專(zhuān)利名稱(chēng)：干擾ev71病毒的新靶點(diǎn)及其小干擾rna和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于EV71病毒復(fù)制抑制技術(shù)領(lǐng)域，涉及干擾EV71病毒的新靶點(diǎn)及其小干擾RNA和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員，其感染性強(qiáng)，致病性高，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)有過(guò)十幾次大的爆發(fā)和流行，且引起越來(lái)越嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重危害嬰幼兒的生命健康，被喻為21世紀(jì)的脊髓灰質(zhì)炎。目前臨床缺乏抑制病毒的特異性藥物，尋求新的藥物治療手段已成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的熱點(diǎn)。病毒為嚴(yán)格活細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，故抗病毒藥物必須進(jìn)入細(xì)胞，并能選擇性作用于病毒，但實(shí)際上，病毒的復(fù)制過(guò)程與宿主細(xì)胞的生物合成過(guò)程相似，兩者難以區(qū)分，故很難獲得能殺死或抑制病毒而又不影響細(xì)胞的藥物?！NA干擾技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)選擇毒性提出了可能，為抗病毒研究提供了新思路。RNA干擾是RNA序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。由小干擾RNA(small interfering RNA, si RNA)的反義鏈指導(dǎo)形成的RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物在siRNA引導(dǎo)下與互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，降解靶基因mRNA，有效特異性的抑制靶基因的表達(dá)。與以往抗病毒治療的手段相比，RNA干擾技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)RNA干擾介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)具有高度的特異性，對(duì)非同源基因表達(dá)幾乎沒(méi)有影響，因此可將不良反應(yīng)降到最?。籖NA干擾能高效抑制病毒復(fù)制，少量的siRNA就可達(dá)到降低病毒表達(dá)產(chǎn)物的作用；RNA干擾可以針對(duì)病毒基因組保守區(qū)域發(fā)揮作用，從而在一定程度上限制了病毒產(chǎn)生逃避突變株的能力。因此，RNA干擾所具有的對(duì)靶基因沉默作用特異性、高效性、穩(wěn)定性以及不改變宿主基因組等特性，為RNA干擾在抗病毒治療中的應(yīng)用提供了可能，并決定了其用于治療疾病時(shí)可以出現(xiàn)藥效強(qiáng)、不良反應(yīng)小的特性。設(shè)計(jì)合成靶向EV71病毒基因組的siRNAs將可能成為抑制EV71病毒感染的有效途徑。EV71病毒基因組是由約7408個(gè)核苷酸組成的單股正鏈RNA，基因組RNA也是翻譯前蛋白的mRNA模板，因此特別適合RNA干擾的治療。選擇合適的siRNA靶點(diǎn)是抗病毒治療關(guān)鍵一步。在RNA干擾治療EV71病毒的國(guó)內(nèi)外研究中，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用RNA干擾有效地阻止了病毒的復(fù)制，報(bào)道了 EV71病毒基因組中VP1、3D、3C、2C、3’ -非翻譯區(qū)的有效靶序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供干擾EV71病毒的新靶點(diǎn)及其小干擾RNA和應(yīng)用，在EV71病毒基因組保守的5’-非翻譯區(qū)尋找出新的靶點(diǎn)，并針對(duì)該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小干擾RNA，可應(yīng)用于EV71病毒復(fù)制的抑制。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)，包括下列區(qū)域EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第115 133nt的區(qū)域；EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第648 666nt的區(qū)域。
所述的用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列為cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列為cagagcaattgtttaccta。所述的用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)作為設(shè)計(jì)小干擾RNA所針對(duì)的靶點(diǎn)的應(yīng)用。所述小干擾RNA用于抑制EV71病毒復(fù)制，包括針對(duì)兩個(gè)區(qū)域其中之一小干擾RNA或者為兩者的混合。一種干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA，包括正義鏈和反義鏈，其正義鏈序列為cagcaaacca cgaucaauat t,反義鏈序列為uauugaucgu gguuugcugt t ；或者其正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為uagguaaacaauugcucugt t。所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA對(duì)抑制EV71病毒復(fù)制的應(yīng)用。 所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA在制備抑制EV71病毒復(fù)制的藥物的制備的應(yīng)用。