一種在體外篩選藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種在體外篩選藥物的方法，該方法包括如下步驟：（a）將急性分離的動物心臟置于傳感器上并分別施用候選藥物；（b）通過所述傳感器測定心臟的動作電位的變化；（c）比較心臟的動作電位的變化，依據動作電位的變化選擇候選藥物；其中，所述傳感器包括傳感元件和參比電極，所述傳感元件包括基板以及固定于該基板上的源電極和漏電極，且源電極和漏電極之間電連接有石墨烯膜，石墨烯膜與基板之間具有空腔。通過上述技術方案，本發(fā)明大幅度地提高了傳感器中的石墨烯的電導率，并進而提高了體外篩選藥物的效率。
【專利說明】一種在體外篩選藥物的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物儀器工程領域，具體地，涉及一種在體外篩選藥物的方法。

【背景技術】
[0002]場效應晶體管是一種通過電場效應控制電流的電子元件，具有柵極(gate)，源極(source)和漏極(drain)三個端子，通過施加于柵極的電壓所產生的電場來控制連接源極和漏極的溝道中流通的電流大小。傳統(tǒng)場效應晶體管的溝道由重摻雜的硅構成。
[0003]隨著納米科技的發(fā)展，各種新型的低維納米材料，例如硅納米線(SiNW)，碳納米管(CNT),石墨烯(graphene)等，以其獨特的性質(表面效應,體積效應和量子尺寸效應等)引起了人們廣泛的關注。和傳統(tǒng)材料相比，納米材料具有更小的尺寸，更高的比表面積，更加優(yōu)良的電學性質，更好的生物相容性等。當傳統(tǒng)場效應晶體管的溝道由納米材料來替代，即構成了納米材料場效應晶體管，例如硅納米線場效應晶體管(SiNW-場效應晶體管)，碳納米管場效應晶體管(CNT-場效應晶體管)，石墨烯場效應晶體管(Gra-場效應晶體管)等。
[0004]石墨烯是一種新興的碳納米材料，具有電導率高、機械強度大，電化學穩(wěn)定等優(yōu)異的物理化學性能，使其在高靈敏度檢測領域具有獨特的應用優(yōu)勢，引起了人們極大的關注。石墨烯是單層原子構成的平面二維晶體，每個原子都在表面上，外界環(huán)境的變化都將直接影響構成石墨烯的所有碳原子，使其對界面的響應極其靈敏，同時獨特的結構使其具有出色的檢測靈敏性。目前已開發(fā)的基于石墨烯的高靈敏一氧化氮(NO)氣體檢測芯片，具有單個NO分子的高探測靈敏度，表明石墨烯作為檢測芯片敏感元件具有巨大的潛力。
[0005]每個原子都在表面上這一特性雖然賦予了石墨烯對外界環(huán)境的變化的高檢測靈敏性，但常規(guī)傳感器制作方法中需將石墨烯轉移到起支撐作用的基底材料上，不可避免的造成基底材料對石墨烯的摻雜，降低了石墨烯中載流子的遷移率，嚴重影響了傳感器的檢測靈敏度。如果將傳感器用于體外篩選藥物，則會由于較低的檢測靈敏度導致體外篩選藥物的效率較低。


【發(fā)明內容】

[0006]為了進一步提高體外篩選藥物的效率，本發(fā)明提供了一種在體外篩選藥物的方法。
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將石墨烯脫離基底、制成成懸空狀的石墨烯傳感元件，能夠使其避免與基底材料的緊密接觸而被摻雜，能夠進一步提高傳感器的靈敏度，并進而能夠提高體外篩選藥物的效率，由此得到了本發(fā)明。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種在體外篩選藥物的方法，該方法包括如下步驟:(a)將急性分離的動物心臟置于傳感器上并分別施用候選藥物；(b)通過所述傳感器測定心臟的動作電位的變化；(C)比較心臟的動作電位的變化，依據動作電位的變化選擇候選藥物；其中，所述傳感器包括傳感元件和參比電極，所述傳感元件包括基板以及固定于該基板上的源電極和漏電極，且源電極和漏電極之間電連接有石墨烯膜，石墨烯膜與基板之間具有空腔。
[0009]通過上述技術方案，本發(fā)明大幅度地提高了傳感器中的石墨烯的電導率，并進而提高了體外篩選藥物的效率。
[0010]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0012]圖1是在基板上附著石墨烯膜過程的示意圖。
[0013]圖2是在形成本發(fā)明的傳感元件的過程的示意圖。
[0014]圖3是附著了石墨烯膜的基板的示意圖。
