tcacgaatttgcgtgtcat-3，（SEQ ID NO. 14);
[0060] microRNA-29b 基因上游引物：5，-ggctgggtcttccgattgaatctcc-3'（SEQ ID NO. 15)；
[0061] microRNA-29b 基因下游引物：5' -tccacccttggctgtgctgca-3'（SEQ ID NO. 16);
[0062] 使用All-in-〇ne?qPCR Mix試劑盒配制microRNA-29b cDNA產(chǎn)物熒光實(shí)時(shí)定量 ?〇?反應(yīng)體系：體系包括2父六11-111-0116 9?〇?1^叉1(^1^24]\1的？〇?特異引物？24 1^ 2μΜ特異引物 R 2yL，cDNA 2yL，50XR0X Reference DyeiV 0.4yL，ddH20 3.6yL;反 應(yīng)條件：95°C，IOmin ;95°C，10s，40 次循環(huán)；60°C，20s ;72°C，30s ;78°C，20s。
[0063] 結(jié)果：體外模擬間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨內(nèi)成骨過程，通過離心使間充質(zhì)干細(xì)胞高度凝 集以模擬正常生理過程，通過在培養(yǎng)基中添加 TGF-β 3誘導(dǎo)MSCs向軟骨分化，當(dāng)分化誘導(dǎo) 14天后去除TGF-β 3,添加甲狀腺激素 Τ3,促進(jìn)軟骨細(xì)胞向肥大化軟骨細(xì)胞分化。當(dāng)除去 TGFβ 3,降低地塞米松的濃度，添加 Τ3體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大化時(shí)，結(jié)果顯示Sox9、C〇l II 的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，Runx2、Col X的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（圖2)。并且該過程中， HDAC4也呈現(xiàn)降低表達(dá)。
[0064] 在間充質(zhì)來源肥大化軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)過程中micr〇RNA-29b的表達(dá)逐漸升高，而 HDAC4、Sox9的表達(dá)量逐漸降低，顯示microRNA-29b的表達(dá)量增加是影響細(xì)胞肥大化進(jìn)程 的重要因素，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比microRNA-29b表達(dá)差異顯著（圖3)，HDAC4、Sox9的表達(dá) 與microRNA-29b呈負(fù)相關(guān)（具體關(guān)系見圖1)。由此可知microRNA-29b的表達(dá)增加促進(jìn)了 軟骨細(xì)胞向肥大化軟骨細(xì)胞的分化，提示可通過降低microRNA-29b的表達(dá)來抑制軟骨細(xì) 胞的肥大化進(jìn)程，阻斷MSCs成軟骨分化進(jìn)入后期軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程穩(wěn)定軟骨表型，從而實(shí)現(xiàn) 組織工程軟骨的穩(wěn)定功能性修復(fù)。
[0065] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b抑制劑后可明顯抑制肥大化軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)
[0066] 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：采用Lipofectamin? 2000試劑盒，取正常培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞成細(xì)胞 微團(tuán)培養(yǎng)，前14天使用培養(yǎng)基B (含TGF- β 3完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，從 第15天開始更換為培養(yǎng)基C (肥大化軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基）繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第14天、 第21天、第28天分別取材進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染 microRNA-29b inhibitor，對(duì)照組轉(zhuǎn)染microRNA-29b inhibitor negative control (經(jīng)過 生物信息學(xué)分析表明其與人、小鼠、大鼠的基因組，以及miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中所有miRNA具有 最小的同源性，適用于人、小鼠、大鼠的miRNA實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照），培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。
[0067] 轉(zhuǎn)染試劑制備：
[0068] A 液：在 200 μ L 無(wú) RNA 酶的 EP 管中加入 48 μ L Opti-MEM 和 2 μ L Lipofectamin? 2000,輕柔混勻后室溫孵育5min ;
[0069] B液：在另一 EP管中加入48μ L Opti-MEM和2μ L miRNA，輕輕混勻后室溫孵育 5min ；
[0070] 將A液和B液混勻并室溫孵育20min，以促使轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成；
[0071] 去除原培養(yǎng)團(tuán)中的舊培養(yǎng)基,將A液和B液的混合液加入到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)中，并補(bǔ) 充400 μ L Opti-MEM培養(yǎng)基，24小時(shí)后替換為培養(yǎng)基B (含TGF- β 3完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）， 繼續(xù)培養(yǎng)14天；從第15天開始更換為培養(yǎng)基C (肥大化軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基）。從第10天 開始進(jìn)行第一次轉(zhuǎn)染，以后每5天轉(zhuǎn)染一次。
