專利名稱：：發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用的檢測及篩選平臺的制作方法發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用的檢測及篩選平臺
背景技術：
傳統(tǒng)醫(yī)藥如傳統(tǒng)的中藥的應用，可以追溯到五千多年前。歷經(jīng)多個世紀的研究和實踐，傳統(tǒng)醫(yī)藥醫(yī)師發(fā)現(xiàn)數(shù)千種植物和其它的自然產(chǎn)物具有特殊的醫(yī)療效果。很多傳統(tǒng)醫(yī)藥的原理是加強身體的免疫防御系統(tǒng)以攻克疾病或預防疾病的形成。傳統(tǒng)中醫(yī)理論相信，疾病發(fā)作是源于身理上某些欠缺的形成。所以，扶正治療是TCM其中一個主要的原理，意為在各類疾病中"促進或加強自然宿主的防御機制"。近年來，傳統(tǒng)醫(yī)藥在免疫系統(tǒng)方面的正面效果已得到證實。但是，根據(jù)傳統(tǒng)的醫(yī)療實踐，一種特定成分治療一種特定的疾病的療效，要待至病人服用了這個特定成分并對療效結果進行分析后才能得知。因而應用于傳統(tǒng)醫(yī)藥的檢測及篩選方法將有助于醫(yī)師在給病人服用特定成分之前就能了解該成分的療效。蛋白組學是指研究一個細胞/組織/器官內(nèi)所有蛋白質(zhì)的特性，如表達水平、翻譯后修飾、蛋白與蛋白相互作用等，從而獲得一個完整和綜合的蛋白質(zhì)水平的疾病過程、細胞過程和網(wǎng)絡的概念。研究蛋白組學的目的是了解細胞或組織來源的蛋白質(zhì)。可以通過對患病和健康樣本進行比較而進行。目前分析蛋白組分兩個階段進行第一，對"正常"狀態(tài)下的特定有機體、組織或細胞表達的蛋白質(zhì)進行鑒定，和其在雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D)的定位；第二，測定在對應生理/疾病狀態(tài)發(fā)生變化時蛋白組的變化。在現(xiàn)有技術中，蛋白組學已經(jīng)應用于提供一個細胞或組織的蛋白質(zhì)譜，可以比較健康和疾病狀態(tài)的蛋白質(zhì)之間的區(qū)別用于尋找藥物或藥物靶標。蛋白組學也已經(jīng)用作分析藥物候選物的潛在用途。腫瘤壞死因子(TNF-a)于1975年被MemorialSloan-KetteringCancerCenter的LloydOld及其同事們發(fā)現(xiàn)并被確認為是一種具有抗癌活性的活性成分。TNF-a的主要細胞來源是LPS激活的單核吞噬細胞。TNF-a引起腫瘤體外出血性壞死并表現(xiàn)出體外抗癌細胞的細胞毒性。TNF-a其他的生物學功能包括能夠引起內(nèi)皮細胞表達新的表面受體，該受體使內(nèi)皮細胞表面變得對白細胞具有粘附性，先是對嗜中性粒細胞之后是對單核細胞和淋巴細胞具有粘附性，并激活炎性白細胞殺死細菌和激活嗜中性粒細胞，以及刺激其它的單核吞噬細胞產(chǎn)生細胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-a和趨化因子。千擾素(IFN)是一種眾所周知的具有高效力的細胞因子，具有免疫系統(tǒng)之內(nèi)和之外的多種生理功能。IFN-y是由胸腺來源(T)細胞在激活狀態(tài)下分泌的，IFN-y也可以由自然殺傷細胞分泌而來。IFN已知能夠誘導酶的合成，該酶直接導致大量活性氧離子的爆發(fā)，使巨噬細胞殺死腫瘤細胞。IFN-y其他性能包括，它是單核吞噬細胞有效力的激活劑、增加I級MHC分子的表達、促進細胞和體液體內(nèi)免疫反應、直接作用于T-和B-淋巴細胞促進分化、促進CD4+T細胞的分化、成為用于CD8+CTLs成熟作用的細胞因子之一，和激活嗜中性粒細胞。一氧化氮(NO)是存在于多種哺乳動物細胞內(nèi)的一種多功能分子，參與廣泛的生理學和病理生理學過程，如血管舒張、神經(jīng)傳遞、殺腫瘤和細菌活動和免疫抑制。一氧化氮是被稱為一氧化氮合成酶(NOS)的酶家族使用精氨酸作為底物合成的。細胞因子可誘導的形式，iNOS，是由許多免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的刺激而激活的，如IFN-y、TNF-a和LPS，并且催化可以成為細胞毒素的NO的大量生成。以前的工作表明巨噬細胞釋放出的NO是殺細菌和殺腫瘤活動的介體。NO顯示與幾種誘導凋亡的信號轉(zhuǎn)換機制有關，例如，iNOS的誘導導致NO的積聚，引起凋亡典型的形態(tài)學和生物化學上的改變，包括半胱天冬酶-3的激活和多ADP-核糖聚合酶(PARP)的退化。具有免疫調(diào)節(jié)作用的醫(yī)用品和/或藥物候選物能夠刺激抗腫瘤因子如IFN-y、TNF-a、iNOS的生成。按照傳統(tǒng)醫(yī)藥的體外應用，確定和檢測這種細胞因子能夠建立將所述藥物作為一種抗腫瘤工具的潛在用途。本發(fā)明者在此認為蛋白組學的方法和工具在傳統(tǒng)醫(yī)學上的應用，可開發(fā)有效力的傳統(tǒng)醫(yī)藥的檢測及篩選平臺。這種檢測平臺通過所提供的確切的活性作用機制的信息，有助于對特殊天然原材料的理解。
發(fā)明內(nèi)容為了使讀者在此了解本發(fā)明，本發(fā)明者提議；本發(fā)明的目的是開發(fā)一種用于傳統(tǒng)醫(yī)藥的檢測及篩選平臺，本發(fā)明通過利用生物標記，包括但不局限于IFN-Y、TNF-a、iNOS，和利用蛋白組學領域的方法和工具來達到目的，還要達到其它的目的和獲得不同的方法，如克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷和問題。以上所述不是作為對本申請的限制，而是總體上包含在本申請之中。本發(fā)明設備和方法的特性、內(nèi)容和優(yōu)勢將由以下描述、權利要求和附圖而得到更好的理解，在附圖中圖l表示根據(jù)本發(fā)明確定一種傳統(tǒng)醫(yī)藥是否具有抗腫瘤特性的方法。圖2為按照本發(fā)明的方法分離出的脾細胞的影像，用于實例。圖3A、3B和3C為用Rgl，一種來自多種草藥如人參的皂苷，對脾細胞的刺激作用之后，對TNF-a、IFN-Y、iNOS的Western印跡結果，用于實例。圖4表示經(jīng)過和未經(jīng)過Rgl(5pg/mL)處理的脾細胞分泌IFN-Y和TNF-a含量的時長。圖5為脾細胞在Rgl存在或缺失情況下差異蛋白的表達，用"二合一"凝膠進行比較，用于實例。圖6為通過總結Rgl對脾細胞蛋白質(zhì)表達和可能的調(diào)節(jié)機制，表明Rgl對脾細胞蛋白質(zhì)表達的影響，用于實例。以下對示范性實施例的描述本質(zhì)上僅是作為示范，而不是用來限制本發(fā)明、其應用或用途。通篇描述所使用的術語"脾細胞"是指所有從脾臟分離出來的白血細胞。術語"生物標記指示物"為能夠被檢測和/或測定的指示物，這種指示物一般通過生物學方法而產(chǎn)生。現(xiàn)在專門描述圖l-6。圖l為本發(fā)明的實施方法，包括如下步驟，獲取脾細胞101，刺激脾細胞103，和測定免疫調(diào)節(jié)作用105。