基于3-羥基色原酮結(jié)構(gòu)的Raf激酶抑制劑及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類3-羥基色原酮類化合物、它們的制備方 法、含些化合物的藥用組合物以及它們的醫(yī)療用途，特別是作為Raf激酶抑制劑以及腫瘤 抑制的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] Raf激酶已成為一個(gè)治療腫瘤的重要的藥物作用靶點(diǎn)。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于中樞地位，其作為抗腫瘤的靶點(diǎn)在基礎(chǔ)研究與藥物開發(fā)方 面受到了廣泛關(guān)注，為腫瘤的靶向治療提供了令人可喜的前景。Raf激酶作為Ras的下游 效應(yīng)器在此通路中起到關(guān)鍵性作用，突變的Raf激酶能使ERK通路持續(xù)激活，并最終導(dǎo)致 諸多生理功能，如細(xì)胞增殖、分化、血管生成、凋亡抑制以及腫瘤的發(fā)生。2005年，由Onyx Pharmaceuticals(Emeryville,CA,USA)與Bayer(Leverkusen,Germany)公司合作石開發(fā)的 Raf-1抑制劑Sorafenib(BAY43-9006)已被FDA批準(zhǔn)上市，用于治療晚期腎癌；2007年FDA 又批準(zhǔn)其用于治療肝癌。Sorafenib是一種雙芳基脲類化合物，能強(qiáng)效抑制Raf-1激酶從 而阻斷Ras/Raf/MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，臨床數(shù)據(jù)顯示Sorafenib對(duì)腎癌、前列腺癌，直腸 癌，小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤疾病都具有較好的治療作用。2011年至今，美國(guó)FDA又已 批準(zhǔn)2個(gè)選擇性B-Raf激酶抑制劑上市：Vemurafenib和Dabrafenib。這兩個(gè)抑制劑的成 功上市，進(jìn)一步增強(qiáng)了這類化合物抑制腫瘤的臨床效果和研究?jī)r(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明研究了Vemurafenib與Raf激酶的結(jié)合模式，并結(jié)合AUT0D0CK3. 05對(duì)接軟 件的計(jì)算結(jié)果以及藥物設(shè)計(jì)基本原理（如拼合、生物電子等排），對(duì)Vemurafenib進(jìn)行結(jié)構(gòu) 改造，設(shè)計(jì)了結(jié)構(gòu)新穎，預(yù)測(cè)活性較好的系列目標(biāo)化合物。計(jì)算機(jī)計(jì)算結(jié)果和初步藥理實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的化合物與先導(dǎo)化合物有相似的作用機(jī)理，可能保留Vemurafenib對(duì)革巴的 作用?；钚运匠^或近似Vemurafenib或Sorafenib。通過這些工作，期望得到選擇性 強(qiáng)，藥效好，毒副作用小的先導(dǎo)化合物。
[0004] 本發(fā)明的化合物通式A如下：
[0005]
[0006] 其中&、1?2、1?3、1?4、1?5、1? 7、馬、1?9各自獨(dú)立的表示氫、羥基、硝基、氨基、甲基、乙基、甲 氧基、三氟甲基、鹵素、氰基；
[0007] R6表示1-5個(gè)碳原子的烷基、環(huán)烷基、五元芳雜環(huán)、六元芳雜環(huán)、苯基或取代苯基；
[0008]X!表示-CH2_、-C0-或-C0NH-;
[0009]X2 表不 _C0_、_C0NH_ 或 _S02_。
[0010] 上述通式的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以是：
[0011] 1(4-氟-3-((3-羥基-4-氧-4!1-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰胺出1)，
[0012] ^(4-氟-3-((7-氯-3-羥基-4-氧-紐-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B2)，
[0013] ^(4-氟-3-((7-氟-3-羥基-4-氧-紐-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B3)，
[0014]N- (4-氟-3- ((6-溴-3-羥基-4-氧-4H-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B4)。
[0015] 本發(fā)明的部分化合物制備方法如下：
[0016]
[0017] 本發(fā)明化合物都可以用上述的制備方法制備得到，根據(jù)取代基的不同和取代基位 置的不同選用相應(yīng)的原料即可。
[0018] 藥理測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明化合物具有Raf激酶抑制活性，可用于預(yù)防或治療與 Raf激酶抑制劑有關(guān)的臨床疾病，這些疾病可以是：黑色素瘤、肝癌、腎癌、急性白血病、非 小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨髓增生 異常綜合癥、食管癌、胃癌或間皮瘤等。
[0019] 藥理活性測(cè)試：
[0020] -、BRafV6°°E激酶活性測(cè)試材料和方法
