MicroRNA-29b作為藥物靶點(diǎn)在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于軟骨組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Micr〇RNA-29b作為藥物靶點(diǎn)在關(guān) 節(jié)軟骨修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)表面關(guān)節(jié)軟骨受損可由創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤等多種病因?qū)е?，常呈現(xiàn)進(jìn)行 性的損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏自身修復(fù)能力，如何實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨 缺損的功能性修復(fù)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題。組織工程學(xué)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和生物材料學(xué) 對(duì)受損組織進(jìn)行生理性修復(fù)，為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)提供了一種理想的修復(fù)方法。其中，選擇 和優(yōu)化適合的種子細(xì)胞是本領(lǐng)域中的重要命題。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs)由于其自身優(yōu)勢(shì)，被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是在軟骨組織工程中極具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。然 而，在構(gòu)建組織工程軟骨的研究中，MSCs來(lái)源的軟骨細(xì)胞難以維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，部分種子 細(xì)胞呈現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大化表型，提前進(jìn)入終末軟骨細(xì)胞階段，即發(fā)生肥大化，成為組織工程 軟骨移植后繼發(fā)細(xì)胞凋亡、血管侵入、基質(zhì)鈣化和異位骨化的啟動(dòng)因素，其勢(shì)必最終影響到 受損關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和功能重建。因此，如何抑制MSCs成軟骨分化后的肥大化進(jìn)程，穩(wěn)定 MSCs來(lái)源的軟骨細(xì)胞表型，已成為進(jìn)一步推進(jìn)MSCs用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中亟待解決的重要 問(wèn)題。
[0003] 已有研究顯示在MSCs成軟骨分化過(guò)程中，除了分泌軟骨組織特異性基質(zhì)，還逐 步出現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大化相關(guān)基因表達(dá)，包括X型膠原、堿性磷酸酶（ALP)、基質(zhì)金屬蛋白 酶-13(MMP-13)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)和甲狀旁腺素相關(guān)蛋白等。這些基因的表達(dá)提 示MSCs向軟骨分化過(guò)程中可能已經(jīng)進(jìn)入了軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程，這是骨骼發(fā)育過(guò)程中軟 骨內(nèi)骨化的一個(gè)典型階段。這使得體外構(gòu)建的組織工程軟骨在體內(nèi)難以建立穩(wěn)定的透明軟 骨結(jié)構(gòu)，將會(huì)過(guò)早啟動(dòng)軟骨內(nèi)成骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)失敗。
[0004] 正常胚胎發(fā)育中，軟骨內(nèi)成骨需要經(jīng)歷以下5個(gè)階段：間質(zhì)細(xì)胞的聚集、增殖，成 軟骨細(xì)胞分化，成熟的軟骨細(xì)胞逐漸肥大化，深層基質(zhì)部分鈣化、血管侵入，骨細(xì)胞和骨基 質(zhì)的生成和骨組織的最終替代。由此可見(jiàn)，成熟的軟骨細(xì)胞肥大化是軟骨內(nèi)骨化的一個(gè)必 須環(huán)節(jié)。干預(yù)該環(huán)節(jié)可望達(dá)到延遲軟骨內(nèi)骨化，同時(shí)保證MSCs向軟骨細(xì)胞分化的目的。然 而，現(xiàn)有技術(shù)還未有從抑制MSCs來(lái)源軟骨細(xì)胞肥大化的角度來(lái)修復(fù)缺損的關(guān)節(jié)軟骨的相 關(guān)報(bào)道。
[0005] 近年來(lái)，microRNA作為一類新的基因表達(dá)調(diào)控分子家族而受到廣泛的關(guān)注，已有 研究發(fā)現(xiàn)它們可作為重要的藥物作用靶點(diǎn)和潛在的核酸藥物應(yīng)用于疾病的治療。另外，大 量的研究證實(shí)miRNAs在調(diào)控干細(xì)胞分化進(jìn)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，是維持干細(xì)胞分 化特性及干細(xì)胞定向分化的時(shí)空調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。本發(fā)明前期通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在MSCs來(lái)源 軟骨細(xì)胞肥大化階段，microRNA-29b逐漸上調(diào)，而HDAC4以及Sox9逐漸下調(diào)，也就是說(shuō)， micr〇RNA-29b是調(diào)控MSCs成軟骨分化后發(fā)生肥大化改變的關(guān)鍵miRNA，作用機(jī)制是通過(guò)調(diào) 節(jié)其靶基因 HDAC4繼而調(diào)節(jié)Sox9-Runx2平衡發(fā)揮效應(yīng)?；诖搜芯拷Y(jié)論，在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù) 中，將microRNA-29b作為藥物靶點(diǎn)是可行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供MicroRNA_29b作為藥物靶點(diǎn)在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù) 中的應(yīng)用。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] l、MicroRNA-29b抑制劑在制備軟骨修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，所述抑制劑為病毒載體、質(zhì)粒、肽核酸、鎖核酸或2-Ome修飾的單鏈核苷 酸。
[0009] 優(yōu)選的，所述MicroRNA-29b抑制劑包含與microRNA-29b互補(bǔ)的核酸序列或互補(bǔ) 核酸序列的截短片段。
[0010] 優(yōu)選的，所述抑制劑包含如SEQ ID NO. 27所示的序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述MicroRNA-29b抑制劑為pGLVU6/GFP慢病毒載體，所述pGLVU6/GFP 慢病毒載體包含如SEQ ID NO. 27所示的序列。
