恒河猴肝癌模型、恒河猴肝癌細(xì)胞株及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種恒河猴肝癌模型、恒河猴肝癌細(xì)胞株及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌，即肝細(xì)胞癌化patocellularcarcinoma,肥C，是肝臟常見的惡性腫瘤，每年 新診病例達(dá)70萬，僅2012年全球肝癌新發(fā)病例為78. 2萬，死亡病例為74. 6萬，目前因其 治療措施十分有限，肝癌嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。目前中國內(nèi)地肝癌發(fā)病已位居消化 道惡性腫瘤死亡率之首，發(fā)病人數(shù)占全球的55 %，死亡人數(shù)為全球的45%。如何提升肝癌 的診治水平、提高患者的生活質(zhì)量是肝癌防治研究中急需解決的根本問題。肝癌動物模型， 尤其是能更好預(yù)測臨床療效的肝癌動物模型是肝癌診斷、治療新措施、新技術(shù)及抗癌新藥 的研發(fā)成功的關(guān)鍵。迄今，有關(guān)腫瘤基礎(chǔ)研究和抗腫瘤新藥療效評價(jià)的體內(nèi)試驗(yàn)研究都是 用曬齒動物模型，包括免疫健全小鼠的可移植性同種動物模型和免疫缺陷或基因工程小鼠 人體腫瘤可移植異種動物模型。雖然曬齒動物腫瘤模型為腫瘤基礎(chǔ)研究和抗腫瘤新藥療 效評價(jià)付出了巨大貢獻(xiàn)，在相關(guān)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但仍然存在許多缺陷，如：荷瘤動物存 活時(shí)間短，不適用于長時(shí)觀察；小動物對外科手術(shù)、放療等耐受差，不適用于連續(xù)動態(tài)觀察； 所荷腫瘤組織小，不適宜活檢動態(tài)觀察等。Smith等總結(jié)了雜猴、其他靈長類動物、狗和大鼠 藥物代謝和人的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)恒河猴中有71%經(jīng)研究的化合物與人類相關(guān)性較好，狗的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果有19%、而大鼠僅有14%與人類近似?？梢姡脮颀X動物模型研究疾病機(jī)制及研 發(fā)藥物，所獲結(jié)果與人類臨床療效相關(guān)性很低，致使大多數(shù)新藥在臨床試驗(yàn)中被淘汰。曬齒 動物在解剖學(xué)、病理生理和藥物代謝反應(yīng)等方面與人類差異較大，其試驗(yàn)結(jié)果與臨床相關(guān) 性或療效可預(yù)測性存在很大差距，因此建立新的、更為有效的非人靈長目大動物肝癌動物 模型勢在必行。
[0003] 恒河猴在解剖學(xué)、病理生理、免疫和藥物代謝反應(yīng)等方面與人類高度相似， 其基因序列與人類疾病直系同源基因和藥物祀點(diǎn)具有高度相似性?；瘜W(xué)致癌劑，如： N-Nitrosodiethylamine(DENA)，2-amin〇-3-methylimidazoquinoline (IQ),aflatoxin BI, sterimatocysti,皿V等可誘發(fā)恒河猴肝癌，其中W DENA對恒河猴致癌性較強(qiáng)，較穩(wěn)定， 皿V+DENA誘發(fā)的恒河猴肝細(xì)胞癌，其病理學(xué)發(fā)現(xiàn)與人肝癌相似。研究結(jié)果提示，DENA等可 用于建立化學(xué)誘導(dǎo)恒河猴肝腫瘤模型。但既往研究主要關(guān)注化學(xué)致癌劑的致癌作用，并未 提出通過化學(xué)致癌劑誘發(fā)恒河猴肝肝細(xì)胞癌，建立恒河猴肝癌模型、可移植性猴肝細(xì)胞癌 細(xì)胞株、體內(nèi)異種異位和原位或同種異位和原位可移植性肝癌模型，W期用于臨床前肝癌 診斷、治療新措施、新技術(shù)及抗癌新藥的研發(fā)。