該方法結合脾細胞的使用和特定蛋白質(zhì)的分析，在檢查超過100種蛋白質(zhì)的同時表達時，確定一種特定活性劑的效果。該方法因而可以對眾所周知的傳統(tǒng)醫(yī)藥的天然原材料進行大規(guī)模檢測。獲取脾細胞101脾細胞可以通過本領域已知的實驗方法而獲得，所述實驗方法包括如下步驟，獲取一個脾臟，切碎該脾臟，用已切碎的脾臟制備懸浮液，孵育由懸浮液而來的細胞，分離脾細胞，以及收集脾細胞。脾臟可以取自任何適于用作藥物檢測的哺乳動物，如大鼠、狗、貓、小鼠、豚鼠、牛、鹿、猴子，等等。脾臟移除可通過已知的脾切除術來完成，如剖腹術切除、腹腔鏡切除、無菌切除等。所獲得的脾臟然后用切開、碾磨、搗碎脾臟和將脾臟切成薄片等方法切碎。其它的工具如篩子，也可用來切碎脾臟。制備脾臟懸浮液，如單個細胞的懸浮液，然后進行孵育。孵育的方法可用已知的實驗室法進行，包括培養(yǎng)皿、瓊指平板、微量滴定板和利用發(fā)酵罐的批量處理法。孵育可以在包括如下生長因素的環(huán)境中進行，如瓊脂、營養(yǎng)物、鹽、氨基酸、糖或抗生素；所述環(huán)境包括一到多個用于互相結合的生長因素。在一項實施例中，孵育在包括1000U/mL青霉素、鏈霉素(PS)和5%檸檬酸葡萄糖的環(huán)境中進行。在孵育之后，可以通過很多方法將脾細胞從培養(yǎng)物分離出來，如離心、梯度離心、濾壓、機械壓、旋轉(zhuǎn)式過濾、立軸分離器離心(verticalspindleseparatorcentrifugation)、臣卜式蟲累方定離A、(horizontalbowlcentrifugation)、沉淀和絮凝。在一項實施例中，脾細胞是通過使用梯度離心而被分離。然后收集被分離的脾細胞。為保證脾細胞沉淀物中沒有紅細胞，可以在沉淀物中加入溶細胞素。加入溶細胞素可以用機械、微生物學或化學的方法加入。紅細胞裂解還可以通過一種或多種的方法進行，如升高溫度、極端pH、冷凍沉淀物、滲壓休克、添加細胞毒素化學藥品如氯，或添加試劑如青霉素、季銨濕潤劑，或蛋白酶。在一項實施例中，紅細胞裂解是通過往沉淀物中加入冰冷的NH4C1溶液而完成的。在此之后洗滌脾細胞。洗滌可以通過使用培養(yǎng)基，如基本培養(yǎng)基，如1000U/mLPS加上2g/L的碳酸鈉。在一項實施例中，所得脾細胞應被洗滌一次以上，如用基本培養(yǎng)基洗滌則應有兩次或三次以上。刺激脾細胞103在獲得脾細胞101之后，脾細胞用具有潛在活性成分溶液進行刺激。該溶液由一種獲自天然原材料的有活性的成分組成，所述天然原材料歷史上一直被作為一種預防疾病或治療疾病的傳統(tǒng)醫(yī)藥，包括草藥、動物身體一部分或是礦物質(zhì)。"歷史上"是指天然原材料在大約150年到5000年之前被用于藥品。"傳統(tǒng)"是指在現(xiàn)代醫(yī)學時代出現(xiàn)之前依賴于發(fā)展了數(shù)個世紀的醫(yī)學知識。傳統(tǒng)醫(yī)藥包括如下領域，傳統(tǒng)中藥(TCM)、印度草醫(yī)學、草藥、同治法、細胞療法(pytotherapy),等。傳統(tǒng)醫(yī)學往往沉浸于社會文化中，在那里醫(yī)療方法得到發(fā)展，例如，傳統(tǒng)的中藥在治療上有賴于中國的文化；印度醫(yī)學與印度文化密不可分，并在印度得以發(fā)展。傳統(tǒng)醫(yī)藥領域的治療目的是為了加強機體的免疫防御系統(tǒng)，從而可以治療疾病或預防疾病的發(fā)生。隨著機體免疫系統(tǒng)的強化，免疫系統(tǒng)因而可以對疾病進行攻擊。傳統(tǒng)醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)藥不同的是，現(xiàn)代醫(yī)藥需要通過施用藥品和給藥來治療疾病而不是增強免疫系統(tǒng)?，F(xiàn)代醫(yī)用藥品的實例包括抗代謝物、垸化劑、抗腫瘤試劑、生物堿類和激素。傳統(tǒng)醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)藥還有一點不同在于它們有不同的開處方的方法。一般來說，傳統(tǒng)醫(yī)藥是將藥物施用給病人，然后觀察該治療對健康所起的效果。通常，傳統(tǒng)醫(yī)藥是以散彈獵槍式開處方，即，一次給出幾種天然原材料，認為一種成分可以發(fā)揮效力，或者各種成分協(xié)同起作用。傳統(tǒng)藥物的選擇基于醫(yī)師對天然原材料歷史記載的理解。與之不同的是，現(xiàn)代醫(yī)學是先詳細研究確定藥物的有效性，如進行臨床研究，然后以嚴格控制和特定的方式給病人用藥，g卩，一種藥物針對一種特定的疾病。這種區(qū)別可能是由于現(xiàn)代醫(yī)藥的精確和其殺死健康細胞和正常細胞的副作用如化療的緣故。在為病人制備天然原材料時，通常依賴于非化學變化的手段，如煮沸、曬干、加工天然原材料，等等。天然原材料在用藥前未發(fā)生化學變化。來自天然原材料的活性成分含有皂苷、生物活性多糖、免疫刺激劑等。傳統(tǒng)醫(yī)藥中的活性成分可以通過如下的方法獲得，混合/浸泡天然原材料、加熱/激活天然原材料，離心、凍干法、沉淀、分離、分餾和測定所獲得的活性成分。近年來，通過分析活性成分和體外和體內(nèi)敏感性測試方式，已經(jīng)闡明了天然產(chǎn)物對免疫系統(tǒng)和癌細胞生長的正面效應。傳統(tǒng)的中藥免疫調(diào)節(jié)作用可能來自它們對多糖成分的免疫刺激。所述活性成分來源的實例包括拳參(及/2/zoma6/MoWae),夏枯草(<S//ca/^wwe〃ae),鬼牽十草(i/er6a6zWew"sZ)z》/wwa^e)，大青卩十(_Fo//i/m/sflfhW/s),i/2/zo附asww/ac/sg/a6n2e,苦參(及acz'x■sop/zorae7"v^ce欣i),牛黃6ov/s)，i/^zcw"c"http://7'必,板藍根/wc/成雪蓮花(Z/er6"sawMwmae/wvo/wc尸atoe),Jb"o/se//os^-ow,海龍，冬蟲夏草(Co/^jKce/w)，卩可膠(Co//acoWz'as/m')，紫可車(尸/ace"to/zom/m's)，》呈羊藿(Z/erZ)fl(e//wed/0，無花果(F/ci/scaWca)，〖可首烏(i^acfecpo(ygomww/^/7oW),當jl3(i"d/xfl"ge/z,cfles/we/wk)，巴草戈天(ia^focwzor/wdae,豐土《中廣Cor/^xewcow/w/aeJ'海馬，靈芝(G7ossy)，禾口甘草(丄/《wor/ceraof)?；钚猿煞值钠渌鼇碓窗ㄕ婢?