藥物活性成分篩選方法
【專利摘要】一種藥物活性成分的篩選方法，包括：1）初步確定藥物活性成分：1.1）獲取病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)；1.2）獲取待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻；1.3）獲取病理體的全血和/或體液；1.4）建立全指紋圖譜；1.5）將全指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，全指紋圖譜中反差最大的是初步確定的藥物活性成分；反差最大是在最大藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜和最小藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜中色譜峰變化最大的部分；2）獲取初步確定的藥物活性成分；3）檢測(cè)、篩選并確定藥物活性成分。本發(fā)明提供了一種可準(zhǔn)確以及快速地確定中藥中活性成分的藥物活性成分篩選方法。
【專利說(shuō)明】藥物活性成分篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及ー種藥物活性成分的篩選方法，尤其涉及ー種以藥效為導(dǎo)示以微乳為分離介質(zhì)的藥物活性成分篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中醫(yī)藥具有悠久的歷史和顯著的療效，但中藥的基礎(chǔ)性研究比較薄弱，絕大多數(shù)中藥的化學(xué)成分尚未觸及，活性成分研究更是無(wú)從開(kāi)展。其中制約中藥在國(guó)際市場(chǎng)開(kāi)拓和競(jìng)爭(zhēng)的主要原因是缺乏行之有效的中藥活性成分研究方法。現(xiàn)在普遍使用的研究方法是提取中藥單一成分或抽提出某ー餾分，然后進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)確定其活性成分，這種方法的研究層面和深度往往根據(jù)研究者的認(rèn)知而受到局限，也同時(shí)大大降低了成功概率。
[0003]目前對(duì)中藥活性成分篩選的研究策略和假說(shuō)中最有代表性的是全成分論和活性成分論。全成分論認(rèn)為傳統(tǒng)中藥之所以能產(chǎn)生療效是其中所有化學(xué)成分均起作用，若將任何ー種成分去除都違背中醫(yī)的整體觀念。該理論的認(rèn)識(shí)局限干“整體觀念”，使中藥中的活性成分開(kāi)發(fā)思路變窄，活性成分論有兩種觀點(diǎn):①血清藥理學(xué):1988年日本學(xué)者田代真一就提出了血清藥理學(xué)，該理論基于人體研究，并認(rèn)為藥物若起到治療作用必須能進(jìn)入血液，所以這些成分才有可能是真正的活性成分，這一理論大大縮小了尋找中藥活性成分的范圍，但缺乏從含藥血清中確定活性成分的方法；②傳統(tǒng)天然藥物化學(xué)法:即根據(jù)臨床療效有“針對(duì)性”的在體外對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行提取、分離、鑒定，從而得到其活性成分，但由于其不能還原真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境，且局限于人的認(rèn)知范圍，所以得到的活性成分難以實(shí)現(xiàn)原中藥復(fù)方的全部功效，甚至出現(xiàn)藥物作用和主治范圍脫節(jié)，從而引起活性更強(qiáng)的成分被丟失等現(xiàn)象。既往文獻(xiàn)報(bào)道活性成分都是通過(guò)血液運(yùn)送到靶器官的，若中藥復(fù)方能產(chǎn)生明確的療效，可能是其所含的活性成分被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官并與受體結(jié)合產(chǎn)生作用；若一個(gè)有效的中藥復(fù)方用藥后藥效逐漸消失，可能是被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官的活性成分由于代謝導(dǎo)致濃度下降而使藥效消失。
[0004]不難發(fā)現(xiàn)，制約中藥活性成分篩選的具體問(wèn)題如下:①藥物進(jìn)入體內(nèi)后所收集的生物體液樣品大多需經(jīng)過(guò)前處理，而前處理中極有可能顧此失彼:比如親水性化合物和親脂性化合物只能兼顧ー種，酸性化合物、堿性化合物以及中性化合物不能同時(shí)存在于生物體液樣品。②藥物進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)根據(jù)內(nèi)環(huán)境的不同而轉(zhuǎn)變成不同性質(zhì)的物質(zhì)，或酸或堿或中性?，F(xiàn)有技術(shù)造成物質(zhì)分離參數(shù)的種類有限，難以將生物體液樣本中的這些物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)并有效分離，成為中藥活性成分研究的瓶頸問(wèn)題。