[0015]圖4是用光刻膠掩蔽了的基板的不意圖。
[0016]圖5是曝光顯影后的基板的示意圖，顯示了形成電極的區(qū)域。
[0017]圖6是形成了電極的基板的示意圖。
[0018]圖7是去除了光刻膠的基板的示意圖。
[0019]圖8是設置了儲液池并在儲液池中注入了液體的示意圖。
[0020]圖9是在儲液池中用氫氟酸進行了適當?shù)奈g刻之后的基板的示意圖。
[0021]圖10是去除了儲液池和儲液池中的液體后，本發(fā)明的傳感元件的示意圖。
[0022]圖11是帶有儲液池的本發(fā)明的傳感元件的示意圖。
[0023]圖12是傳感元件的掃描電鏡照片。
[0024]圖13是傳感器的示意圖。
[0025]圖14是用氫氟酸進行蝕刻前后傳感元件電導率G隨參比電極電壓Vgate的變化關系結果圖。
[0026]圖15是傳感元件中的電流隨著液體樣本的pH值不同而改變的關系結果圖。
[0027]圖16是傳感元件在測量細胞膜電位中的應用的示意圖。
[0028]圖17是傳感元件與被測量細胞或心臟的生物膜形成緊密接觸的示意圖。
[0029]圖18a是傳感器在測量小鼠心臟動作電位中的應用的示例性照片。
[0030]圖18b是小鼠心臟置于傳感器表面的示例性照片。
[0031]圖19是用氫氟酸進行蝕刻前后傳感元件檢測到的小鼠心臟動作電位變化的結果圖。
[0032]圖20是給予鹽酸異丙腎上腺素后傳感器測量到的小鼠心臟動作電位發(fā)放頻率變化中的應用示例。
[0033]附圖標記說明
[0034]I石墨烯膜2基板的面層3基板的基層
[0035]4光刻膠5形成源電極的區(qū)域
[0036]6形成漏電極的區(qū)域7源電極8漏電極
[0037]9形成儲液池的側壁10空腔

【具體實施方式】
[0038]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0039]本發(fā)明提供了一種在體外篩選藥物的方法，該方法包括如下步驟:(a)將多個急性分離的動物心臟各自置于傳感器上并分別施用候選藥物；(b)通過所述傳感器測定心臟的動作電位的變化；(C)比較心臟的動作電位的變化，依據動作電位的變化選擇候選藥物；其中，所述傳感器包括傳感元件和參比電極，所述傳感元件包括基板以及固定于該基板上的源電極和漏電極，且源電極和漏電極之間電連接有石墨烯膜，石墨烯膜與基板之間具有空腔。
[0040]其中，所述傳感元件可以作為場效應管化學生物傳感器的元件。
[0041]優(yōu)選情況下，所述傳感元件通過包括如下步驟的方法制得:(1)在基板上附著石墨烯膜；(2)在附著了石墨烯膜的基板上形成電極，所述電極包括源電極和漏電極，且在源電極和石墨烯膜之間以及在漏電極和石墨烯膜之間形成電連接；(3)使石墨烯膜下的基板的表面變低，以使石墨烯膜下的基板的表面與石墨烯膜分離，形成空腔；且使源電極和漏電極固定在基板上。
[0042]其中，所述石墨烯膜可以為各種常規(guī)使用的石墨烯膜，例如為通過化學氣相沉淀的方法得到的石墨烯膜，也可以為通過機械剝離的方法得到的石墨烯膜。
[0043]其中，在基板上附著石墨烯膜的操作可以通過將石墨烯膜在基板上按壓的方式實現(xiàn)。
[0044]其中，優(yōu)選情況下，參照文獻(LiXS, Cai ffff, An JH, et al.Large-areasynthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils.Science, 2009, 324:1312 - 1314)的方法，在銅基底上通過化學氣相沉淀的方法生長石墨烯；然后在生長有石墨烯的銅基底上涂覆一層光刻膠；再將將涂覆有光刻膠且生長有石墨烯的銅基底與銅刻蝕液(例如三氯化鐵和鹽酸的混合溶液)中刻蝕；刻蝕完全后，將剩下的附著有石墨烯的光刻膠貼附于基板上并按壓；然后溶解除去光刻膠，保留石墨烯膜在基板上，即得到附著有石墨烯膜的基板。
[0045]其中，可以基于干涉效應在光學顯微鏡下對基板上的石墨烯膜進行定位并標記其邊界，還可以利用拉曼光譜對其層數(shù)進行進一步鑒定。
[0046]根據本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)選情況下，步驟(I)中，基板包括基層和附著在基層上的面層，且將石墨烯膜附著在基板的面層上；基層為硅片，面層為二氧化硅層。在該優(yōu)選情況下，基板可以直接通過將硅片進行氧化的方式制備，還易于進行基于干涉效應在光學顯微鏡下對基板上的石墨烯膜進行定位并標記其邊界，并且面層可以直接通過二氧化硅蝕刻液(如氫氟酸)的蝕刻而形成空腔。