[0021] 完整的B_RafV6°°E 激酶活性試驗(yàn)是由ReactionBiologyCorp.(MalvernPA)公 司通過HotSpotSM激酶法測(cè)試。5nMGST標(biāo)記的人類B-RafV600E蛋白（AA416-766) (Invitrogen，Cat#PV3849)和 20μΜ底物His6 標(biāo)記的完整人類MEK1 (K97R)(Reaction BiologyCorp.)在緩沖液中（20mMΗ印espH7.5，10mMMgC12，lmMEGTA，0.02%Brij35， 0. 02mg/mlBSA，0.ImMNa3V04,2mMDTT，1%DMS0)室溫下混合，然后化合物溶解于指 示劑量的100 %DMS0中（從30μΜ不斷稀釋3倍）并通過Acoustic技術(shù)（Echo550; nanoliterrange)遞送到激酶反應(yīng)的混合液中，接著室溫下保持20min。25°C下加入 10μΜ33Ρ-γ-ATP(specifcactivitylOμCi/μ1)(P-ERKinElmer,NEG302H001MC),反 應(yīng)開始，監(jiān)測(cè)反應(yīng)120min。激酶活性通過filter-binding法測(cè)定，IC50值和曲線擬合由 Prism(GraphPadSoftware)實(shí)現(xiàn)。
[0022] 二、細(xì)胞活性測(cè)試的材料和方法
[0023] 1、材料和儀器
[0024] 311型氣套二氧化碳培養(yǎng)箱：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；
[0025] Vortex-2 潤(rùn)旋振蕩器：購(gòu)自ScientificIndustries公司；
[0026]BSA124S分析天平：北京多利斯天平有限公司；
[0027]BSC-1000IIA2生物安全柜：購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；
[0028]CKX41倒置顯微鏡：購(gòu)自0LYPUS公司；
[0029] YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋：購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；
[0030] EasypureII實(shí)驗(yàn)試劑超純水儀：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；
[0031] DioFugePRIM0型臺(tái)式高速離心機(jī)：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；
[0032] SpectraMaxPlus384 酶標(biāo)儀：購(gòu)自MolecularDevices公司；
[0033] ED(V. 2)水浴鍋：購(gòu)自Julobo公司。
[0034] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0035] 體外細(xì)胞培養(yǎng)
[0036]U20S細(xì)胞經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后置于培養(yǎng)箱中在37°C，5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待 細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，吸除瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，用PBS洗2次，去除殘留培養(yǎng)液，再向瓶?jī)?nèi) 加入適量消化液（0. 25%胰蛋白酶），使消化液浸沒所有細(xì)胞表面，置37°C培養(yǎng)箱中孵育。 時(shí)間視不同細(xì)胞而定，置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入含 10%四季青胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化，離心（1000X，5min)后去除上清液，用培養(yǎng)液 重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)3xl05~5X105cells/mL接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱中以 上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，2~3d傳代一次。
[0037]MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力
