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。
[0150] 因此，本發(fā)明無(wú)意限定于本文中公開(kāi)的用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案；相反地， 本發(fā)明意欲包括落在權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.VPS11基因和/或VPS11蛋白在制備治療或診斷鼻咽癌試劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，治療鼻咽癌試劑是指可以促進(jìn)VPS11基因 的表達(dá)的試劑，優(yōu)選的，治療鼻咽癌試劑中含有促進(jìn)VPS11基因表達(dá)的載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，診斷鼻咽癌試劑包括熒光定量PCR方法、 基因芯片方法檢測(cè)鼻咽癌中VPS11基因的表達(dá)；或者用免疫方法檢測(cè)VPS11蛋白的表達(dá)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光定量PCR方法診斷鼻咽癌包括一對(duì)特 異性引物，上游引物序列為SEQIDNO. 4,下游引物序列為SEQIDNO. 5。 5. VPS11基因和/或蛋白的調(diào)控miRNA在制備診斷和/或治療鼻咽癌試劑中的應(yīng)用，其 特征在于，所述的調(diào)控miRNA為mir-632和/或miR-632〇6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，診斷鼻咽癌試劑包括基于高通量測(cè)序方 法和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)鼻咽癌樣本中mir-632和/或 miR-632的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)鼻咽癌樣本中miR-632調(diào)控的靶基因的表達(dá)情 況，優(yōu)選采用northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜 交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼻咽癌樣本中mir-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄；采用ELISA 和/或膠體金試紙條檢測(cè)鼻咽癌樣本中miR-632調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，治療鼻咽癌試劑為下調(diào)mir-632和/或 miR-632的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-632的活性的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海 綿、miRNAErasers、TargetMasking和/或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-632和/ 或miR-632的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-632的活性。9. 一種治療鼻咽癌藥物組合物，藥物組合物包含： (a) 促進(jìn)VPS11基因表達(dá)的制劑； (b) 藥劑學(xué)上能接受的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在，促進(jìn)VPS11基因表達(dá)的制劑為抑制 mir-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-632活性的制劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及鼻咽癌的新診治靶點(diǎn)及其應(yīng)用，更具體的涉及VPS11基因及其調(diào)控miRNA在診治鼻咽癌中的用途。發(fā)明通過(guò)高通量測(cè)序分析鼻咽癌組織及癌旁組織，獲得其mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組信息，經(jīng)分析篩選出選取VPS11基因和miR-363進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證及靶標(biāo)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，VPS11基因和miR-363與鼻咽癌密切相關(guān)，在鼻咽癌中VPS11是miR-632的靶基因。本發(fā)明為臨床診斷及預(yù)防檢測(cè)鼻咽癌提供了新的靶點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】A61K45/06, A61K48/00, C12Q1/68, G01N33/68, A61K31/713, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105343896
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510933534
【發(fā)明人】李偉, 馬會(huì)平
【申請(qǐng)人】李偉, 馬會(huì)平
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日