[0047]根據本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)選情況下，步驟(2)中，在基板上形成源電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；在基板上形成源電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；源電極和漏電極之間的距離為500-5000nm，優(yōu)選為 750_4000nm，更優(yōu)選為 1000_3000nm。
[0048]其中，優(yōu)選情況下，在基板上形成電極的基板區(qū)域中，被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域的面積比為0.3-1.7:1，優(yōu)選為0.5-1.5:1，更優(yōu)選為0.8-1.2:1。
[0049]其中，在基板上，被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域可以通過光學顯微鏡觀察來確定其邊界并定位。在石墨烯膜覆蓋的區(qū)域的邊界處可以選擇包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域作為在基板上形成源電極的基板區(qū)域。選定在基板上形成電極的基板區(qū)域后，可以通過常規(guī)的光蝕刻的方式暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域，然后通過熱蒸鍍或離子束蒸鍍來形成電極。還可以在形成電極后去除掩蔽物。其中，源電極和漏電極可以為場效應化學生物傳感器領域中常規(guī)使用的電極，例如可以為通過熱蒸鍍或離子束蒸鍍得到的金屬電極，金屬電極的材料可以為鉬、金和鉻中的至少一種，電極的厚度可以為0.03 μ m-0.15 μ m。源電極和漏電極與基板之間設置有用于固定的連接。例如通過熱蒸鍍或離子束蒸鍍得到的金屬電極，由于形成電極的區(qū)域包括了被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域，一方面被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與石墨烯膜之間的電鏈接，另一方面未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與基板之間用于固定的連接。
[0050]根據本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)選情況下，步驟(3)中，通過將二氧化硅蝕刻液與基板接觸的方式使得石墨烯膜下的基板的表面變低，且二氧化硅蝕刻液與基板接觸的條件使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕。其中，二氧化硅蝕刻液為濃度21-22重量％的氫氟酸。其中，可以使用耐二氧化硅蝕刻液的惰性材料(如聚二甲基硅氧烷，PDMS)在基板上形成儲液池，以容納二氧化硅蝕刻液。該儲液池還可以用于容納洗滌液，以中止二氧化硅蝕刻液的作用，或者洗滌殘留的二氧化硅蝕刻液。
[0051]根據本發(fā)明的方法，其中，作為一種非常優(yōu)選的實施方式，步驟(I)中，基板包括基層和附著在基層上的面層，且將石墨烯膜附著在基板的面層上；基層為硅片，面層為二氧化硅層，且厚度為275-300nm并且大于空腔的高度；步驟(2)中，在基板上形成源電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；在基板上形成源電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；源電極和漏電極之間的距離為500-5000nm，優(yōu)選為750-4000nm，更優(yōu)選為1000-3000nm ;通過蒸鍍的方式，在待形成源電極的基板區(qū)域上形成電極；步驟(3)中，通過將二氧化硅蝕刻液與基板接觸的方式使得石墨烯膜下的基板的表面變低，且二氧化硅蝕刻液與基板接觸的條件使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕；二氧化硅蝕刻液為濃度21-22重量％的氫氟酸；通過控制氫氟酸與基板接觸的時間，使得空腔的底面積為石墨烯膜的面積的70-99%，優(yōu)選為75-95%，更優(yōu)選為80-90%，并且使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕。通常情況下，可以用濃度21-22重量％的氫氟酸浸泡石墨烯膜1-10分鐘，氫氟酸滲入石墨烯膜下并蝕刻二氧化硅形成空腔。石墨烯膜部分懸浮在基板上方。