，如茯苓(Poriacocos),豬苓(Polyporusumbellatus),真菌赤芝(Ganodermalucidium)，紫芝(G.japonicum),Cordecepsophigoglossoides，采革絨蓋菌(Polyporusversicolar)，Omphalialepidescense，長裙竹蓀(Dictyphoraindusiata),裂褶菌(Schizophyllumcommune),禾口Sclerotiumglucancium;植物，如Abelmoschusglutinotextilis，黃蜀葵(Abelmoschusmanihot)，刺五力口(Acanthopanaxsenticosus),Aconitumcamichaellii,藥蜀葵(Althaeaofficinalis)，蜀葵(Althaearosea),Angelilcaacutiloba,牛蒡(Arctiumlappa)，Artemisiapriniceps,Aucanacuacarmizulis，灣豐艮(Bryoniaalba)，Bryoniadiocia，Codonopiaispilosula，叻口啡屬(Coffeesp.),薏該(Coixlachrymajobivarmayuen)，秋水仙(Colchicumautumnale),Cucumismelocantalupencic,紫草(Lithospermumeuchromum),煙屬(Nicotianasp.),旱稻(Oryzasativa),人參(Panaxginseng),三七(Panaxnotoginseng),松樹(Pinussp.),車前草(Plantagomajor)，酸模(Rumexacetosa),甘蔗(Saccharumofficinarum)，一枝黃花(Solidagosp.),繡線菊(Spiraeaulmaria)，紅三葉(Trifoliumpretense)，Yuccaschidegera，紅麥(Zizyphusjujube);藥用植物，如庫洛胡黃連(Pi謹hizaku廳)，印度娃兒藤(Tylophoraindica),Anonitumheterophyllum,止瀉木(Holarrhenaantidysenterica)，寬筋藤(Tinosporacordifolia)禾口丁香羅勒(Ocimumgratissium),印度菝葜(Hemidesmusindicus),Psedustellariaheterophylla;和植物混合物，如(用拼音表示(音譯))小柴胡湯(xiao-chai-hi-tang)，葛根湯(ge-gen-tang),烏苳湯(wu-ling陽tang),豬苳湯(zhu-ling-tang)，補中益氣湯(bu-zhong-yi-qi-tang),十全大補湯(shi-quan-da畫bu國tang)，以及人參養(yǎng)容湯(ren-shen-yang-rong-tang)。從天然原材料獲得的活性成分的實例包括來自香菇(Lentinusedodes)的P(1，3)-葡聚糖、裂褶菌(Shizophyllumcommune)的schizophyllon、Criolusversicolor的多'糖K、人參(Panaxginseng)的GZ、孑亥兒參(Pseudostellariaheterophylla)的PH-1、Benincascerifera的BCM、Angelicaacutilaba的Angelica免疫朿U激多糖、蒙古黃甚(Astragalusmembranaceaus)的Fraction3、花燕(Lentinusedodes)的蘑恭多糖、孩兒參(Pseudostellariaheterophylla)的PH-1C和來自人參(Panaxginseng)的Rg-l。在本方法中，用于活性成分溶液的活性成分的量為大約5pg/mL至大約20|Jg/mL。在一項實施例中，活性成分的用量為5lJg/mL。在另一項實施例中，Rgl為一種活性成分。活性成分溶液還包含鹽水溶液，如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、半量生理鹽水、生理鹽水、四分之一量生理鹽水或含糖生理鹽水。脾細胞103的刺激作用通過將活性成分溶液添加到所獲得的脾細胞101在盤中進行，所述的盤為平底盤、滴定盤等，并將盤優(yōu)選地置放于孵育器中。將孵育器設定到一定的溫度、濕度或C02水平。在一項實施例中，孵育器(^02的濃度控制在3%和7%。在一項優(yōu)選實施例中，孵育器中C02為5M，溫度為37t:。孵育時間在12和72小時之間。測定免疫調(diào)節(jié)作用105通過活性成分溶液對脾細胞進行刺激作用之后，對生物標記指示物腫瘤壞死因子a(TNF-a)、干擾素Y(IFN-Y)和可誘導的一氧化氮合成酶(iNOS)進行確定和測定。確定和測定免疫調(diào)節(jié)作用包括使用不同的分析方法，如BmdfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay,檢測抗體反應，包括兔抗鼠iNOS、兔抗鼠TNF-a、兔抗鼠IFN-y、單克隆抗鼠IFN-y、單克隆抗鼠TNF-a、生物素化單克隆抗鼠IFN-Y、生物素化單克隆抗鼠TNF-a，或其它的方法，如雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DE)，染色如銀染和Westem印跡。該確定和測定方法可以單獨使用，或兩個或更多個結合起來以組合或有序的方式使用。BradfordProteinassay(Bradford法庫于Bio-Rad(Bio-RadLaboratory,U.S.A)制造商推薦的一種方法。該方法包括將酸性染料coomassiveblue添加到蛋白質(zhì)溶液，然后用分光光度計測定。Bradford法可用于確定細胞裂解物蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)該方法，在把Bradford試劑添加到標準溶液和蛋白質(zhì)溶液后，標準溶液和蛋白質(zhì)溶液在595nm處的吸收可用分光光度計法測得。改良的BradfordProteinassay涉及標準的Bradford方法，但包括將酸性染料添加到蛋白質(zhì)溶液，然后用分光光度計在595nm處進行測定。確定樣品中是否存在抗體或抗原的ELISAassays也可以在本發(fā)明中使用。在該方法中，ELISAassays可用于研究在活性成分溶液激活的脾細胞中IFN-Y和TNF-a的生成。在一項實施例中，ELISAassay如OptEIA頂大鼠IFN-y試劑盒和OptEIATMTNF-a試劑盒，二者都來自Pharmigen，USA，都可在本發(fā)明中使用。兩種試劑盒的特征在于同時具有初級抗體和次級抗體，具體地說，針對IFN-Y試劑盒，單克隆抗大鼠的IFN-Y抗體可用作初級抗體，而生物素化單克隆抗大鼠IFN-Y可以用作次級抗體?；蛘?，針對IFN-Y試劑盒，單克隆抗大鼠TNF-a抗體可作為初級抗體，而生物素化單克隆抗大鼠TNF-a可作為次級抗體。ELISAassays包括使用結合物，如親和素-HRP和著色底物如2,2-吖嗪-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2國Azin-bis畫3國thylbenzthiazoline畫6隱sulfonicacid)。禾ll用ELISAassays進行觀!j量是通過使用分光光度計法，通常是在405波長處用自動酶標儀測試。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)分析用于分析脾細胞的裂解物。雙向聚丙烯酰胺電泳圖譜(2D)可對一個特定器官、組織或細胞在"正常條件下"以及在生理條件發(fā)生變化的情況下蛋白質(zhì)的表達進行雙向比較。