所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA是在經(jīng)過(guò)修飾或結(jié)合于轉(zhuǎn)運(yùn)載體之后應(yīng)用于抑制EV71病毒復(fù)制的藥物的制備，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括細(xì)胞穿透性多肽、細(xì)胞靶向性配體、納米顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)，是EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的兩個(gè)新的有效靶點(diǎn)，由于5’ -非翻譯區(qū)在病毒復(fù)制中的重要性和其高度保守的特性，使其可能具有更廣譜及有效的抗病毒作用，而且5’ -非翻譯區(qū)靶點(diǎn)的提供及針對(duì)其設(shè)計(jì)的小干擾RNA，使得與針對(duì)基因組編碼區(qū)設(shè)計(jì)的其他有效siRNAs聯(lián)合應(yīng)用抑制可能存在的病毒新的突變株或多株EV71成為可能。進(jìn)一步，本發(fā)明針對(duì)兩個(gè)新的靶點(diǎn)分別提供了小干擾RNA，轉(zhuǎn)染到EV71敏感的RD細(xì)胞后，接種EV71病毒，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變，結(jié)果表明兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNAs能夠延緩及減輕EV71病毒感染致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect, CPE)。同時(shí)這兩對(duì)小干擾RNA能夠顯著降低感染細(xì)胞EV71 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，能夠顯著降低感染細(xì)胞釋放子代病毒。另外，隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加，抑制EV71病毒感染和復(fù)制作用逐漸增強(qiáng)。針對(duì)所提供的新的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的siRNAs能夠抑制EV71病毒的復(fù)制，既表明了所篩選的靶點(diǎn)的有效性又表明了所設(shè)計(jì)的siRNAs具有針對(duì)病毒基因組的分子治療的前景，而且所設(shè)計(jì)的小干擾RNA具有高效、特異、低毒及具有量效關(guān)系的特性，從而可應(yīng)用于抑制病毒復(fù)制的藥物的制備。當(dāng)然也不排除針對(duì)所提供的靶點(diǎn)進(jìn)行RNA干擾，設(shè)計(jì)出其他形式的siRNA或shRNA等對(duì)抑制病毒所具有的效果。


圖I是熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的siRNA的轉(zhuǎn)染。圖2是siRNA對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性分析圖。圖3是siRNA對(duì)EV71病毒感染致CPE的抑制作用。
圖4是siRNA對(duì)感染細(xì)胞EV71 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平影響。圖5-1是siRNA對(duì)EV71感染細(xì)胞上清空斑形成的影響；圖5-2是不同濃度siRNA對(duì)EV71感染細(xì)胞上清病毒滴度的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I、細(xì)胞培養(yǎng)和病毒株來(lái)源人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Rhabdomyosarcoma，RD)為EV71敏感的宿主細(xì)胞，由西安市疾病控制中心惠贈(zèng)，常規(guī)生長(zhǎng)在含10%胎牛血清(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的DMEM 培養(yǎng)基中。EV71病毒株來(lái)自臨床分離樣本(GenBank accession No. HM003207. I),由西安市疾病控制中心惠贈(zèng)，病毒在RD細(xì)胞上增殖，-80°C保存。2、靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNA序列的設(shè)計(jì)選擇合適的siRNA靶點(diǎn)是抗病毒治療關(guān)鍵一步。EV71病毒基因組中5’ -非翻譯區(qū)含有約742個(gè)核苷酸(其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示)，它通常折疊成多個(gè)特異性的空間結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)通過(guò)與宿主細(xì)胞蛋白因子的結(jié)合在起始病毒基因組mRNA的合成以及病毒蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，5’ -非翻譯區(qū)還涉及病毒基因的宿主范圍以及毒力等多個(gè)方面的功能。尤其重要的是，5’ -非翻譯區(qū)在不同的EV71病毒株中高度保守。鑒于5’ -非翻譯區(qū)的保守性及在病毒復(fù)制中的重要作用，針對(duì)5’ -非翻譯區(qū)的siRNAs可能具有更廣譜及有效的抗病毒作用，故以5’ -非翻譯區(qū)作為靶點(diǎn)的篩選區(qū)域。另外，EV71病毒感染周期短，RNA干擾不必要長(zhǎng)期發(fā)生作用，以免發(fā)生非特異性不利影響，化學(xué)合成的siRNA用于抑制EV71病毒復(fù)制是一個(gè)很好的策略，且siRNA簡(jiǎn)單，適合進(jìn)一步化學(xué)修飾應(yīng)用于體內(nèi)。靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNA序列設(shè)計(jì)綜合考慮RNA靶點(diǎn)可行性、雙鏈siRNA熱力學(xué)特性、siRNA設(shè)計(jì)原則等，應(yīng)用siRNA設(shè)計(jì)軟件及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(http://sfold. wadsworth. org/cgi-bin/sirna.pi and http://www. genebee. msu.su/services/na2_reduced. html),同時(shí)考慮針對(duì) HM003207. I 設(shè)計(jì)的 siRNA 與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中近5年來(lái)發(fā)布的具有全基因序列的中國(guó)流行的EV71病毒株對(duì)應(yīng)序列的核苷酸同源性，應(yīng)用DNAStar program進(jìn)行比對(duì),篩選出EV71基因組5’ -非翻譯區(qū)的兩個(gè)祀點(diǎn)區(qū)域EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第115 133nt的區(qū)域；EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第648 666nt的區(qū)域。并分別針對(duì)這兩個(gè)區(qū)域合成兩對(duì)siRNA (siRNA-U siRNA_2)，其中siRNA_l針對(duì)第115 133nt的區(qū)域,其雙鏈序列如下正義鏈序列為 :cagcaaacca cgaucaauat t，反義鏈序列為uauugaucgugguuugcugt t ;siRNA_2 針對(duì)第 648 666nt 的區(qū)域，其雙鏈序列如下正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為 uagguaaaca auugcucugt t ；
將siRNA-2序列打亂,設(shè)計(jì)scrambled-siRNA(scr)作為陰性對(duì)照。同時(shí)將siRNA_2進(jìn)行FAM標(biāo)記(si-2FAM)了解轉(zhuǎn)染情況,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。所有siRNAs均用BLAST (www. ncbi.nlm. nih. gov/BLAST)確認(rèn)其特異性，排除與人及鼠基因的同源性。上述所有的siRNAs均按序列合成，具體委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。3、SiRNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞條件的優(yōu)化利用熒光檢測(cè)及流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，以帶有FAM標(biāo)記的si_2FAM來(lái)了解轉(zhuǎn)染情況，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。RD細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)為3. 2 X IO5/孔接種于6孔板，24小時(shí)后待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70 80%時(shí)進(jìn)行 siRNA 的轉(zhuǎn)染。將不同濃度(25、50、100nM)的 si_2FAM 和 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)轉(zhuǎn)染 RD 細(xì)胞，具體操作按 Lipofectamine 2000 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另外設(shè)僅用si-2FAM處理，未加入Lipofectamine 2000的RD細(xì)胞作為對(duì)照。 在siRNA轉(zhuǎn)染后5h，換2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后6h細(xì)胞用PBS洗兩次，熒光顯微鏡觀察si-2FAM的位置及濃度不同所引起的熒光變化。熒光觀察完成后，用0. 25%胰酶消化RD細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，0. 5ml固定液固定后流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記細(xì)胞的比例以精確測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后6h，F(xiàn)AM標(biāo)記的si_2FAM在RD細(xì)胞漿中可見(jiàn)，隨著si_2FAM濃度的增加，si-2FAM在RD細(xì)胞中的量相應(yīng)增加；而未加入Lipofectamine 2000，僅用si_2FAM處理的對(duì)照組未觀察到熒光(熒光觀察結(jié)果如圖I中的A部分所示)。這表明在無(wú)轉(zhuǎn)染試劑的存在下siRNA不能單獨(dú)轉(zhuǎn)染到RD細(xì)胞中，siRNA成功轉(zhuǎn)染到RD細(xì)胞需要轉(zhuǎn)染試劑的參與。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖I中的B部分所示，RD細(xì)胞轉(zhuǎn)染25nM、50nM、IOOnM的si-2FAM,轉(zhuǎn)染效率分別為 79. 47±1. 79%,87. 73±2. 67%,97. 17±0. 86%。故選擇 50nM 和IOOnM siRNA 用于 RNA 干擾。