[0052]其中，所述基板可以為傳感儀器領域中的常規(guī)使用的各種電性絕緣材料的基板，例如具有熱氧化S12層的硅基板、二氧化硅基板、氮化硅基板、碳化硅基板、硅酸鹽玻璃基板、云母基板及有機高分子基板中的至少一種。其中，基板的大小、厚度和形狀也可以為常規(guī)的選擇。例如，基板可以長4-7cm,寬3-6cm,厚0.1-0.3cm的方片形基板。
[0053]其中，所述石墨烯膜可以為各種常規(guī)使用的石墨烯膜，例如為通過化學氣相沉淀的方法得到的石墨烯膜，也可以為通過機械剝離的方法得到的石墨烯膜。
[0054]根據本發(fā)明的方法，其中，空腔的高度可以為100-280nm，優(yōu)選為120_260nm，更優(yōu)選為140-240nm。其中，本發(fā)明中，空腔的高度是指石墨烯膜與基板之間的距離。
[0055]根據本發(fā)明的方法，其中，空腔的底面積可以為石墨烯膜的面積的70-99%，優(yōu)選為75-95%，更優(yōu)選為80-90%。其中，空腔的底面積是指空腔在與石墨烯膜表面平行的平面上的投影面積。
[0056]其中，源電極和漏電極之間的距離可以為500-5000nm，優(yōu)選為750_4000nm，更優(yōu)選為1000-3000nm。其中，源電極和漏電極之間的距離是指相鄰的源電極和漏電極之間最接近的兩點之間的距離。其中，源電極和漏電極可以為場效應化學生物傳感器領域中常規(guī)使用的電極，例如可以為通過熱蒸鍍或離子束蒸鍍得到的金屬電極，金屬電極的材料可以為鉬、金和鉻中的至少一種，電極的厚度可以為30nm-150nm。源電極和漏電極與基板之間設置有用于固定的連接。
[0057]根據本發(fā)明的方法，其中，急性分離的動物心臟可以具有竇房結，可以在體外維持搏動。例如，可以參照文獻(Dhein S，Mohr Fff, Delmar M.Practical Methods inCard1vascular Research.Springer:New York, 2005, 424一445.)中的方法急性分離動物心臟。所述動物可以為常規(guī)的實驗動物，如兩棲動物、鳥類或哺乳動物；包括但不限于蟾蜍、雞、小鼠、大鼠、犬、兔和猴。
[0058]根據本發(fā)明的方法，其中，源電極和漏電極之間的電壓可以為10_70mV，優(yōu)選為30-60mV。
[0059]根據本發(fā)明的方法，其中，可以使用參考藥物進行校準。如果動作電位的峰值和/或頻率在施用候選藥物前后的變化大，則指示候選藥物具有較強的藥效；如果動作電位的峰值和/或頻率在施用候選藥物前后的變化小，則指示候選藥物有較弱的藥效。依據動作電位的變化選擇候選藥物可以參照本領域常規(guī)的方法進行，例如文獻(C ο h e ηY,Lindenbaum A, Midol-Monnet P,Porquet D, Wepierre J.Beta—adrenoceptor blockingdrugs and isoprenaline: central effects on card1vascular parameters.Br JPharmacol, 1979，65:389 - 394)中提到的方法。
[0060]以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明。以下實施例中，掃描電子顯微鏡購自日本日立公司型號S-4800。電學性質的測試儀為購自美國AXON公司型號Axopatch200B電學測試系統(tǒng)。所用試劑均為商購的分析純試劑。
[0061]制備實施例1
[0062]參考圖1-11，本實施例用來說明根據本發(fā)明的方法中制備傳感元件的步驟，即制備懸浮石墨烯場效應器件的步驟。