被進一步開發(fā)的2D電泳圖譜可作為分析蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化的基礎。2D電泳被選擇作為分析細胞、組織和體液蛋白質(zhì)的組成以及研究一系列效應物引起基因表達的全局狀態(tài)變化的一種技術。在2D電泳技術中，根據(jù)等電點(pl)和分子量(Mw)將蛋白質(zhì)分開。一旦2D電泳將蛋白質(zhì)分開，那么蛋白質(zhì)經(jīng)過不同的染色方法如銀染即可視，并且利用特異性圖像分析軟件對蛋白質(zhì)點圖譜進行分析。通過各種鑒定方法，對挑選出的目的蛋白質(zhì)作進一步的測定/鑒定。在本方法中，脾細胞裂解物可以通過本領域眾所周知的技術而獲得，包括孵育、洗滌脾細胞、離心、用緩沖液裂解細胞、棄除上清液、收集洗滌過的細胞和結合來自不同動物的細胞裂解物這些步驟。蛋白質(zhì)可以根據(jù)它們的p調(diào)固定pH梯度(IPG)(pH3.9-5.1，4.7-5.9，3-6，5.5-6.7，6.3-8.3，5-8，7-10)膠條被分離。首先，脾細胞裂解物可用于IPG膠條。用于等電聚焦(IEF),膠條IPG再水合與添加樣品同時進行，IEF是指根據(jù)所帶電荷的不同，將不同分子的分離的技術。IEF在2(TC和27nC之間50-60V下進行14到18個小時?？梢允褂玫入妰x，包括但不局限于MultiphorTM、IPGphore(GeneralElectric,U.S.A)和ProteanIEFTM(Bio-RadLaboratories,U.S.A)。IEF可以在由以下電壓組成的組中選擇，500V、l,OOOV、4,000V,8，000V和10,000V，在1到2個小時之間進行。首先，用于IEF的膠條被平衡化。適用于平衡膠條的緩沖液含有50mM的Tris-HCL平衡溶液，pH6.8，含有1%(w/v)DTT，6-9M尿素，30%V/V丙三醇，2%w/vSDS和痕量溴苯酚蘭。根據(jù)分子量，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，溶解和分離IEF聚焦蛋白質(zhì)。在IEF之后，用諸如ProteanmTM垂直凝膠電泳系統(tǒng)或Protean1￥，電泳槽這樣的儀器進行電泳?？稍?0到80mA電流的條件下電泳6-16個小時。在2D凝膠上用銀染測定蛋白質(zhì)。通過銀染，在裂解物中的蛋白質(zhì)可以被檢測到。銀染法還可以被修正到與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)相容。MALDI-TOFMS是一種技術，其中，UV光吸收基質(zhì)和生物分子共沉淀經(jīng)過十億分之一秒激光脈沖照射。大部分的激光能量被基質(zhì)所吸收，從而阻止不必要的生物分子的分裂。離子化的生物分子在電場中被加速并進入飛行管。在飛行過程中，不同的分子根據(jù)它們的質(zhì)荷比被分離，并且在不同的時間內(nèi)到達檢測器。每個分子以這種方式獲得一個清晰的信號。在制備用MADLI-TOFMS來作鑒定的不同蛋白質(zhì)時，含有每一種目的蛋白質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)表達為正調(diào))的凝膠填料可以用刀/切刀或其它任何一種本領域的標準技術從2D凝膠上獲取。通過將蛋白質(zhì)與酶(例如trypsin)共孵育12-16小時，把該凝膠填料中的蛋白質(zhì)用酶來酶解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或本領域常用的酶類。蛋白質(zhì)被酶解后的肽可以通過反復和選擇性地添加和移取乙腈及0.1%的三氟乙酸(TFA)而提取。肽提取物被真空離心濃縮為更濃縮的形式和/或用含有離子交換樹脂的Tips(如Zip-Tips)進行純化。被濃縮和純化的肽混合物然后與基質(zhì)相混合。該凝膠基質(zhì)由甲醇、乙酸、甲醛、乙醇、乙腈、三氟乙酸、高度純化的水和乙酸的結合而構成。然后，通過MALDI-TOFMS，獲得一個肽譜(根據(jù)M+ZZ比)。該譜稱為蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋(PMFs)。通過比較對各種蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫中所有記載的蛋白質(zhì)的酶解作用產(chǎn)生的PMFs來鑒定目的蛋白質(zhì)。除了以MALDI-TOFMS為基礎的鑒定方法之外，Western印跡法也可以使用。Western印跡法可通過本領域己知的方法進行，包括制備、凝膠電泳、轉(zhuǎn)移、封閉和檢測。檢測包括比色檢測、化學發(fā)光檢測，或放射性檢測。以上所述平臺提供了蛋白組檢測及篩選，該檢測及篩選利用脾細胞作為效應物來檢測及篩選傳統(tǒng)醫(yī)藥成分的免疫調(diào)節(jié)作用的存在。在用傳統(tǒng)醫(yī)藥成分提取物處理脾細胞后，利用確定和測定方法如分析試驗、電泳技術和質(zhì)譜分析，差別表達的蛋白質(zhì)種類即被檢査到。因而可以評估傳統(tǒng)醫(yī)藥成分的多靶標效果以及基本的免疫調(diào)節(jié)機制。本方法為大規(guī)模檢測及篩選傳統(tǒng)醫(yī)藥成分的免疫調(diào)節(jié)作用提供了一個有效的途徑。如本領域所知，免疫調(diào)節(jié)作用的確定和測定可以被調(diào)整至滿足更大規(guī)模和快速檢測及篩選傳統(tǒng)醫(yī)藥成分的需求。這種"更大規(guī)模"的需求對本領域技術人員是已知的，即它是針對有效地應用本發(fā)明的效率。在以上所述方法的另一個實施例中，生物標記指示物還包括發(fā)現(xiàn)于巨噬細胞、多形核細胞、細胞毒素T淋巴細胞、自然殺傷細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞中的生物指示物。圖2-6針對以下的實例實施例高度純化的Rgl為人參中一種主要的皂苷，已經(jīng)顯示出可抑制癌細胞的生長。它刺激動物組織中DNA、蛋白質(zhì)和脂類的生化合成。Rgl還顯示可以作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，引起內(nèi)皮細胞在Rgl誘導之后增加一氧化氮的生成，以及增加T輔助細胞的活性、細胞因子IL-1和自然殺傷細胞產(chǎn)量的增加。其它的特性包括選擇性增強淋巴細胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生?？梢约僭O，人參皂苷的抗癌效果可能與由半胱天冬酶-3和/或活性氧類引發(fā)的凋亡效應相關。盡管已經(jīng)對人參效果有很多的研究，但是對它的分子作用機理仍然知之甚少。材料和方法動物周齡8-10、體重200g的雄性SpragueDawley大鼠由香港理大學應用生物禾口化學技術系動物中心(theanimalholdingcenteroftheDepartmentofAppliedBiologyandChemicalTechnology,TheHongKongPolitechnicUniversity)提供。