只有應(yīng)用新方法和新技術(shù)，加強(qiáng)中藥活性成分研究，才能加速中藥現(xiàn)代化步伐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決【背景技術(shù)】中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種可準(zhǔn)確以及快速地確定中藥中活性成分的藥物活性成分篩選方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:本發(fā)明提供了一種藥物活性成分篩選方法，其特殊之處在于:所述方法包括以下步驟:
[0007]I)初歩確定藥物活性成分:
[0008]1.1)獲取病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)；
[0009]1.2)根據(jù)步驟1.1)所得到的病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)獲取待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻；
[0010]1.3)在待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻分別獲取病理體的全血和/或體液；
[0011]1.4)根據(jù)微乳液相色譜法對(duì)步驟1.3)所得到的病理體的全血和/或體液分別建立全指紋圖譜；
[0012]1.5)根據(jù)藥效差示血清色譜法將步驟1.4)所建立得到的全指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，所述全指紋圖譜中反差最大的是初步確定的藥物活性成分；所述反差最大是在最大藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜和最小藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜中色譜峰變化最大的部分；
[0013]2)獲取初步確定的藥物活性成分；
[0014]3)檢測(cè)、篩選并確定藥物活性成分。
[0015]上述步驟1.1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是:
[0016]1.1.1)建立病理體的病理模型；
[0017]1.1.2)對(duì)病理體注射待確定藥物活性成分的藥物；
[0018]1.1.3)根據(jù)常規(guī)檢測(cè)手段檢測(cè)已經(jīng)注射待確定藥物活性成分的藥物的病理體的各項(xiàng)病理學(xué)藥效指標(biāo)。
[0019]上述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是:
[0020]判斷步驟I)所初步確定的藥物活性成分是否是標(biāo)準(zhǔn)品；若是標(biāo)準(zhǔn)品，則直接采用標(biāo)準(zhǔn)品；若否，則采用常規(guī)技術(shù)手段制備步驟I)所初步確定的藥物活性成分。
[0021]上述步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是:
[0022]判斷步驟2)所獲取初步確定的藥物活性成分是否采用標(biāo)準(zhǔn)品，若是，則直接確認(rèn)步驟2)所采用的標(biāo)準(zhǔn)品就是待確定藥物的藥物活性成分；若否，則根據(jù)常規(guī)技術(shù)手段檢測(cè)、篩選并確定待測(cè)藥物的藥物活性成分。
[0023]上述方法在步驟3 )之后還包括:
[0024]4)對(duì)步驟3)所確定的藥物活性成分進(jìn)行驗(yàn)證。
[0025]上述步驟4)的具體實(shí)現(xiàn)方式是:將步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)與對(duì)病理體所注射的藥物的藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則確認(rèn)步驟3)所得到的藥物活性成分是對(duì)病理體所注射藥物的藥物活性成分；若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則重復(fù)步驟I)-步驟3)，直至最終得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的 1/2。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0027]本發(fā)明提供了以藥效為導(dǎo)示以微乳為分離介質(zhì)的藥物活性成分篩選方法，用于捕捉藥物的活性成分，即用血清物質(zhì)譜的最大藥效和最小藥效之差捕捉伴隨著藥效消失而消失的活性成分，同時(shí)最大程度地分離、純化、鑒定出這些活性成分是原方劑中含有的還是機(jī)體的代謝產(chǎn)物。