[0063](I)參考圖 1，按照文獻(Li X S，Cai W W，An J H, et al.Large-areasynthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils.Science, 2009, 324:1312 - 1314)中的方法通過化學氣相沉淀的方法在銅基底(大小為4cmX8cm,厚度為100 μ m)上生長石墨稀。在有石墨稀的銅片上旋涂一層300nm厚的光刻膠(PMMA950K，購自德國ALLRESIST公司)，120°C下烘烤使溶劑完全揮發(fā)；將旋涂有光刻膠的銅片放入銅刻蝕液(含lmol/L三氯化鐵和lmol/L鹽酸的溶液)中刻蝕至銅反應完全；得到附著在光刻膠上的石墨烯膜。
[0064](2)參考圖3，將具有280nm熱氧化S12的硅片(大小為3cmX 3cm，厚度為0.52cm，購自美國sillicon Valley Microelectrics)作為基板，即基層為娃片，面層為二氧化娃層的基板。將附著在光刻膠上的石墨烯膜轉移到基板上，并按壓使石墨烯膜與基板緊密接觸；然后通過光刻膠溶解液(丙酮)將石墨烯膜表面的光刻膠溶解掉，保留石墨烯膜在基板上，得到附著有石墨烯膜的基板?；诟缮嫘诠鈱W顯微鏡下予以定位并標記邊界，以用于確定形成電極的區(qū)域。
[0065](3)參考圖4和圖5，在附著有石墨烯膜的基板上形成源電極和漏電極。具體地，在附著有石墨烯膜的基板表面旋凃一層300nm厚的光刻膠(PMMA950K，購自德國ALLRESIST公司)，180°C下烘烤至溶劑揮發(fā)完全。根據光學顯微鏡下標記的石墨烯膜的邊界，確定形成電極的區(qū)域，形成電極(寬度為2μπι的條形電極)的區(qū)域中被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域的面積比為1:1，用電子束曝光機對形成電極的區(qū)域進行曝光，在顯影液(4-甲基-2-戊酮和異丙醇按1:5的體積比混合的混合液)中顯影l(fā)Omin，異丙醇中定影1min后用氮氣吹干；由此暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域。
[0066]參考圖6，在高真空條件下，按照文獻(《薄膜制備技術基礎》，麻蒔立男(日本)著，陳國榮譯，化學工業(yè)出版社，2009)中的方法，利用電子束蒸鍍機在樣品(即暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域的基板)上依次蒸鍍5nm厚的Cr和50nm厚Au,獲得電極，分別作為源電極和漏電極待用。
[0067]參考圖7，去除蒸鍍好電極的樣品上的光刻膠，被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與石墨烯膜之間的電鏈接，未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與基板之間用于固定的連接，源電極和漏電極之間的距離為2000nm。
[0068](4)參考圖8-11，在形成了電極的基板上，以設置有石墨烯膜和電極的基板面為底面，用PDMS圍成側壁以形成儲液池(大小為1.5cmX 1.5cm，深度為0.8cm),以使當該儲液池封存液體時，石墨烯膜完全浸泡于液體中。在儲液池中加入二氧化硅蝕刻液(濃度22重量％的氫氟酸)，浸泡石墨烯膜5min，氫氟酸滲入石墨烯膜下并蝕刻二氧化硅形成空腔。在光學顯微鏡觀察測得空腔的底面積為石墨烯膜的面積的90%。
[0069]結構基本上如圖10所示的元件即為本實施例制備的傳感元件。利用掃描電鏡觀察其微觀結構，如圖12所示:虛線方框內為石墨烯(Graphene)，兩側為源漏電極，材料為鉻金(Cr/Au)。可見石墨烯在兩側鉻金電極的支撐下呈懸空狀，離開基底約200nm的距離。
[0070]對比例I
[0071]按照實施例1的方法制備傳感元件，不同的是，不使用二氧化硅蝕刻液進行蝕刻，即得到不具有空腔的傳感元件。
[0072]測試實施例1
[0073]本實施例用來說明傳感元件(S卩，懸浮石墨烯場效應器件)的電學性能。
[0074]參考圖13，使用制備實施例1制備的傳感元件，將石墨烯兩端的兩個Cr/Au電極分別作為源極和漏極，Ag/AgCl電極作為參比電極(即，溶液柵電極(Vgate))，從而組裝成為傳感器。