4、siRNA對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性RD細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)為I. 6 X IO4/孔接種于96孔板，24h后待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70 80%時(shí)轉(zhuǎn)染IOOnM濃度的siRNA-1、siRNA-2，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h顯微鏡下觀察RD細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，然后每孔加入 MTT 溶液(5mg/ml; Sigma, St. Louis, Mo, USA) 20ul, 37°C孵育 4h 后,小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150ulDMS0，振蕩lOmin，選擇570nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值。MTT法檢測(cè)吸光值，結(jié)果如圖2所示，在不同的時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)，兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNAs轉(zhuǎn)染組MTT檢測(cè)獲得的吸光值均與未轉(zhuǎn)染siRNA的對(duì)照組(mock)沒(méi)有明顯差別，表明siRNA轉(zhuǎn)染組的活細(xì)胞數(shù)與未轉(zhuǎn)染siRNA的mock組沒(méi)有明顯差別，即高劑量的siRNA未影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及生存，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。5、SiRNA轉(zhuǎn)染和病毒感染RD細(xì)胞于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%_90%，胰酶消化后加含10%胎牛血清、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基，以細(xì)胞數(shù)為8 X IO4/孔接種于24孔板，24小時(shí)后待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換為500ml Opti-MElVf' (Gibco BRL, Grand Island, NY，USA)，然后不同量的siRNA (30pmol、60pmol)分別稀釋于50ul的Opti-IVIEIVTv，在另一只試管中Iul的Lipofectamine 2000也稀釋于50ul的Opti-MEMK'中，室溫下孵育5分鐘后，將兩種溶液輕輕混合，室溫下孵育20分鐘,使siRNA:LipofectamineTM2000復(fù)合物形成,后每孔加IOOul的混合物，通過(guò)輕柔前后搖晃培養(yǎng)板混和搖均，使最終siRNA的濃度為50nM或lOOnM。scr 組轉(zhuǎn)染 scrambled-siRNA。mock 組除未加 siRNA,—切同前。轉(zhuǎn)染后5h，每孔接種EV71病毒稀釋液(MOI=O. 01)，吸附I小時(shí)后棄病毒稀釋液，加入500ul含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)觀察細(xì)胞病變，注意有無(wú)胞體圓縮、折光特性改變、間隙明顯、聚集、脫落等病毒感染特征。收集細(xì)胞裂解物及上清，-80°C保存?zhèn)錂z。感染后24小時(shí)，未轉(zhuǎn)染SiRNA的mock組細(xì)胞及scr轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、折光度增強(qiáng)；siRNA-l、siRNA-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。感染后36小時(shí)，50nM濃度的siRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表現(xiàn)出輕微的CPE。感染后48小時(shí)的觀察結(jié)果如圖3所示，IOOnM的siRNA-1、siRNA-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表現(xiàn)出減輕或輕微的CPE，而mock組細(xì)胞及scr轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)完全的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、折光度增強(qiáng)、間隙明顯、聚集、脫落。siRNA-1能夠延緩EV71病毒感染致CPE至感染后36小時(shí)。siRNA_2能夠延緩EV71·病毒感染致CPE至感染后48小時(shí)。兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’-非翻譯區(qū)的siRNAs作用持續(xù)時(shí)間均達(dá)感染后72小時(shí)。siRNA-2對(duì)EV71病毒感染致CPE的抑制作用強(qiáng)于siRNA-1。另外，隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加，EV71病毒感染致CPE明顯減輕。兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNA能夠延緩及減輕EV71病毒感染致CPE。6、siRNA對(duì)感染細(xì)胞EV71mRNA的轉(zhuǎn)錄水平影響6. IRNA的提取及定量EV71感染后36h，24孔板中各組細(xì)胞用PBS洗后，每孔加入150ulCelLytic MCell Lysis Reagent (Sigma, St. Louis, Mo, USA),收集樣本后米用Ql Aamplv Viral RNAMini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)提取病毒 RNA。