所有研究都是根據(jù)最新公布的對實驗室動物護理和使用的NIH指南(theNIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)中所述的原理和程序進行的。動物倫理學批文己從香港理工大學動物倫理學分委員會獲得。制備大鼠脾細胞將大鼠在醚深度麻醉下放置，并經(jīng)腹部大動脈放血，通過無菌技術移出脾臟，接著在10ml含有1000U/ml青霉素-鏈霉素(PS)(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco，USA)培養(yǎng)基中洗滌兩次。把脾臟切成小塊后，在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制備單個細胞懸浮液，并放置在含有IOOOU/mlPS和5c/。檸檬酸葡萄糖的同樣培養(yǎng)基中。然后通過梯度離心將單細胞懸浮液分層到Ficoll-PaguePlus梯度(AmershamBioscience,H.K丄td.)上而分離脾細胞，室溫下以400g離心35分鐘。收集含脾細胞的組分。室溫下加入4倍體積的冰冷氯化銨溶液(pH7.4)而裂解紅細胞5分鐘，將脾細胞在普通培養(yǎng)基中洗滌兩次。淋巴細胞用Wright-Giema著色劑染色后，再在光學顯微鏡下檢査。臺盼藍染色后，經(jīng)光學顯微鏡檢査細胞生存力和數(shù)目。將脾細胞(lxl06)培養(yǎng)在含有1000U/mlPS、補充有2g/L碳酸鈉的完全RPMI-1640培養(yǎng)基上。24小時孵育后，使細胞重懸浮在含有10。/。FCS(Gibco，USA)的同樣培養(yǎng)基上，并進行多種處理。用Rgl剌激脾細胞將Rgl(劑量5Mg/ml)加入到位于37'C、5%(]02培養(yǎng)箱內(nèi)6孔平底板(NuncMaxisorp，USA)上脾細胞的PBS緩沖液中。在不同時間點(12-72小時)從孵育混合物中采集條件培養(yǎng)基的樣品。這些樣品儲存在-8(TC備用。樣品保存不超過兩個月，除用Western印跡法之外，還可以在Rgl處理的脾細胞的樣品(間隔12和24小時)中使用2DE分析進行全蛋白的表達，與PBS孵育24小時的細胞用作對照。Western印跡和免疫檢測在不同時間點采集與Rgl孵育和沒有與Rgl孵育的脾細胞培養(yǎng)物的上清液，并且用于檢測TNF-a和IFN-Y。同樣，脾細胞裂解物用于檢測iNOS的表達，上清液/裂解物中的蛋白含量通過Bradford方法(Bio-RadLaboratory,USA)確定。對于各個分析，通過12.5y。還原性SDS-PAGE膠在恒壓(150V)下電泳l小時，分析350pg蛋白。蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Millipore，USA)上。洗滌和封閉后，以1:500的稀釋度，對這些膜用下列探針進行檢查兔抗大鼠的iNOS(TransductionLaboratories，USA)，兔抗大鼠TNF-a(PropTech:USA)或兔抗大鼠IFN-Y(PropTech,USA)。室溫孵育2小時后，洗滌這些膜，然后與l:20,000稀釋的結合有IgG(Sigma,USA)的山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)孵育。使用SuperSignalWestPicoChemiluminescent試劑盒(Pierce,USA)檢測陽性結合，而使用分子動力學密度儀(MolecularDynamicsDensitometer)(Bio-RadLaboratories,USA)掃描曝光的X線膠片(Kodak)。ELISA測定使用OptEIATM大鼠IFN-Y和TNF-a試劑盒(Pharmigen，USA)進行IFN-y和TNF-a測定。對使用或未使用Rgl刺激的脾細胞裂解物進行檢測。在這些試劑盒中，單克隆抗大鼠IFN-Y和TNF-a抗體用作初級抗體，而生物素化的單克隆抗大鼠IFN-Y和TNF-a抗體用作次級抗體。加入親和素-HRP結合物后，再加入2，2-吖嗪-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-Azin-bis-3-thylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)顯色，并且采用微滴定板讀數(shù)儀(Bio-RadLaboratories,USA)在吸光度405nm處檢測顏色變化。與標準相比，計算IFN-Y和TNF-a的量。2-DE分析脾細胞裂解物樣品制備在與或不與Rgl孵育后，將培養(yǎng)皿上的脾細胞以RPMI-1640沖洗一遍，隨后加入含有0.2g/LEDTA的0.5g/L胰蛋白酶，孵育3分鐘。以1000g離心5分鐘收集細胞，并用PBS(pH7.2)洗滌兩次。然后將脾細胞用最低量的含有4。/。TritonX-IOO,9M尿素和lmM的PMSF的裂解緩沖液(通常200iJl)在冰上裂解10分鐘。以3000g離心10分鐘收集上清液，采用Bio-RadLaboratories,USA的蛋白分析試劑盒，通過改良的Bradford法測量蛋白含量。經(jīng)同樣處理的不同動物的細胞裂解物以l"的蛋白比率合并在一起，并用作2-DE分析。120iJg的脾細胞裂解物[在含有9M尿素，2%w/vTritonX-IOO，0.5%w/vDDT(Sigma，USA)，0.4%v/vIPG緩沖液4-7(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)和痕量溴酚蘭的緩沖液中至終體積300lJl中]用于膠內(nèi)樣品再水合。2-DE把樣品上樣到IPG膠條pH4-7(3xl70mm，Bio-RadLaboratories,USA)。使用ProteanIEFCell(Bio-RadLaboratories，USA)或IPGphor(AmershamBiosciences,USA)進行再水合及之后的等電聚焦。室溫下在覆蓋有低粘度石蠟油的IPG膠條固定器上以50V進行再水合16小時。然后依序使用500V(l小時)、1000V(l小時)、4000V(2小時)和8000V(2小時)進行等電聚焦，膠條平衡在pH6.8，含有1%(w/v)DTT(Sigma，USA)、9M尿素、30。/。v/v甘油、2。/。w/vSDS和痕量溴酚蘭的50mMTris-HCl平衡緩沖液中10分鐘。平衡后，IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5Q/。SDS-PAGE凝膠(1600xl60()xlmm)，用于在ProteanVI電泳槽中室溫下以恒電流30mA每凝膠電泳進行第二維分離。隨后，使用與MALDI-TOF分析相容的方法對凝膠銀染。銀染的凝膠用分子動力學密度儀(Bio-RadLaboratories,USA)掃描。所得2-DE圖譜采用軟件MelanieIII(Bio-RadLaboratories,USA)加以分析。在銀染蛋白質(zhì)點中以體積百分比變化的基礎上，對相對量的變化進行評價。