LSECtin作為黑色素瘤免疫治療的靶點(diǎn)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及LSECtin作為黑色素瘤免疫治療的祀點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素瘤是由異常黑素細(xì)胞過度增生引發(fā)的常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占 皮膚腫瘤死亡病例的極大部分。多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見于軟腦膜和脈絡(luò)膜。 其發(fā)病率隨人種、地域，種族的不同而存有所差異，白種人的發(fā)病率遠(yuǎn)較黑種人高，居住在 澳大利亞昆±蘭州的白種人其發(fā)病率高達(dá)17/10萬，我國雖屬黑色素瘤的低發(fā)區(qū)，但近年 來發(fā)病率卻呈不斷上升趨勢。
[0003] 目前對于黑色素瘤的治療手段主要包括；原發(fā)病灶的手術(shù)切除、放療、化療W及免 疫治療。其中免疫治療手段是近年來逐步發(fā)展起來的治療黑色素瘤的有效手段。腫瘤免疫 學(xué)治療的目的是激發(fā)或調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和 殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤免疫學(xué)治療的方法種類繁多，已與現(xiàn)代生物高科技技術(shù)結(jié)合，發(fā)展成為 繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式一腫瘤生物學(xué)治療方法。腫瘤免疫治療手 段也包括多種策略；（1)主動免疫；給機(jī)體輸入具有抗原性的腫瘤疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異 性抗腫瘤免疫，W達(dá)到治療腫瘤、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的；（2)免疫導(dǎo)向療法；將具有 細(xì)胞毒作用的殺傷因子與單克隆抗體偶聯(lián)制成"生物導(dǎo)彈"，并利用單抗能特異性結(jié)合腫瘤 抗原的特性使殺傷因子"導(dǎo)向"集中到腫瘤病灶，殺傷腫瘤細(xì)胞；（3)腫瘤過繼免疫療法；將 自身或異體的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體外采用IL-2、抗CD3單抗，特異性多膚等激 活劑進(jìn)行誘導(dǎo)、激活和擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，提高患者抗腫瘤免疫力，W達(dá)到治療和 預(yù)防復(fù)發(fā)的目的；（4)細(xì)胞因子療法：該療法是近期隨著高純化或重組細(xì)胞因子的生產(chǎn)得 W實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞因子療法的原理是某些細(xì)胞因子注射體內(nèi)后可調(diào)節(jié)、增強(qiáng)一種或多種免疫細(xì) 胞的功能，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤免疫功能。目前臨床常用的細(xì)胞因子有IL-2、TNF-a、IFN-g及 CSF等；（5)腫瘤的基因療法；其原理是克隆某些可用于腫瘤治療的目的基因，將目的基因 在體外轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，然后回輸體內(nèi)，或直接將目的基因體內(nèi)注射，使目的基因在體內(nèi)有效 表達(dá)，增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤作用或改善腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。
[0004] 近年來，腫瘤的主動免疫策略應(yīng)用較為廣泛，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（抑A) 2011年批準(zhǔn)了CTLA4的抗體（Ipilimumab)用于治療黑色素瘤患者。CTLA4是T細(xì)胞表面 的具有抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)功能的跨膜分子，針對該一祀點(diǎn)的單克隆抗體，能夠激活病人 的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而減緩黑色素瘤的疾病進(jìn)程。因?yàn)镃TLA4具有非常重要的生理功能， 導(dǎo)致該一藥物在治療過程中有比較大的毒副作用。
[0005]LSECtin化iverSinusoidalElndothelialCellslectin)是II型跨膜糖蛋白，位 于人類19pl3. 3,是C型凝集素家族的新成員。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供抑制LSECtin活性的物質(zhì)的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了抑制LSECtin活性的物質(zhì)在制備具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一 種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：
[0008]a)治療腫瘤或者抑制腫瘤生長；
[0009]b)促進(jìn)腫瘤患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)；
[0010] C)促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-Y;
[0011] 所述LSECtin為如下（1)或（2);