[0012] 2、Micr〇RNA_29b抑制劑在制備抑制間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源軟骨細(xì)胞肥大化的試劑中 的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)利用microRNA_29b抑制劑抑制 micr〇RNA-29b的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)HDAC4以及Sox9的表達(dá)，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞肥大化相關(guān) 基因 Col X和MMP-13的表達(dá)，從而達(dá)到抑制MSCs來(lái)源軟骨細(xì)胞肥大化的目的；另外，由于 micr〇RNA-29b表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致糖胺多糖分泌增多，進(jìn)一步促進(jìn)了軟骨細(xì)胞表型的保持 和穩(wěn)定；蛋白聚糖的分泌增多則利于異位軟骨的形成；上述因素綜合作用最終達(dá)到受損關(guān) 節(jié)軟骨修復(fù)的目的。本發(fā)明為優(yōu)化軟骨組織工程的種子細(xì)胞提供了新方法，同時(shí)也為軟骨 細(xì)胞肥大化所導(dǎo)致的軟骨退行性病變提供了新思路。另外，針對(duì)目前在組織工程軟骨構(gòu)建 中由于種子細(xì)胞，尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源分化的軟骨細(xì)胞會(huì)肥大化，從而引起軟骨 修復(fù)區(qū)域纖維化而不是透明軟骨修復(fù)的難題，本發(fā)明采用micr 〇RNA-29b抑制劑抑制間充 質(zhì)干細(xì)胞肥大化分化，穩(wěn)定MSCs來(lái)源的軟骨細(xì)胞表型，防止組織工程軟骨纖維化和異位骨 化，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)組織工程軟骨修復(fù)，為組織工程軟骨構(gòu)建、軟骨支架材料設(shè)計(jì)及軟骨修 復(fù)提供了新方法。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0016] 圖 lmicroRNA_29b、Sox9、Runx2 及 HDAC4 的相互關(guān)系不意圖；其中，microRNA_29b 抑制其靶基因 HDAC4,而HDAC4抑制Runx2降解，從而調(diào)節(jié)Sox9-Runx2平衡。
[0017] 圖2為小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)14、21和28天，HDAC4、 Sox9、Col II、Runx2及Col X的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，由圖可知，經(jīng)過(guò)肥大化誘導(dǎo)后，肥大組細(xì) 胞HDAC4、Sox9及Col II的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而Runx2和Col X的表達(dá)量則顯著高 于對(duì)照組。
[0018] 圖3為小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)過(guò)程中microRNA-29b的 相對(duì)表達(dá)量與時(shí)間關(guān)系圖，由圖可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，肥大組細(xì)胞microRNA-29b的表 達(dá)量逐漸增加。
[0019] 圖4為轉(zhuǎn)染microRNA-29b inhibitor后Col X和MMP-13基因在不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的 相對(duì)表達(dá)量結(jié)果圖，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b抑制劑后細(xì)胞肥大化相關(guān)基因 Col X和MMP-13的表達(dá)明顯受到抑制。
[0020] 圖5為轉(zhuǎn)染microRNA-29b inhibitor后X型膠原（Col X)免疫組化染色結(jié)果 圖，該結(jié)果在0LYMPUS-IX71顯微鏡下觀察獲得，放大倍數(shù)為40X。由染色結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染 microRNA-29b inhibitor后X型膠原表達(dá)量較對(duì)照組低，尤其轉(zhuǎn)染21天和28天結(jié)果差異 更顯著。
[0021] 圖6為轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b inhibitor后細(xì)胞糖胺多糖分泌量結(jié)果圖，該結(jié)果在 0LYMPUS-IX71顯微鏡下觀察獲得，放大倍數(shù)為40X。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染14天時(shí)糖胺多糖分泌量最多，且隨細(xì)胞肥大化，其分泌量呈遞減趨勢(shì)，28天時(shí)分泌 量最少；與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染microRNA-29b inhibitor組的細(xì)胞糖胺多糖分泌量較多，并 且在14和21天時(shí)尤為顯著。
[0022] 圖7為microRNA-29b抑制劑對(duì)異位軟骨形成的影響結(jié)果圖，該結(jié)果在 0LYMPUS-IX71顯微鏡下觀察獲得，放大倍數(shù)為40X。由圖可以看出，經(jīng)過(guò)番紅0染色可觀 察到microRNA-29b抑制組細(xì)胞周圍是分泌旺盛的蛋白聚糖。
[0023] 圖8為局部注射使用micr〇RNA-29b抑制劑12周后，兔股骨下端髁間窩滑車區(qū) 域的全層軟骨缺損修復(fù)結(jié)果圖，該結(jié)果在0LYMPUS-IX71顯微鏡下觀察獲得，放大倍數(shù)為 40X。經(jīng)HE染色后結(jié)果顯示使用microRNA-29b抑制劑后，軟骨缺損得到了良好的修復(fù)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明所述的"microRNA-2%抑制劑"包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑及阻斷劑 等一切能夠下調(diào)micr 〇RNA-29b表達(dá)水平、降低其活性和穩(wěn)定性、減少其有效作用時(shí)間的 物質(zhì)，它們可以是化合物和化學(xué)小分子，也可以是生物分子；所述的生物分子可以是抑制 micr〇RNA-29b表達(dá)的病毒產(chǎn)品，也可以是核酸水平（包括DNA和RNA)的分子，例如，肽核酸 (PNA)、鎖核酸（LNA)，2-〇me修飾的單鏈核苷酸等。
[0025] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的抑制劑可選自化學(xué)合成的miRNA抑制劑，以 表達(dá)質(zhì)粒為載體的抑制miRNA的病毒和非病毒產(chǎn)品或與micr 〇RNA-29b互補(bǔ)的核酸序列或 序列片段。
[0026] 更佳地，所述的抑制劑是 micr