目的點變化在多個凝膠上測試重現(xiàn)性，蛋白質(zhì)可視使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀的制造商BrukerDaltonics(USA)所建議的質(zhì)譜儀相容的方法進行銀染。簡而言之，首先將凝膠在含有50。/。v/v甲醇，12。/。v/v乙酸，0.0375。/。v/v甲醛的固定溶液中固定2小時，隨后用50%甲醇另洗滌凝膠20分鐘。重復兩次洗滌步驟。凝膠在含有0.05%硫代硫酸二鈉的溶液中氧化l分鐘，接著用milli-Q水洗滌(三次，每次20分鐘)。把凝膠在含有0.0375%甲醛的0.2%硝酸銀中孵育20分鐘。再次用milli-Q水洗滌凝膠三次，每次20分鐘。然后在含有0.0375%甲醛和0.004%硫代硫酸二鈉的15%碳酸鈉溶液中使凝膠顯色，直到凝膠達到所需量的染色。該過程不應長于IO分鐘。最后，用含有12%乙酸的25%甲醇終止反應。蛋白鑒定或通過軟件MelanieIII(Bio-Rad,USA)進行圖像分析，或直接利用如前所述的"二合一"凝膠法(WangAYY，CheungBY，WongMS,LoSCL.兩維電泳后"二合一"凝膠用于點匹配，Proteomics2003，3，580-583)加以比較，而將不同處理后差異表達的蛋白定位于2-DE凝膠上。使用MALDI畫TOF國MS(Autoflex，BrukerDaltonics，Germany)通過肽質(zhì)量指紋識別選擇和鑒定若干種差異表達的蛋白質(zhì)點。含有差異表達的蛋白質(zhì)點的凝膠填料從2-DE凝膠上切去，并用胰蛋白酶消化(采用由BrukerDaltonics，Germany建議的方案，該方案是如以前由Shevchenko等(ShevchenkoA，WilmM，VormO，MannM.質(zhì)譜測序蛋白銀染的聚丙烯酰胺凝膠。Aanl.Chem.68:850-8，1996)所述方法的改進)。簡而言之，凝膠填料被切成小塊，用milli-Q水洗滌兩次，接著用25mM碳酸氫銨的50M乙腈洗滌。樣品中的半胱氨酸殘基用10mMDTT還原，并用55mM碘代乙酰胺處理而衍生化。乙腈再水合和干燥后，樣品用胰蛋白酶(5ng/iJl胰蛋白酶的25mM碳酸氫銨)37。C下消化過夜。消化樣品用50%乙腈/1%三氟乙酸通過超聲抽提。收集含有消化的肽的上清液，消化的肽(0.5iJl-1.5lJl)與l-2ml的a-氰基-4-羥基肉掛酸(10mg/ml的50。/。乙腈，0.1%三氟乙酸)基質(zhì)和100fM促腎上腺皮質(zhì)激素(ATCH)片段18-39混合作為內(nèi)標。儀器以陽離子反射方式在20kV加速壓下操作。所得肽質(zhì)量指紋使用矩陣科學(MatrixScience)的MSCOT搜索引擎對Swiss-Prot進行檢索。所有檢索都使用1-1OOkDa的質(zhì)量窗以質(zhì)量公差+Z-100ppm進行。每個樣品允許有一個失誤切割，而半胱氨酸假定是氨基甲酰胺基甲基化的，以及甲硫氨酸為氧化形式。結果脾細胞分離圖2為用LeicaQ500MC成像處理和分析系統(tǒng)(Leica,Gemany)顯示分離的脾細胞(大淋巴細胞和小淋巴細胞)圖像。脾細胞的制備如以上的方法部分所述，并在Wright-Giemsa染色后檢查細胞。未見紅細胞污染。臺盼藍染色證實95%以上的分離細胞具有生存力。還可以見到少量的巨噬細胞，它們附著在用于孵育細胞的培養(yǎng)皿的底部。由于巨噬細胞、大淋巴細胞和小淋巴細胞皆存在，該制備物可用作研究Rgl的免疫調(diào)節(jié)作用的效應物。Rg1對脾細胞生成IFN-Y和TNF-a和iNOS的影響圖3A、3B和3C分別為Western印跡檢測Rgl在不同時間間隔內(nèi)對TNF-a、IFN-Y和i-NOS的誘導作用的結果。在成功制備有生存能力的脾細胞之后，加入Rgl作為刺激物以研究這些脾細胞可能的反應。Western印跡檢測IFN-Y和TNF-a在培養(yǎng)基中的分泌。iNOS的表達也在脾細胞裂解物中加以測試。大多數(shù)藥理學研究Rgl所用的濃度為5-2(^g/ml。初步研究使用5ng/ml的Rgl，導致IFN-y和TNF-a實驗的陽性結果。因此，5iJg/ml的Rgl用于本發(fā)明人實驗中。沒有Rgl處理的脾細胞用作比較用對照。結果顯示，對照組在72小時的孵育過程中，細胞培養(yǎng)基或脾細胞裂解物均未檢測到IFN-Y、TNF-a和iNOS。另一方面，當用5ng/mlRgl剌激時，可檢測到所述的兩個細胞因子和iNOS。TNF-a在間隔24小時和48小時皆被檢測到，而IFN-Y在24小時被檢測到。誘導的iNOS在用Rgl孵育后12小時和24小時被檢測到。隨后，利用ELISA對培養(yǎng)基的系列樣品進行這些抗癌細胞因子(IFN-Y和TNF-a)的定量記錄。圖4為各個條件重復測定三次的結果。兩個細胞因子的分泌方式在誘導后很相似，這些細胞因子的數(shù)量在Rgl誘導后增加1000倍以上，而其水平在孵育24小時時達到最高。24小時后，兩個細胞因子分泌水平隨著孵育時間延長開始下降。該結果也與Westem印跡的結果一致，其中，最大量的IFN-Y和TNF-a分泌出現(xiàn)在Rgl誘導后24小時處。Rgl對蛋白質(zhì)表達的影響圖5顯示蛋白質(zhì)在普通樣品和經(jīng)過Rgl處理后的樣品中表達上的差異。由于Rgl發(fā)現(xiàn)在孵育24小時后誘導IFN-Y和TNF-a產(chǎn)生，因此在孵育24小時后還研究了Rgl對脾細胞蛋白質(zhì)組的影響。同樣處理的樣品以l:l的蛋白質(zhì)比率合并，并用于如材料和方法中所述的2-DE分析。無論在PBS還是在含有Rgl的PBS中，全部樣品皆在孵育24小時后采集。與PBS孵育的樣品用作對照作比較之用。為便于鑒定差異表達的蛋白質(zhì)，如前所述(Wang等，2003)進行"二位一體"凝膠方法。簡而言之，樣品第一維IEF(與或未與Rgl一同孵育)分開在不同ProteanIEF細胞中但同時進行。IEF完成后，將IEF膠條切成等半。半份IEF膠條對應于同樣的pH范圍，但以不同樣品(與或未與Rgl—同孵育)電泳，并排放到ProteanVI電泳裝置中制備的第二維SDS-PAGE的頂部。所得對照樣品的凝膠和Rgl處理樣品的凝膠在銀染后利用MdaninII咖以比較。在用正常樣品電泳的一半凝膠中約有102個蛋白質(zhì)點被檢測，而在用Rgl處理的樣品電泳的另一半凝膠中有122個蛋白質(zhì)點被檢測到。蛋白質(zhì)鑒定在凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化后，MALDI-TOF質(zhì)譜用于鑒定差異表達的蛋白質(zhì)。7個差異表達的蛋白質(zhì)點通過MASC0T搜索引擎得以成功鑒定。6個蛋白質(zhì)被正調(diào)，包括細胞色素C氧化酶，同源異型蛋白質(zhì)LH-2，T細胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶P，a-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G，其他蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)是被負調(diào)的，并且被鑒定為假設的抗增殖因子。