然后采用對(duì)證模型驗(yàn)證，將藥效結(jié)果不斷反饋性調(diào)整差示色譜條件，直至確認(rèn)活性成分。待活性成分確定后，以質(zhì)譜及核磁共振波譜動(dòng)態(tài)進(jìn)行定性、定量中藥體內(nèi)活性成分的變化，并綜合分析相應(yīng)的藥效指標(biāo)，最終確認(rèn)中藥的活性成分。其中，本發(fā)明所采用的藥效差示血清色譜法能夠遵循病證結(jié)合、方證關(guān)聯(lián)、藥與證對(duì)應(yīng)、理法方藥統(tǒng)一的整體研究思路，尤其是能將復(fù)雜問(wèn)題簡(jiǎn)單化，利用現(xiàn)代藥理、藥物分析等多種技術(shù)手段，對(duì)比相應(yīng)機(jī)體血清化學(xué)組分?jǐn)?shù)的變化差并確定活性成分，該方法能夠比較科學(xué)、準(zhǔn)確地篩選中藥中的活性成分。本發(fā)明所采用的微乳液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)恰恰能彌補(bǔ)中藥活性成分篩選中所存在的瓶頸問(wèn)題，其具體優(yōu)點(diǎn)如下:①.微乳可溶解蛋白，所以用微乳做流動(dòng)相時(shí)可以實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)樣分析生物體液樣品。生物體液樣本不僅真實(shí)再現(xiàn)了體內(nèi)環(huán)境，而且包括了所有的活性成分。所以，以微乳為分離介質(zhì)的流動(dòng)相就為中藥活性成分篩選三大難點(diǎn)之一:實(shí)現(xiàn)生物體液樣本直接進(jìn)樣提供了理論支持。②.從微乳的微觀結(jié)構(gòu)來(lái)看，微乳液滴具有類生物膜的有序親水區(qū)和疏水區(qū)結(jié)構(gòu)，所以對(duì)對(duì)親水性和親脂性化合物均有較強(qiáng)的溶解能力。這就使微乳液相色譜法同時(shí)測(cè)定親水性和親脂性化合物變成了可能。③.在微乳流動(dòng)相中，溶質(zhì)與微乳液滴及固定相吸附層之間存在著疏水、氫鍵、靜電等多種作用力，所以可調(diào)控參數(shù)較多，適用于中藥中復(fù)雜混合物的分離。這就為中藥活性成分篩選三大難點(diǎn)之一:藥物活性成分能夠同時(shí)達(dá)到有效分離提供了理論支持。微乳液相色譜法已在各種領(lǐng)域進(jìn)行了推廣使用。比如:申報(bào)新藥中穩(wěn)定性考察是一項(xiàng)重要內(nèi)容，所建立方法必須能將合成的或者降解的雜質(zhì)從主成分峰和輔料峰中分開(kāi)且分離良好。而微乳液相色譜法以獨(dú)特的分離選擇性和廣泛的適用性在穩(wěn)定性考察中得到廣泛應(yīng)用，展現(xiàn)了微乳液相色譜法在穩(wěn)定性研究中的極高潛力。
[0028]為了驗(yàn)證本發(fā)明所提供方法的可行性及科學(xué)性，前期采用藥效差示血清色譜法成功確定了紅花、丹參等代表性單味活血化瘀藥材中改善血液流變學(xué)的活性成分。本發(fā)明將活性成分篩選單純的應(yīng)用于任何一種理論均難以實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有研究的突破，而應(yīng)將藥物分析與藥效學(xué)研究“整合”起來(lái)。將藥物分析與藥效學(xué)有機(jī)整合，首創(chuàng)了以藥效指標(biāo)為導(dǎo)示來(lái)確定中藥活性成分的藥效差示血清色譜法。本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)生物體液樣品直接分析，并做到了盡可能還原活性成分所存在的內(nèi)環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明提供了一種藥物活性成分篩選方法，該方法包括以下步驟:
[0030]I)初步確定藥物活性成分:
[0031]1.1)獲取病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo):
[0032]1.1.1)建立病理體的病理模型；
[0033]1.1.2)對(duì)病理體注射待確定藥物活性成分的藥物；
[0034]1.1.3)根據(jù)常規(guī)檢測(cè)手段檢測(cè)已經(jīng)注射待確定藥物活性成分的藥物的病理體的各項(xiàng)病理學(xué)藥效指標(biāo)。
[0035]1.2)根據(jù)步驟1.1)所得到的病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)獲取待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻；
[0036]1.3)在待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻分別獲取病理體的全血和/或體液；[0037]1.4)根據(jù)微乳液相色譜法對(duì)步驟1.3)所得到的病理體的全血和/或體液分別建立全指紋圖譜；