[0075]將漏極接地，在源極上加固定的電壓Vsd (0.01-0.1V)，測量源極和漏極之間的電導G隨柵極電壓Vgate的變化關系，以表征石墨烯的電子輸運性質。如圖14所示:未懸浮石墨烯的傳感元件(即對比例I的傳感元件)中，G-Vg曲線的空穴支和電子支明顯不對稱，狄拉克點相對本征的石墨烯在Vgate軸上出現(xiàn)了平移,表明石墨烯受到其貼覆的Si/Si02基底的摻雜影響；石墨烯懸浮的傳感元件(即實施例1的傳感元件)中，測得其G-Vg (是一條關于縱軸對稱的曲線，對稱軸過狄拉克點，近似于本證石墨烯的G-Vg曲線，電導相對于懸浮如有很大的提聞。
[0076]測試實施例2
[0077]本實施例用來說明傳感元件(S卩，懸浮石墨烯場效應器件)的電學性能和在測量溶液中化學物質的變化中的應用。
[0078]參考圖13，使用制備實施例1制備的傳感元件，將石墨烯兩端的兩個Cr/Au電極分別作為源極和漏極，Ag/AgCl電極作為參比電極(即，溶液柵電極(Vgate))，從而組裝成為傳感器。
[0079]通過溶液中的參比電極Ag/AgCl施加電壓，同時在源極和漏極(Cr/Au電極)之間施加恒定的通道電壓。向儲液池中加入樣本溶液，樣本溶液中帶電離子濃度及種類的變化會通過改變石墨烯表面的電荷濃度，從而改變了石墨烯場效應管的電流。通過檢測石墨烯電流的變化，可以檢測到溶液中化學物質的變化。
[0080]基于上述檢測原理，將懸浮石墨烯場效應器件用于檢測溶液pH的變化。向儲液池中依此加入不同pH值(pH分別為6、7、8和9)的pH值校準液(購自美國Sigma公司)，由于不同PH值的待測樣本溶液中帶電離子濃度及種類的變化會改變石墨烯膜表面的電荷濃度，進而改變了石墨烯場效應管的電流。如圖15所示，檢測到石墨烯場效應管的電導值發(fā)生相應的變化，反應極為迅速且靈敏，不同PH值間變化呈階梯狀。
[0081]實施例1
[0082]如圖16所示，通過在石墨烯兩端的源極和漏極之間施加恒定的通道電壓，在此電壓下石墨烯納米帶中產生一個恒定的電流。細胞或組織與器件中石墨烯形成緊密接觸后，當細胞的膜電位發(fā)生變化時，這個微小的電壓對通過鉻金電極施加在石墨烯上的電勢產生影響，進而使流過石墨烯的電流產生相應的變化，通過檢測這一電流變化進而實現(xiàn)對細胞膜上的動作電位變化的測量。
[0083]基于上述檢測原理，如圖16所示，將懸浮石墨烯場效應器件(即實施例1的傳感元件)用于檢測心肌細胞膜電位的變化。參照文獻(Dhein S，Mohr Fff, Delmar M.PracticalMethods in Card1vascular Research.Springer:New York, 2005, 424-445)中的方法，急性分離的小鼠心臟具有竇房結，能夠維持搏動。參考圖18，將急性分離的小鼠心臟置于懸浮石墨烯場效應器件儲液池中(儲液池中具有臺式液Tyrode’s Salts Solut1n)。如圖19所不，當小鼠心臟與石墨稀器件形成接觸后，隨著小鼠心臟的搏動，石墨稀場效應管能夠記錄到對應的小鼠心臟的動作電位變化，相對于石墨烯未懸浮的傳感元件(即對比例I的傳感元件)，懸浮后檢測到的信號幅度大大提升，證明了懸浮石墨烯場效應傳感器具有很高的檢測靈敏度。
[0084]鹽酸異丙腎上腺素是臨床上常用強心類藥物，能夠加快心率。將鹽酸異丙腎上腺素作為參考藥物，以10μ g/mL的濃度(濃度為儲液池中的終濃度)施用于小鼠心臟上，得到小鼠心臟的動作電位發(fā)放頻率的變化。結果如圖20所示，相對于離體小鼠心臟正常的動作電位信號(圖20，對照組)，通過灌流系統(tǒng)將含有10μ g/ml異丙腎上腺素的灌流液加入儲液池中，作用5min后，可檢測到離體心臟的動作電位信號發(fā)放明顯加快。與異丙腎上腺素加快心率的臨床應用效果相一致，證明了懸浮石墨烯場效應傳感器能夠用于體外篩選藥物。
[0085]對比例2
[0086]使用實施例1的方法測定小鼠心臟的動作電位變化，不同的是石墨烯場效應器件為對比例I的不具有空腔的傳感元件。結果如圖19所示。
[0087]根據實施例1和對比例2的結果的比較，可以看出，本發(fā)明大幅度地提高了傳感器中的石墨烯的電導率，并進而提高了體外篩選藥物的效率。
[0088]以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0089]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0090]此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。