7個鑒定的蛋白的詳情匯總在表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>討論大鼠脾細胞由巨噬細胞、T細胞和B細胞組成。這群細胞用作效應物對Rgl是否存在免疫調(diào)節(jié)作用進行測試。利用Western印跡和ELISA，發(fā)現(xiàn)Rgl刺激了脾細胞的IFN-Y、TNF-a和iNOS的產(chǎn)生。Rgl誘導后，IFN-y和TNF-a的產(chǎn)量在24小時達到峰值。這個結果與Gao等(PharmaceuticalResearch1996，13:1196-2000)的報道相似，其中在用三七(尸awaxwotog/""wg)的粗制品對分離自小鼠脾臟的淋巴細胞誘導后24小時和48小時檢測到最高量的IFN-Y和TNF-a。在本發(fā)明人的實驗中，IFN-Y和TNF-a的產(chǎn)生達到其峰值所需的時間較短。這可能是由于本研究使用純化的Rgl而非粗制品的緣故。另一方面，Rgl對分子水平的作用方式可能已被揭示出來，這在以前的研究中尚未發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明研究了Rgl誘導的脾細胞中差異蛋白質(zhì)的表達。基于直接比較"二合一"凝膠的蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)表達在正常樣品和Rgl處理樣品之間的顯著變化。有87個蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)是正調(diào)的，而另有38個蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)是負調(diào)的。還有38個點沒有任何顯著的變化。胰蛋白酶消化后，利用MALDI-TOF質(zhì)譜對差異表達蛋白質(zhì)進行了選擇和鑒定。有7個蛋白質(zhì)成功地得以鑒定，其中6個是正調(diào)蛋白質(zhì)。它們是細胞色素C氧化酶，同源異型蛋白LH3，T細胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶卩，a-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G。剩余蛋白質(zhì)點(假設的抗增殖因子)發(fā)現(xiàn)是負調(diào)的。從文獻中可知，DNA聚合酶P相關于DNA合成。其正調(diào)表明Rgl剌激DNA合成。該剌激是否通過類固醇激素依賴的或不依賴的途徑介導現(xiàn)在還未知。Rgl對DNA合成的剌激效果也在大鼠和小鼠骨髓細胞中被觀察到。另一方面，已知還有兩個正調(diào)蛋白同源異型蛋白LH-2和T細胞表面糖蛋白CD5參與B細胞和T細胞增殖。據(jù)報道，同源異型蛋白LH-2是B淋巴細胞分化的早期標記，也參與控制B細胞分化(Xu等，.ProcA/^/JcadC/&4.，1993,90，227-31)。T細胞表面糖蛋白CD5為一跨膜蛋白，已知在調(diào)節(jié)T細胞增殖中擔當受體(Vermeer等，￡wr.//www"o/.1994,24,585-92)。另兩個鑒定的正調(diào)蛋白細胞色素C氧化酶和a-甘露糖苷酶n可能參與細胞代謝過程。細胞色素C氧化酶是一種參與呼吸鏈的氧化性磷酸化作用的線粒體膜酶(Kadenbach,B.Biochim.Biophys.Acta2003，1604，77-94)。由于ATP是呼吸過程的終產(chǎn)物之一，當細胞色素C增加時，ATP的合成也很可能增加，己知細胞內(nèi)高的ATP含量為細胞生長和增殖提供能量。細胞色素C氧化酶還參與cAMP生成的跨膜信號傳導途徑(Frizzdl，R.A.AmJRespirCritCareMed.1995,151,S54-8)。a-甘露糖苷酶II為高爾基膜蛋白質(zhì)，控制甘露糖轉(zhuǎn)化為復合的N-糖基。其可能參與溶酶體合成，因為注定為溶酶體的蛋白質(zhì)在高爾基體內(nèi)通過加入6-磷酸甘露糖被共價修飾，然而，其真正的功能還不清楚。鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G是另一個正調(diào)蛋白，為膜相關蛋白，其將許多類型的膜受體連接到多種第二信使系統(tǒng)上(Gilman，A.G.Ann.Rev.Biochem.1987，56，615-49)。(3和Y亞基為把a亞基(一種膜周邊蛋白)固定至質(zhì)膜上的疏水整合膜蛋白。已知G蛋白的一個組分Gsa-GTP能夠結合到腺苷?；h(huán)化酶，這剌激cAMP的產(chǎn)生(Lania，五wr丄五"Acn'".2001，145,543-559)。據(jù)報,道，Rgl可增加老年動物中胞內(nèi)cAMP和cGMP，導致白介素2(IL-2)的表達以及脾細胞增殖(LiuM.，ZhangJ.T.，YaoXueXueBao，1996,31,95-100)。因此鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G的正調(diào)可能暗示cAMP水平相應增加，而這又誘導IL-2表達和脾細胞增殖的相應增加。假設的抗增殖因子，盡管其真正的功能還未確立，但據(jù)信抑制細胞增殖。因此，這種蛋白質(zhì)在Rgl處理后的負調(diào)表明細胞增殖的機會增加。圖5說明7種鑒定了的蛋白質(zhì)以及IL-2、TNF-a、IFN-Y和iNOS在帶來免疫調(diào)節(jié)作用方面可能的相互作用。上述結果還表明，Rgl處理后12小時和24小時檢測到iNOS。誘導的iNOS己知產(chǎn)生一氧化氮，其在諸如血管舒張、抑制血小板聚集和神經(jīng)傳遞的不同生理過程中起重要作用。一氧化氮也己知起細胞毒介導劑的作用，并且作用于巨噬細胞的殺菌和殺腫瘤活性。因此，iNOS的正調(diào)可用于評價細胞的殺菌活性。這種酶的產(chǎn)生可能受到細胞因子(TNF-a和IFN-Y)的調(diào)節(jié)。Kampiah等報道了病毒復制受到IFN-Y誘導的NOS的抑制(Karupiahetal.5We"cel993，261:1445-48)。這些研究人員認為誘導NOS對于IFN-y的實際抗病毒效果是必需和足夠的。文獻中還清楚記載了IFN-Y可與TNF-a協(xié)同作用，促進iNOS的基因表達。此外，細胞色素C氧化酶和ATP在Rgl處理后的增加可能還增加iNOS的生成。蛋白激酶C(PKC)活性對于iNOS表達是必要的，其中PKC在結合到膜受體的過程中需要ATP。還已知PKC介導的信號傳導剌激G蛋白的活性。因此，iNOS的增加也會導致IL-2、TNF-a和IFN-Y的量的增加?？傊庖哒{(diào)節(jié)是一種復雜的活動，涉及多種蛋白和細胞組分之間的相互作用。利用脾細胞對Rgl免疫調(diào)節(jié)作用進行檢測已證明在了解涉及Rgl免疫調(diào)節(jié)的機理方面是成功的。