[0072] 提取樣品總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行肥大化軟骨細(xì)胞相關(guān)基因 mRNA表達(dá)檢測(cè)。II 型膠原（Col II )、X 型膠原（Col X)、Sox9、Runx2 引物如 SEQ ID NO. 1 ?SEQ ID NO. 8 所 示，小鼠來源的FGFR-3、PTHrP、Ihh、MMP-13以及內(nèi)參基因 GAPDH的mRNA序列在NucIeotide 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取，用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物如下：
[0073] FGFR-3 基因上游引物：5，-gaggctacaaggttcgctatg-3，（SEQ ID NO. IT7);
[0074] FGFR-3 基因下游引物：5，-gatgctcccatactcattctcc-3，（SEQ ID NO. 18);
[0075] PTHrP 基因上游引物：5，-gcagatccagatgcactatgag-3'（SEQ ID NO. I9);
[0076] PTHrP 基因下游引物：5，-cggctccaagacttcctaatc-3'（SEQ ID NO. 20);
[0077] Ihh 基因上游引物：5，-ttcaaggacgaggagaacacg-3，（SEQ ID NO. 2I);
[0078] Ihh 基因下游引物：5，-ggtcacccgcagtttcaca-3，（SEQ ID NO. 22);
[0079] MMP-I3 基因上游引物：5，-gatgatgaaacctggacaagc-3'（SEQ ID NO. 23);
[0080] MMP-13 基因下游引物：5，-ccagtgtaggtatagatgggaaac-3，（SEQ ID NO. 24);
[0081] GAPDH 基因上游引物：5，-tacattgccttccgtgttcctacc-3，（SEQ ID NO. 25);
[0082] GAPDH 基因下游引物：5，-agtttgacctcagatgcctgcttc-3，（SEQ ID NO. 26);
[0083] 結(jié)果：間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨分化過程中分別轉(zhuǎn)染microRNA-29b inhibitor 以及對(duì)照microRNA_29b inhibitor negative control，繼而用培養(yǎng)基C培養(yǎng)細(xì)胞，第14 天、第21天和第28天分別收集細(xì)胞，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成肥大化軟骨分化相關(guān)基因 Col X及MMP-13的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b抑制劑后肥大化相關(guān)基因 Col X及MMP-13的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯受到抑制（P〈0. 05)。
[0084] 利用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨肥大化誘導(dǎo)模型，進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) microRNA-29b抑制劑對(duì)肥大化的作用效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制microRNA-29b的表達(dá)可抑 制肥大化軟骨細(xì)胞相關(guān)基因 Col X、Ihh、PTHrP、FGFR-3、MMP-13及Runx2表達(dá)，并可促進(jìn)軟 骨細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白Col II和軟骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Sox9的表達(dá)。Col II蛋白作為軟骨 細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的抵抗外界壓力以及伸張能力起著關(guān)鍵作用。在 軟骨細(xì)胞進(jìn)入肥大化階段，軟骨細(xì)胞去分化喪失分泌其特異性分子標(biāo)志物的能力，Col II蛋 白表達(dá)量降低。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b抑制劑后Col II蛋白的表達(dá)量在誘 導(dǎo)21d和28d時(shí)明顯高于對(duì)照組。在誘導(dǎo)第28d實(shí)驗(yàn)組Col X蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照 組。隨著軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程的進(jìn)行，細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)纖維軟骨表型，纖維軟骨細(xì)胞的特異性 標(biāo)志蛋白Col X蛋白的表達(dá)量逐漸增加 ，Col X蛋白作為肥大化軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成 分為隨后發(fā)生的基質(zhì)礦化提供了主要骨架結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)，抑制microRNA-2%的表達(dá)可抑 制肥大化特異性蛋白mRNA的表達(dá)與此同時(shí)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞特異性蛋白mRNA的表達(dá)。
[0085] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)染micr〇RNA-29b抑制劑后可明顯抑制肥大化軟骨細(xì)胞微團(tuán)X型膠原 的表達(dá)
[0086] 免疫組化染色實(shí)驗(yàn)：
[0087] (1)制片：取轉(zhuǎn)染 microRNA-2% inhibitorl4、2l、28 天的細(xì)胞團(tuán)，0· OlM 的 PBS 清 洗一次后用4%多聚甲醛固定30min，再用PBS清洗3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī) 石蠟包埋，最后切片，切片厚度5 μ m。石蠟切片放入37°C烘箱中過夜，常規(guī)脫蠟至水。
[0088] (2)免疫組化染色：使用免疫組化染色試劑盒進(jìn)行X型膠原免疫組化染色，首先滴 加 3%的H2O2均勻覆蓋組織切片，室溫孵育5min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，然后蒸 餾水沖洗切片，PBS清洗3次，每次5min ;正常山羊血清工作液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加山羊血 清均勻覆蓋切片，室溫孵育20min后直接傾去封閉液后無(wú)需清洗；滴加兔抗小鼠 X型膠原一 抗（抗體與稀釋液按1:200稀