[0038]1.5)根據(jù)藥效差示血清色譜法將步驟1.4)所建立得到的全指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，全指紋圖譜中反差最大的是初步確定的藥物活性成分；反差最大是在最大藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜和最小藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜中色譜峰變化最大的部分。
[0039]2)獲取初步確定的藥物活性成分:
[0040]判斷步驟I)所初步確定的藥物活性成分是否是標(biāo)準(zhǔn)品；若是標(biāo)準(zhǔn)品，則直接采用標(biāo)準(zhǔn)品；若否，則采用常規(guī)技術(shù)手段制備步驟I)所初步確定的藥物活性成分。
[0041]3)檢測(cè)、篩選并確定藥物活性成分:
[0042]判斷步驟2)所獲取初步確定的藥物活性成分是否采用標(biāo)準(zhǔn)品，若是，則直接確認(rèn)步驟2)所采用的標(biāo)準(zhǔn)品就是待確定藥物的藥物活性成分；若否，則根據(jù)常規(guī)技術(shù)手段檢測(cè)、篩選并確定待測(cè)藥物的藥物活性成分。
[0043]本發(fā)明所提供的方法在步驟3)之后還包括:
[0044]4)對(duì)步驟3)所確定的藥物活性成分進(jìn)行驗(yàn)證:
[0045]將步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)與對(duì)病理體所注射的藥物的藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則確認(rèn)步驟3)所得到的藥物活性成分是對(duì)病理體所注射藥物的藥物活性成分；若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則重復(fù)步驟I)-步驟3)，直至最終得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2。
[0046]本發(fā)明的理論基礎(chǔ)是:中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵點(diǎn)是難以明確其中的活性成分，從而不能進(jìn)ー步探討中藥的作用機(jī)制和代謝途徑。闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，篩選活性成分，缺少的是行之有效的研究技木。目前，建立中藥活性成分篩選關(guān)鍵技術(shù)的難點(diǎn)在于以下三點(diǎn):①實(shí)現(xiàn)生物體液樣本直接進(jìn)樣，以確保含有全部藥物活性成分；②藥物活性成分能夠同時(shí)達(dá)到有效分離確定藥物中的活性成分。
[0047]針對(duì)以上難點(diǎn)，本發(fā)明首次提出一種全新的研究方法一一藥效差示血清色譜法。當(dāng)中藥在對(duì)證機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生藥效學(xué)變化吋，機(jī)體血清中化學(xué)組份數(shù)相應(yīng)的變化差中將最小范圍而最大程度的包含著真正的活性成分?；谶@種研究方法，成功確定了紅花、丹參、等代表性活血化瘀單味藥材中改善血液流變學(xué)的活性成分。研究結(jié)果表明:藥效差示血清色譜法可解決中藥活性成分篩選三大難點(diǎn)之一:確定藥物中的活性成分。
[0048]以紅花以及丹參為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:紅花中的主要活性成分為羥基紅花黃色素A，丹參中主要活性成分為丹酚酸B。對(duì)丹紅注射液進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn):按照丹紅注射液組方配比組合羥基紅花黃色素A和丹酚酸B時(shí)，化藥組合組的療效并不及丹紅注射液組(見(jiàn)表I)。這提示丹紅注射液中還有其他活性成分，這些活性成分可能是丹參和紅花中已經(jīng)含有的，或者丹參和紅花組合在一起發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的新物質(zhì)甚至是機(jī)體的代謝產(chǎn)物。這些活性成分未能被檢測(cè)出的原因可能有以下兩點(diǎn):①樣品的前處理步驟中將活性成分丟失。雖然現(xiàn)有方法已盡可能的簡(jiǎn)化前處理，但由于缺乏關(guān)鍵技術(shù)仍難以實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)樣分析生物體液樣品的目標(biāo)，活性成分可能在前處理中已經(jīng)丟失。②現(xiàn)有篩選技術(shù)尚不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)復(fù)雜混合物的有效分離。中藥中成分復(fù)雜，親水性、親脂性化合物同時(shí)存在，現(xiàn)有篩選技術(shù)不具備既親水又親脂的溶解能力；中藥中存在酸性、堿性以及中性等多種性質(zhì)的化合物，現(xiàn)有篩選技術(shù)不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)有效分離。