本發(fā)明提供了一個大規(guī)模檢測傳統(tǒng)醫(yī)藥的概念。盡管結合附圖描述了本發(fā)明的實施方案，但要理解本發(fā)明不受確切的實施例的限制，而且本領域技術人員可以對此進行修正和改變。但是這些修正和改變都沒有脫離開權利要求書中所限定的范圍和精神。為說明權利要求書，必須要理解a)術語"包括"不排除權利要求書中未列出的其它的成分或功能；b)某個成分之前的冠詞"一個"或"一種"不排除多個這類成分；c)權利要求書中的附圖標記并不限制它們的范圍；d)任何公開的設備或它們的一部分都可以進一步結合或分開成其它的部分，除非做出專門的說明；和e)不需要對操作或步驟排序，除非特指。權利要求1.一種檢測傳統(tǒng)醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)活性的方法，包括步驟獲取脾細胞；用活性成分溶液刺激所述脾細胞；和確定生物標記指示物的存在。2.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，所述脾細胞可以從選自由下列動物組成的群組獲得大鼠、狗、貓、小鼠、豚鼠、家畜、鹿或猴子。3.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，刺激所述脾細胞包括將所述活性溶液加至所述脾細胞，且所述脾細胞置于盤中。4.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，所述活性成分溶液包括來自歷史上被用作傳統(tǒng)醫(yī)藥的天然原材料的活性成分和鹽水溶液，所述鹽水溶液選自由磷酸緩沖生理鹽水、半量生理鹽水、生理鹽水、四分之一量生理鹽水和含糖生理鹽水組成的群組。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述活性成分選自由皂苷、生物活性多糖、免疫刺激劑組成的群組。6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述天然原材料來自由傳統(tǒng)中藥、印度草醫(yī)學、草藥、同治法和細胞療法(pytotherapy)構成的領域。7.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述天然原材料為歷史上一直被使用的傳統(tǒng)中藥。8.根據(jù)權利要求l所述的方法，其還包括測定所述生物標記指示物的步驟。9.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述生物標記指示物選自由IFN-Y、TNF-a和iNOS組成的群組。10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，確定和測定生物標記指示物包括使用一種或多種測試，所述測試選自由BradfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗體反應、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色、Westem印跡和MALDIJTOF質(zhì)譜分析組成的群組。11.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述生物標記指示物可選自由同源異型蛋白質(zhì)LH-2、細胞色素C氧化酶多肽IV前體、DNA聚合酶P、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G、T細胞表面糖蛋白CD5前體、a-甘露糖苷酶II和假設的抗增殖因子組成的群組。12.—種檢測傳統(tǒng)醫(yī)藥抗腫瘤活性的方法，包括步驟獲取脾細胞；用活性成分溶液刺激所述脾細胞；確定生物標記指示物的存在；和測定所述生物標記指示物。13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，所述活性成分溶液包括來自歷史上作為傳統(tǒng)醫(yī)藥的天然原材料的活性成分。14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中，所述天然原材料為歷史上一直被使用的傳統(tǒng)中藥。15.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，所述生物標記指示物選自由IFN-y、TNF-a和iNOS組成的群組。16.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，確定和測定生物標記指示物包括使用一種或多種測試，所述測試選自由BmdfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗體反應、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色、Western印跡和質(zhì)譜分析組成的群組。17.—種檢測傳統(tǒng)中藥抗腫瘤活性的方法，包括步驟獲取脾細胞；用含有來自歷史上一直被用作中藥的天然原材料的活性成分的活性成分溶液刺激所述脾細胞；確定生物標記指示物的存在；和測定所述生物標記指示物。18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述生物標記指示物選自由IFN-y、TNF-a和iNOS組成的群組。19.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，確定和測定生物標記指示物包括使用一種或多種測試，所述測試選自由BradfordProteinAssay、改良的BradfordProteinAssay、ELISAAssay、抗體反應、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色、Western印跡和質(zhì)譜分析組成的群組。20.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述生物標記指示物選自由同源異型蛋白質(zhì)LH-2、細胞色素C氧化酶多肽IV前體、DNA聚合酶P、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G、T細胞表面糖蛋白CD5前體、a-甘露糖苷酶II和假設的抗增殖因子組成的群組。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測或篩選傳統(tǒng)醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤活性的方法。該方法包括應用蛋白組學領域使用的技術和分析工具從歷史上一直被作為傳統(tǒng)醫(yī)藥使用的天然原材料分離活性成分、刺激脾細胞以及確定和測定來自這種刺激作用的生物標記指示物。文檔編號G01N33/566GK101281199SQ20071009209公開日2008年10月8日申請日期2007年4月6日優(yōu)先權日2007年4月6日發(fā)明者盧俊立,王淵淵,黃文秀申請人:香港理工大學