[0012] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0013] (2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述抑制LSECtin活性的物質(zhì)為抗LSECtin抗體或小分子抑制劑。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述抗LSECtin抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；所述抗LSECtin抗 體具體為多克隆抗體，所述多克隆抗體具體為兔抗鼠LSECtin多克隆抗體。
[0016] 上述應(yīng)用中，所述廣品為藥品；
[0017] 所述腫瘤為黑色素瘤。
[0018]LSECtin或其編碼基因或含有LSECtin編碼基因的重組載體在制備促進(jìn)腫瘤生長 產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0019]所述LSECtin為如下（1)或（2);
[0020] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0021] (2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0022] 上述應(yīng)用中，所述LSECtin編碼基因的核巧酸序列為序列表中的序列2。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述促進(jìn)腫瘤生長通過如下1) -3)中至少一種實(shí)現(xiàn)：
[0024] 1)抑巧IJ腫瘤特異性T細(xì)胞的增殖；
[00巧]2)增長腫瘤特異性T細(xì)胞的細(xì)胞周期；
[0026] 3)抑制腫瘤特異性T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-Y。
[0027] 上述應(yīng)用中，所述增長腫瘤特異性T細(xì)胞的細(xì)胞周期為使腫瘤特異性T細(xì)胞細(xì)胞 周期的G1期到S期的時間增長；
[0028] 所述使腫瘤特異性T細(xì)胞細(xì)胞周期的G1期到S期的時間增長體現(xiàn)在抑制CDK2、 CDK4和/或CDK6的表達(dá)和/或促進(jìn)P21的表達(dá)。
[0029] 上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物；
[0030] 所述腫瘤為黑色素瘤。
[0031]LSECtin作為腫瘤免疫治療的祀點(diǎn)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0032] 或LSECtin作為祀點(diǎn)在篩選、開發(fā)和/或設(shè)計預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述LSECtin的氨基酸序列為序列表中的序列1;
[0033] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤具體為黑色素瘤。
[0034] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明；（1)黑色素瘤病人的腫瘤組織表達(dá)LSECtin;(2)小鼠黑色 素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞表達(dá)LSECtin;(3)B16細(xì)胞表達(dá)的LSECtin促進(jìn)小鼠黑色素瘤的生 長，該一功能依賴于T細(xì)胞的存在；（4)B16細(xì)胞表達(dá)的LSECtin抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的 增殖和效應(yīng)功能。因此，本發(fā)明證明抑制LSECtin的活性的物質(zhì)可W用于制備預(yù)防和/或 治療黑色素瘤的藥品，而作為腫瘤免疫治療的祀點(diǎn)；LSECtin在篩選、開發(fā)和/或設(shè)計預(yù)防 和/或治療黑色素瘤產(chǎn)品。本發(fā)明具有較大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。
【附圖說明】
[00巧]圖1為檢測黑色素瘤病人腫瘤組織LSECtin的表達(dá)。
[0036] 圖2為檢測小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞LSECtin的表達(dá)。
[0037] 圖3為判定B16-mock和B16-LSECtin穩(wěn)定株體外生長結(jié)果圖。
[0038] 圖4為野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin細(xì)胞之后的腫瘤生長情況。
[0039] 圖5為野生型小鼠免疫B16細(xì)胞后注射anti-LSECtin之后的腫瘤生長情況。
[0040] 圖6為抗體清除小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的結(jié)果。
[00川圖7為清除小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞之后，野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin細(xì)胞之后的腫瘤生長情況。
[0042] 圖8為LSECtin在體外抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的增殖。
[0043] 圖9為LSECtin在體外劫持腫瘤特異性T細(xì)胞的細(xì)胞周期。
[0044] 圖10為LSECtin在體外抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的效應(yīng)功能。
[0045] 圖11為LSECtin在體內(nèi)抑巧IJ腫瘤特異性T細(xì)胞的效應(yīng)功能。
[0046] 圖12為LSECtin促進(jìn)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞干擾素-Y的分泌情況。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]C57化/6小鼠；體重20 + 2克，6-8周，購自華