[0049]表I活性成分組對(duì)血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響(? ±.5，η=8)
【權(quán)利要求】
1.一種藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 1)初步確定藥物活性成分: 1.1)獲取病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)； 1.2)根據(jù)步驟1.1)所得到的病理體的病理學(xué)藥效指標(biāo)獲取待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻； 1.3)在待確定藥物活性成分的藥物的最大藥效點(diǎn)的時(shí)刻以及最小藥效點(diǎn)的時(shí)刻分別獲取病理體的全血和/或體液； 1.4)根據(jù)微乳液相色譜法對(duì)步驟1.3)所得到的病理體的全血和/或體液分別建立全指紋圖譜； 1.5)根據(jù)藥效差示血清色譜法將步驟1.4)所建立得到的全指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，所述全指紋圖譜中反差最大的是初步確定的藥物活性成分；所述反差最大是在最大藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜和最小藥效時(shí)間點(diǎn)的全指紋圖譜中色譜峰變化最大的部分； 2)獲取初步確定的藥物活性成分； 3)檢測(cè)、篩選并確定藥物活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述步驟1.1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是: 1.1.0建立病理體的病理模型； 1.1.2)對(duì)病理體注射待確定藥物活性成分的藥物； 1.1.3)根據(jù)常規(guī)檢測(cè)手段檢測(cè)已經(jīng)注射待確定藥物活性成分的藥物的病理體的各項(xiàng)病理學(xué)藥效指標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是: 判斷步驟I)所初步確定的藥物活性成分是否是標(biāo)準(zhǔn)品；若是標(biāo)準(zhǔn)品，則直接采用標(biāo)準(zhǔn)品；若否，則采用常規(guī)技術(shù)手段制備步驟I)所初步確定的藥物活性成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是: 判斷步驟2)所獲取初步確定的藥物活性成分是否采用標(biāo)準(zhǔn)品，若是，則直接確認(rèn)步驟2)所采用的標(biāo)準(zhǔn)品就是待確定藥物的藥物活性成分；若否，則根據(jù)常規(guī)技術(shù)手段檢測(cè)、篩選并確定待測(cè)藥物的藥物活性成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述方法在步驟3)之后還包括: 4)對(duì)步驟3)所確定的藥物活性成分進(jìn)行驗(yàn)證。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述步驟4)的具體實(shí)現(xiàn)方式是:將步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)與對(duì)病理體所注射的藥物的藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則確認(rèn)步驟3)所得到的藥物活性成分是對(duì)病理體所注射藥物的藥物活性成分；若步驟3)所確定得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2，則重復(fù)步驟I)-步驟3)，直至最終得到的藥物活性成分的藥效學(xué)指標(biāo)不低于對(duì)病理體所注射藥物的藥效學(xué)指標(biāo)的1/2。
【文檔編號(hào)】G01N30/34GK103439425SQ201310382294
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】王超, 文愛(ài)東, 吳寅, 賈艷艷, 肖茜, 楊志福, 楊靜, 趙超, 李玉文, 賈娜, 李銳莉, 張維, 曹珊珊, 王璐, 崔佳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)