具體操作如下a、吸取 560ul 含有carrier RNA的buffer AVL至1.5ml離心管中；b、將離心后樣本加入至裝有bufferAVL-carrier RNA的離心管中，充分混勻，室溫(15°C _25°C)放置lOmin，后瞬時(shí)離心；c、樣本中加入560ul無(wú)水乙醇，充分混勻，后瞬時(shí)離心；d、吸取630ul上步中的液體小心的加入到column (已放入2ml收集管中),蓋上蓋子，8000rpm離心lmin,將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管；e、小心打開(kāi)column的蓋子,重復(fù)第6步；f、小心打開(kāi)column的蓋子，加入500ul buffer AWl,蓋上蓋子,8000rpm離心lmin,將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管；g、小心打開(kāi)column的蓋子,加入500ul buffer AW2,蓋上蓋子，14000rpm離心3min ;h、將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管，14000rpm離心lmin ;i、將column放入I. 5ml離心管中，棄去舊的收集管,小心的打開(kāi)column,加入60ul室溫的buffer AVE,蓋上蓋子，室溫放置lmin，8000rpm離心lmin洗脫病毒RNA。RNA定量時(shí)將提取的RNA用DEPC處理水進(jìn)行稀釋?zhuān)贤夥止夤舛葍x測(cè)定0D260、0D280值，計(jì)算RNA濃度。6. 2逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增米用腸道病毒71型核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(Suoao BiomedtechCo. Ltd. , Beijing, China)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及 PCR 擴(kuò)增。試劑盒中包含
上游引物5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCACT-3' (2366-2386)下游引物5'-ATCTGCCACCCTATCTCCCT-3' (2436-2455)及TaqMan probe 5 ' -FAM-TGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGC-TAMRA-3，(2396-2420)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，向反應(yīng)管中每管加入7ul EV71-RT MIX、2ul RNA、lul逆轉(zhuǎn)錄酶，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽中，在PCR儀上進(jìn)行以下逆轉(zhuǎn)錄操作42°C 30min,后98°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。接下來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。向反應(yīng)管中每管加入20ul EV71-PCR MIX、2ul Taq酶系、3ul處理后樣本或10倍系列稀釋EV71-陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽中，循環(huán)條件94°C 2min,后93°C 30s, 55°C 45s, 40個(gè)循環(huán)。利用10倍系列稀釋EV71-陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量EV71 RNA。50nM、IOOnM濃度的siRNA-1轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染siRNA的mock組相比，感染細(xì)胞EV71 RNA 水平為 29. 72±1. 72%、17. 64±2. 03% (圖 4)。50nM、IOOnM 濃度的 siRNA-2 轉(zhuǎn)染組與mock 組相比，感染細(xì)胞 EV71 RNA 水平僅為 16. 84±2. 30%、6. 80± I. 04% (圖 4)。siRNA-2抑制感染細(xì)胞EV71 RNA的作用優(yōu)于siRNA-1 (圖4)。隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加，感染細(xì)胞EV71RNA水平明顯下降(#p〈0. 05)(圖4)。兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’-非翻譯區(qū)的siRNA能夠顯著降低感染細(xì)胞EV71 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(± p<0. 05)(圖4)。7、空斑形成實(shí)驗(yàn)
為了解SiRNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)抑制EV71病毒的復(fù)制是否影響子代病毒的釋放，病毒感染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞上清，稀釋至10_4進(jìn)行空斑形成實(shí)驗(yàn)，測(cè)定病毒滴度。RD細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)成單層，每孔加入500ul稀釋至10_4的各組細(xì)胞上清，吸附I小時(shí)后棄孔內(nèi)稀釋液，每孔加入3ml含1%甲基纖維素的DMEM維持液，37°C培養(yǎng)3天后小心吸棄孔內(nèi)液體，福爾馬林固定后，1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)空斑。siRNA-l、siRNA_2轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染SiRNA的mock組相比，能夠明顯減少空斑形成，而且siRNA-2作用優(yōu)于siRNA-1，結(jié)果如圖5_1所示。隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加，病毒滴度降低(#P〈0. 05)，兩對(duì)靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的siRNAs能夠減少感染細(xì)胞釋放子代病毒，抑制空斑形成，顯著降低感染細(xì)胞上清病毒滴度(* P<0. 05)，結(jié)果如圖5-2所示。