[0038]細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以0. 25%胰蛋白酶消化，1000X離心5min，細(xì)胞沉淀用 完全培養(yǎng)基調(diào)U20S細(xì)胞數(shù)為0. 8xl05~lxl05cells/mL，在96孔培養(yǎng)板每孔接種100μL， 37°C，5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后，棄上清；加入含不同濃度的測(cè)試化合物或者陽(yáng) 性藥阿霉素的完全培養(yǎng)基200μL，每濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔加入含等量DMS0的培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)24h;再加入20μL濃度為5mg/mL的ΜΤΤ，置于C02培養(yǎng)箱37°C孵育；4h后棄去培養(yǎng) 液，每孔加入150μLDMS0,在培養(yǎng)板平臺(tái)振蕩機(jī)上振蕩10min，置酶標(biāo)儀中以570nm為檢測(cè) 波長(zhǎng)，630nm為參比波長(zhǎng)測(cè)定各孔的0D值，計(jì)算各給藥濃度的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)試 化合物對(duì)U20S細(xì)胞株的IC5。用GraphPadPrism5軟件按機(jī)率單位加權(quán)回歸法（Bliss法） 計(jì)算。
[0039] 抑制率的計(jì)算公式：
[0040] 抑制率（％ ) =(1-加藥孔平均0D值）/對(duì)照孔平均0D值xlOO%數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0041] 多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析（ONE-WAYAN0VA)，滿足方差齊性要求的 數(shù)據(jù)采用Turkey法進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較，否則采用Dunnett'sC驗(yàn)證結(jié)果；兩組間用 t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果p< 0. 05認(rèn)為有顯著性差異，p< 0. 01認(rèn)為有極顯著 性差異。
[0042] 藥理測(cè)試結(jié)果
[0043]

【具體實(shí)施方式】：
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 1- (5-溴-2-羥基苯基）-3- (4-吡啶基）丙烷-1，3-二酮（Ml)
[0046] 在100mL三頸瓶中加入30mL四氫呋喃（無(wú)水處理），將NaHL2g(49mmol)投入反應(yīng) 液中，將反應(yīng)瓶置入冰浴中，控制反應(yīng)瓶中溫度1_5°C。加入異煙酸乙酯562mg(3. 72mmol)。 用15mLTHF將L7g(12. 25mmol)2-羥基-5-溴苯乙酮200mg(0. 93mmol)稀釋，使用恒壓滴 液漏斗逐滴滴加入反應(yīng)液，控制反應(yīng)瓶中溫度在1_5°C。攪拌3h后用TLC板檢測(cè)反應(yīng)，原料 消失，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液潑入冰水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6-7,有大量黃色固體析出，抽 濾，得粗品223mg，產(chǎn)率：75%。直接投下一步。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 6-溴-2- (4-吡啶基）-4H-色原酮-4-酮（M2)
[0049] 將Ml100mg，0. 31mmol加入50mL茄形瓶中，加入10mL冰醋酸，滴入1滴稀鹽 酸，反應(yīng)瓶置于油浴，油浴升溫至90°C，反應(yīng)2h。用TLC板檢測(cè)反應(yīng)，原料消失，停止反 應(yīng)。將反應(yīng)液倒入冰水中，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8-9,有白色固體析出，抽濾得粗 品。粗品經(jīng)柱層析分離（乙酸乙酯：石油醚=1 : 2)得產(chǎn)物75mg，產(chǎn)率78%。MS[M+H]+ : SOS.iH-NMRDMSO-cUS8.82(d，2H，J= 6. 12Hz，pyridine-H)，8. 14(d，lH，J= 2·43Ηζ， Ar-H) ,8. 08(d,2H,J= 6. 21Hz,pyridine-H), 8. 03 (d, 1H,J= 2. 49Hz,Ar-H), 7. 84 (d, 1H, J= 8. 91Hz,Ar-H) ,7. 34 (s, 1H).
[0050] 實(shí)施例3
[0051]N- (4-氟-3-硝基苯）丙烷-1-磺酰胺（M3)
[0052] 將2g3-硝基-4-氟苯胺（12.8mmol)放入250mL三頸瓶中，加入60mL二氯甲烷 (無(wú)水處理），加入3. 89g三乙胺（38. 4mmol)，將反應(yīng)瓶放入冰鹽浴中，使得反應(yīng)液溫度 在-5-0°C之間。將3. 83g丙磺酰氯（26. 9mmol)溶于20mL二氯甲烷中，使用恒壓滴液漏斗 逐滴加入反應(yīng)液，控制反應(yīng)液溫度不高于〇°C。待丙磺酰氯全部加入反應(yīng)液中，撤掉冰鹽浴， 常溫?cái)嚢鑜h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料消失，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液倒入150mL冰水中，用二氯甲 烷萃取3次（20mL*3)，合并有機(jī)層，減壓蒸出溶劑。將固體放入100mL單頸瓶中，加入40mL 四氫呋喃，加入1. 3g氫氧化鋰，加入5mL蒸餾水，常溫?cái)嚢?. 5h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料消失， 停止反應(yīng)。將反應(yīng)液倒入100mL冰水中，用二氯甲烷萃取3次（25mL*3)，合并有機(jī)層，減 壓蒸出溶劑。粗