[0004] 目前世界上尚無可重復(fù)性建立的恒河猴肝癌模型和可移植性恒河猴肝細(xì)胞癌細(xì) 胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了二乙基亞硝胺在制備用于篩選治療肝癌藥物的動物 模型中的用途。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了恒河猴肝癌模型的建立。
[0006] 本發(fā)明提供了一種制備肝癌動物模型的方法，它是將二乙基亞硝胺施用于靈長類 動物，二乙基亞硝胺的施用方法和劑量為：40mg/Kg/次。
[0007] 優(yōu)選地，所述靈長類動物為恒河猴。
[0008] 優(yōu)選地，所述的二乙基亞硝胺的施用方法和劑量為：腹腔注射給藥，每次40mg/ Kg，每周一次，共施用20次。
[0009] 本發(fā)明還提供了該方法制備得到的肝癌動物模型。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種恒河猴肝癌細(xì)胞株，它中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏的保藏 號：CCTCCNO:C2015142的恒河猴肝癌細(xì)胞株M12353。
[0011] 本發(fā)明恒河猴肝癌細(xì)胞株M12353,于2015年9月9日保藏在中國典型培養(yǎng)物 保藏中屯、，其簡稱為CCTCC，其地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)，其保藏號為=CCTCCNO: C2015142。
[0012] 其中，前述細(xì)胞株是由前述肝癌模型分離純化制備。
[0013] 本發(fā)明還提供了前述恒河猴肝癌細(xì)胞株在制備肝癌動物模型中的用途。
[0014] 優(yōu)選地，所述肝癌動物模型是恒河猴肝癌模型。
[0015] 本發(fā)明還提供了前述肝癌動物模型、前述恒河猴肝癌細(xì)胞株在篩選治療肝癌的藥 物和/或肝癌預(yù)防因素、抗肝癌新藥、肝癌放射治療、肝癌外科手術(shù)治療、影像學(xué)診斷的研 究中的用途。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種篩選治療肝癌的藥物的方法，包括如下步驟：
[0017] a將候選物施用于前述肝癌動物模型、前述恒河猴肝癌細(xì)胞株；
[0018] b、用前述肝癌動物模型、前述恒河猴肝癌細(xì)胞株評價(jià)潛在的治療肝癌的藥物。
[0019] 本發(fā)明方法成功建立的恒河猴肝癌模型，可W用于曬齒類動物模型無法完成的肝 癌預(yù)防因素、抗肝癌新藥、肝癌放射治療、肝癌外科手術(shù)治療、影像學(xué)診斷等實(shí)驗(yàn)研究。
[0020] 另一方面，本發(fā)明還成功建立可W長期穩(wěn)定傳代的恒河猴肝癌細(xì)胞株M12353,其 可在體外長期穩(wěn)定傳代，目前已傳代>80,已持續(xù)時(shí)間>16月，免疫缺陷動物（裸小鼠）異種 移植具有成瘤性，每點(diǎn)接種l-2Xl〇6細(xì)胞，成瘤率為100%，潛伏期為10-14天；可W移植 于恒河猴體內(nèi)成瘤，制備同種恒河猴肝癌模型，用于肝癌預(yù)防因素、抗肝癌新藥、肝癌放射 治療、肝癌外科手術(shù)治療、影像學(xué)診斷等實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用前景良好。
[0021] W下通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可W根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本 發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
【附圖說明】
[0022] 圖1猴M12393多發(fā)性肝腫瘤
[0023] 圖2恒河猴肝癌CT照片
