鼻咽癌的新診治靶點(diǎn)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的設(shè)及鼻咽癌的新診治祀點(diǎn)及其應(yīng)用，更具體 的設(shè)及VPSll基因及其調(diào)控miRNA在診治鼻咽癌中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌（化SO地aryngealcarcinoma,NPC)是我國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之 一，其中男性發(fā)病率約是女性的兩倍，W40-50歲為該病高發(fā)期。鼻咽癌發(fā)病與遺傳因素 (遺傳易感性）、邸病毒感染、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)，早期診斷、早期治療是 挽救患者生命和提高生活質(zhì)量的最有效手段。遺憾的是，鼻咽癌起病隱匿，具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移 傾向。此外，低分化鱗狀細(xì)胞癌是鼻咽癌最為常見的病理類型，但是，單純放療后五年生存 率僅為50%左右，治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移預(yù)后很差，成為鼻咽癌治療失敗的主要原因。因此，識(shí) 別和鑒定與鼻咽癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物，爭取早期發(fā)現(xiàn)、選擇最佳治療方案、預(yù)測(cè)預(yù)后、監(jiān)測(cè) 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移對(duì)鼻咽癌診療具有重要的臨床意義。
[0003]miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。通常由 RNA聚合酶II(PolII)轉(zhuǎn)錄生成。miRNA與祀mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多 數(shù)情況下，復(fù)合物中的單鏈miRNA與祀mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，阻斷祀基因的翻譯， 從而調(diào)芐基因表達(dá)。運(yùn)種方式主要影響蛋白表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。另一種作 用方式與SiRNA類似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，Ago2蛋白通過切割mRNA直接導(dǎo) 致其降解，實(shí)現(xiàn)基因沉默。WSiRNA參與的RNAi為例：SiRNA可與RISC結(jié)合，作為模板識(shí) 別mRNA祀子，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，mRNA與SiRNA中的反義鏈結(jié)合，置換出正義鏈。雙 鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22nt左右的siRNA，SiRNA繼續(xù)同RISC 形成復(fù)合體，與SiRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。運(yùn)個(gè)過程也稱為轉(zhuǎn)錄后基 因沉默（PTG巧。
[0004] 總么當(dāng)前認(rèn)為miRNAW何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對(duì)程 度有關(guān)。miRNA與目的基因配對(duì)不完全時(shí)，miRNA就W抑制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用；miRNA 與目的基因某段序列配對(duì)完全時(shí)，就可能引起目的基因在互補(bǔ)區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另 夕KmiRNAs有時(shí)候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化，從而影響祀基因的表達(dá)。除 此外，近來發(fā)現(xiàn)快速脫腺巧酸化（accelerateddeaden^ation)是miRNA抑制基因表達(dá)的 新機(jī)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-12化和let-7能夠促進(jìn)mRNA聚腺巧酸尾己（polyA tail)的去除。用3'組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺巧酸尾己，不但可W消除miR-12化對(duì)mRNA 含量的影響，還可W降低對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用，可見miRNA能通過降低翻譯效率和聚腺巧 酸化mRNA的濃度來抑制基因表達(dá)。
[0005] 發(fā)明通過高通量測(cè)序分析鼻咽癌組織及癌旁組織，獲得其mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組信 息，經(jīng)分析篩選出選取VPSll基因和miR-363進(jìn)行巧光定量PCR驗(yàn)證及祀標(biāo)驗(yàn)證，結(jié)果顯 示，VPSll基因和miR-363與鼻咽癌密切相關(guān)，在鼻咽癌中VPSll是miR-632的祀基因。本 發(fā)明為臨床診斷及預(yù)防檢測(cè)鼻咽癌提供了新的祀點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供VPSll基因和/或蛋白在制備治療或診斷鼻咽癌試劑中的 應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控VPSll基因和/或蛋白表達(dá)的制劑在制備治療鼻咽癌 試劑中的應(yīng)用。
[0008] 進(jìn)一步，所述治療鼻咽癌試劑是指可W促進(jìn)VPSll基因的表達(dá)的試劑。本領(lǐng)域人 員熟知促進(jìn)基因的表達(dá)通?？蒞采用下述方法中的一種和/或幾種：通過DNA水平調(diào)控 VPSll基因：包括但不限于增加VPSll基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)染含VPSll基因的過表達(dá)載體；通 過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VPSll基因：包括但不限于激活VPSll基因的表達(dá)、激活調(diào)控VPSll基因 表達(dá)的啟動(dòng)子、抑制負(fù)調(diào)控VPSll基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、采用RNA干擾技術(shù)對(duì)抑制VPSll基 因表達(dá)的抑制子進(jìn)行干擾；通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VPSll基因：包括但不限于抑制促進(jìn)VPSll 基因mRNA降解的microRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)、導(dǎo)入促進(jìn)VPSll基因表達(dá)的microRNA;通過翻譯后水 平調(diào)控VPSll基因：包括但不限于導(dǎo)入促進(jìn)VPSll基因編碼蛋白的分子、抑制負(fù)調(diào)控VPSll 基因表達(dá)的蛋白、促進(jìn)VPSll基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0009] 優(yōu)選的，所述的治療鼻咽癌試劑中含有促進(jìn)VPSll基因表達(dá)的載體。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)VPSll基因和/或蛋白的制劑在制備診斷鼻咽癌試劑 中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步，所述診斷鼻咽癌試劑包括用巧光定量PCR方法、基因忍片方法檢測(cè)鼻咽 癌中VPSll基因的表達(dá)。