【權利要求】
1.一種在體外篩選藥物的方法，該方法包括如下步驟: Ca)將急性分離的動物心臟置于傳感器上并分別施用候選藥物； (b)通過所述傳感器測定心臟的動作電位的變化； (C)比較心臟的動作電位的變化，依據動作電位的變化選擇候選藥物； 其中，所述傳感器包括傳感元件和參比電極，所述傳感元件包括基板以及固定于該基板上的源電極和漏電極，且源電極和漏電極之間電連接有石墨烯膜，石墨烯膜與基板之間具有空腔。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，空腔的高度為100-280nm，優(yōu)選為120_260nm，更優(yōu)選為 140-240nm。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，空腔的底面積為石墨烯膜的面積的70-99%，優(yōu)選為75-95%，更優(yōu)選為80-90% ;源電極和漏電極之間的距離為500_5000nm，優(yōu)選為750-4000nm,更優(yōu)選為 1000_3000nm。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述傳感元件通過包括如下步驟的方法制得: (1)在基板上附著石墨稀月旲； (2)在附著了石墨烯膜的基板上形成電極，所述電極包括源電極和漏電極，且在源電極和石墨烯膜之間以及在漏電極和石墨烯膜之間形成電連接； (3)使石墨烯膜下的基板的表面變低，以使石墨烯膜下的基板的表面與石墨烯膜分離，形成空腔；且使源電極和漏電極固定在基板上。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，步驟(I)中，基板包括基層和附著在基層上的面層，且將石墨烯膜附著在基板的面層上；基層為硅片，面層為二氧化硅層。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，步驟(2)中，在基板上形成電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；源電極和漏電極之間的距離為500-5000nm，優(yōu)選為 750_4000nm，更優(yōu)選為 1000_3000nm。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中，步驟(3)中，通過將二氧化硅蝕刻液與基板接觸的方式使得石墨烯膜下的基板的表面變低，且二氧化硅蝕刻液與基板接觸的條件使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕。
8.根據權利要求4所述的方法，其中， 步驟(I)中，基板包括基層和附著在基層上的面層，且將石墨烯膜附著在基板的面層上；基層為硅片，面層為二氧化硅層，且厚度為275-300nm并且大于空腔的高度； 步驟(2)中，在基板上形成電極的基板區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；源電極和漏電極之間的距離為500-5000nm，優(yōu)選為750_4000nm，更優(yōu)選為1000-3000nm ;通過蒸鍍的方式，在待形成源漏電極的基板區(qū)域上形成電極； 步驟(3)中，通過將二氧化硅蝕刻液與基板接觸的方式使得石墨烯膜下的基板的表面變低，且二氧化硅蝕刻液與基板接觸的條件使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕；二氧化硅蝕刻液為濃度21-22重量％的氫氟酸；通過控制氫氟酸與基板接觸的時間，使得空腔的底面積為石墨烯膜的面積的70-99%，優(yōu)選為75-95%，更優(yōu)選為80_90%，并且使得源電極和漏電極下的面層不被全部腐蝕。
9.根據權利要求1或2所述的方法，其中，急性分離的動物心臟具有竇房結。
10.根據權利要求1或2所述的方法，其中，源電極和漏電極之間的電壓為10-70mV。
【文檔編號】G01N27/00GK104237308SQ201310231444
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權日:2013年6月9日
【發(fā)明者】侯俊峰, 程增光, 方英 申請人:國家納米科學中心