空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與siRNAs對(duì)感染細(xì)胞EV71 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平影響一致。鑒于上述兩對(duì)siRNAs均能夠延緩及減輕EV71病毒所致CPE，能夠降低EV71病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以及減少感染細(xì)胞釋放子代病毒，抑制病毒的復(fù)制，表現(xiàn)出抗病毒作用，那么這兩對(duì)siRNAs就能夠應(yīng)用于抑制EV71病毒復(fù)制、尤其是應(yīng)用于抑制EV71病毒復(fù)制的藥物的制備?？紤]到藥物的制備時(shí)制劑的要求，進(jìn)一步在保留其序列的特異性的基礎(chǔ)上對(duì)siRNAs進(jìn)行修飾或結(jié)合于轉(zhuǎn)運(yùn)載體,通過(guò)不同形式的修飾或轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到提高siRNA的穩(wěn)定性、減少脫靶效應(yīng)以及免疫刺激反應(yīng)、提高SiRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，產(chǎn)生更穩(wěn)定和更強(qiáng)的RNA干擾效果，更好的應(yīng)用于體內(nèi)。一般來(lái)講，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括細(xì)胞穿透性多肽、細(xì)胞靶向性配體、納米顆粒。具體的修飾方式或轉(zhuǎn)運(yùn)載體的選擇可根據(jù)制劑的要求或效果來(lái)確定。進(jìn)一步，出于對(duì)病毒多靶點(diǎn)干擾的考慮，在制備抑制EV71病毒復(fù)制的藥物時(shí)是將siRNA-1、siRNA-2混合，從而達(dá)到更廣譜的病毒干擾作用。
在上述兩對(duì)siRNAs對(duì)抑制EV71病毒所表現(xiàn)的作用下，由于5’ -非翻譯區(qū)在病毒復(fù)制中的重要性和其高度保守的特性，那么其所針對(duì)的兩個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域就成為了干擾EV71病毒復(fù)制的有效的靶點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)，其特征在于，包括下列區(qū)域 EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第115 133nt的區(qū)域； EV71病毒基因組5’ -非翻譯區(qū)的第648 666nt的區(qū)域。
2.如權(quán)利要求I所述的用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列為cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列為cagagcaatt gtttaccta。
3.權(quán)利要求I所述的用于干擾EV71病毒復(fù)制的靶點(diǎn)作為設(shè)計(jì)小干擾RNA所針對(duì)的靶點(diǎn)的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述小干擾RNA用于抑制EV71病毒復(fù)制，包括針對(duì)兩個(gè)區(qū)域其中之一小干擾RNA或者為兩者的混合。
5.一種干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA，其特征在于，包括正義鏈和反義鏈，其正義鏈序列為cagcaaacca cgaucaauat t,反義鏈序列為uauugaucgu gguuugcugt t ； 或者其正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為uagguaaacaauugcucugt t。
6.權(quán)利要求5所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA對(duì)抑制EV71病毒復(fù)制的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA在制備抑制EV71病毒復(fù)制的藥物的制備的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的干擾EV71病毒復(fù)制的小干擾RNA是在經(jīng)過(guò)修飾或結(jié)合于轉(zhuǎn)運(yùn)載體之后應(yīng)用于抑制EV71病毒復(fù)制的藥物的制備，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括細(xì)胞穿透性多肽、細(xì)胞靶向性配體、納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了干擾EV71病毒的新靶點(diǎn)及其小干擾RNA和應(yīng)用，所述的靶點(diǎn)包括下列區(qū)域EV71病毒基因組的5’-非翻譯區(qū)的第115～133nt的區(qū)域；EV71病毒基因組的5’-非翻譯區(qū)的第648～666nt的區(qū)域。針對(duì)兩個(gè)新的靶點(diǎn)分別提供了小干擾RNA，對(duì)其轉(zhuǎn)染到RD細(xì)胞后，接種EV71病毒，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變，結(jié)果表明兩對(duì)靶向EV71基因組5’-非翻譯區(qū)的siRNAs能夠延緩及減輕EV71感染致CPE。由于5’-非翻譯區(qū)在病毒復(fù)制當(dāng)中的必要性和其高度保守的特性，使得該對(duì)靶點(diǎn)具有更廣譜及有效的抗病毒作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102796734SQ20121016238
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者張國(guó)成, 鄧軍霞, 徐志凱, 雷迎峰, 聶曉晶, 許東亮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)