[0012] 所述的用于巧光定量PCR方法檢測(cè)鼻咽癌中VPSll基因的產(chǎn)品含有一對(duì)特異性擴(kuò) 增VPSll基因的引物；所述的基因忍片包括與VPSll基因的核酸序列雜交的探針。
[0013] 進(jìn)一步，所述的鼻咽癌的診斷制劑包括用免疫方法檢測(cè)VPSll蛋白的表達(dá)。優(yōu)選 所述免疫檢測(cè)方法檢測(cè)鼻咽癌中VPSll蛋白表達(dá)的為westernblot和/或化ISA和/膠 體金檢測(cè)方法。
[0014] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)VPSll蛋白的化ISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的VPSll單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被VPSll單克隆 抗體的固相載體，酶標(biāo)二抗，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗涂液，酶反應(yīng)終 止液等。
[0015] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)VPSll蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的VPSll單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T)噴點(diǎn)有抗 VPSll單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)鼻咽癌的巧光定量PCR試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒檢測(cè)基因VPS11，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO. 4， 下游引物序列為SEQIDNO. 5。
[0017] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型巧光定量基因擴(kuò)增儀， 靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[001引進(jìn)一步，上述巧光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、巧光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO. 4， 下游引物序列為SEQIDNO. 5。所述內(nèi)參引物為0-actin內(nèi)參引物。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供VPSll基因和/或蛋白的調(diào)控miRNA在制備預(yù)防、診斷和 /或治療鼻咽癌試劑中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)VPSll基因和/或蛋白的調(diào)控miRNA制劑在制備診斷 鼻咽癌試劑中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供調(diào)節(jié)VPSll基因和/或蛋白的調(diào)控miRNA試劑在制備治療 鼻咽癌試劑中的應(yīng)用。
[0022] 所述的調(diào)控miRNA為mir-632和/或miR-632。mir-632的序列見序列表沈QID NOl;mir-632的成熟miRNA為miR-632序列見序列表沈QIDNO2。
[0023] 進(jìn)一步，所述的預(yù)防、診斷鼻咽癌試劑包括基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量 PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)鼻咽癌樣本中mir-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄或基 于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)鼻咽癌樣本中miR-632調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用nodhern 雜交方法、miRNA表達(dá)譜忍片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)鼻咽癌樣本中mir-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄；采用ELISA和/或膠體金試紙 條檢測(cè)鼻咽癌樣本中miR-632調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況。優(yōu)選所述miR-632調(diào)控的祀基 因?yàn)镋NPP4,PDZD2,ATP1A2,TMEM9B，ARHGAP11A，MSLN，CR1，CRY2,MAPK14,CTNS，ADRA2A， SWAP70,TMEM184B，S肥D1，KCNJ16,PLAC8,PGK1，P0U2AF1，SMPD3,RBM38,VPS11，化SCR4， SGTA，ST6GAL1，SMPDl，ClOorfSl,ITIH5,LIMD2,JHDM1D，EIF3J，MS4A1，CD22,SPAG6,CD40LG， MRPL19,更優(yōu)選的miR-632調(diào)控的祀基因?yàn)閂PS11。
[0024] 優(yōu)選的，所述的基于定量PCR方法包括特異性擴(kuò)增mir-632和/或miR-632的引 物，進(jìn)一步優(yōu)選，特異性擴(kuò)增miR-632引物序列為SEQIDNO3;所述的基于探針雜交方法 包括與mir-632和/或miR-632的核酸序列雜交的探針；所述免疫檢測(cè)方法包括與miR-632 調(diào)控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體。
[00巧]進(jìn)一步，所述的治療鼻咽癌的試劑為下調(diào)mir-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄和/或 阻斷miR-632的活性的試劑。
[0026]優(yōu)選的，采用反義寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海綿、miRNAlasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核巧酸的方法下調(diào)mi;r-632和/或miR-632的轉(zhuǎn)錄和/或阻 斷miR-632的活性。
[0027] 本發(fā)明的目的還在于提供一種