[0024] 圖3擔(dān)河猴血清白aFP檢測結(jié)果3A-2 -化-2為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)；A3-7-E3-7為不同稀 釋度的荷肝癌猴血清；F3-7-冊-7為正常猴血清。 陽0巧]圖4M12393肝癌組織病理學(xué)形態(tài)
[0026] 圖5M12385肝癌組織病理學(xué)形態(tài)
[0027] 圖6恒河猴M12353肝癌大體形態(tài)
[0028] 圖7M12353肝癌組織病理學(xué)形態(tài)
[0029] 圖8M12353肝癌組織裸小鼠皮下接種移植成瘤
[0030] 圖9M12353肝癌組織裸小鼠移植成瘤組織病理學(xué)形態(tài)
[0031] 圖10M12353肝癌組織塊體外培養(yǎng)形態(tài)
[0032] 圖11M12353肝癌細(xì)胞形態(tài)
[0033] 圖12M12353肝癌細(xì)胞裸小鼠移植成瘤組織病理學(xué)形態(tài)
[0034] 圖13猴肝癌細(xì)胞M12353生長曲線
[0035] 圖14化療藥物對猴肝癌細(xì)胞M12353及人肝癌細(xì)胞的生長抑制作用
[0036] 圖15化療藥物5-氣尿喀晚巧-Fu)對猴肝癌細(xì)胞M12353及人肝癌細(xì)胞生長抑制 作用的形態(tài)觀察
【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1本發(fā)明動物模型的制備 陽0測 1、材料與方法：
[0039] 1. 1實(shí)驗(yàn)材料 W40] 出生1周內(nèi)健康恒河猴，雄性，體重0. 5-0. 8kg，6只，購自成都格林豪斯生物科技 有限公司。 陽OW 1.2主要試劑
[0042] 二乙基亞硝胺：購自Sigma公司。
[0043] 生理鹽水購自西南藥業(yè)股份有限公司）。 W44] 1. 3主要溶液的配制 W45] 二乙基亞硝胺溶液的配制：
[0046]取DENA原液（Sigma)25ml，加注射用生理鹽水75ml，配制成20%DENA水溶液，避 光保存?zhèn)溆谩?W47] 1. 4主要儀器
[0048] 一次性醫(yī)用滅菌注射器：購自四川雙陸醫(yī)療器械有限公司。
[0049] 1. 5造模方法
[0050] 用進(jìn)20%DENA水溶液腹腔注射給藥，40mg/kg，每周一次，共注射20次；每2周稱 體重，觀察動物一般情況。
[0051] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽05引 2. 1 DENA誘發(fā)恒河猴肝細(xì)胞癌CT檢查結(jié)果
[0053] 實(shí)驗(yàn)組1只恒河猴死亡，其他5只存活。
[0054] 1只猴于實(shí)驗(yàn)第432天（14月）因失血性休克肝臟衰竭，腸套疊死亡（尸解發(fā)現(xiàn)）， 解剖發(fā)現(xiàn)肝臟直徑0. 5-4. 5CM大小多發(fā)性腫塊（圖1)，與人肝癌外形相似。 陽化5] 對其余5只恒河猴進(jìn)行CT檢查，4只發(fā)現(xiàn)肝臟占位性病灶，1只不確定。其代表性 照片如圖（圖2)。 陽056] 2. 2荷肝細(xì)胞癌恒河猴血清人肝癌相關(guān)標(biāo)志物檢測結(jié)果
[0057]采集5只存活的實(shí)驗(yàn)組恒河猴及6例正常恒河猴的血清，用Elisa法進(jìn)行了如下 (表I)肝癌相關(guān)標(biāo)志物檢測。
[0058] 表1猴肝癌模型血清標(biāo)志物檢測
W60] 結(jié)果：
[0061] (1)檢測結(jié)果見（表2-5,圖3) 陽0創(chuàng)表2甲胎蛋白（aFP)
[0064] 表3谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTPl)
[0066] 表4異質(zhì)性胞核核糖核蛋白K化NRNPK)
W側(cè)表5脫-丫-簇基凝血酶原值CP)
[0069]
[0070] 由表2-表5化及圖3可W看出，本發(fā)明方法制備的恒河猴模型，其肝癌