突 變的存在或不存在。所述BRAF突變可以是本文公開的任何突變；優(yōu)選地，所述BRAF突變是 V600E。在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突變的存在指示腫瘤起始或進展取決于BRAF 的致癌或活化突變。因此，BRAF突變的存在指示所述受試者可以獲益于包含激酶抑制劑、 尤其是RAF或BRAF抑制劑的治療方案。BRAF突變的不存在指示所述受試者可能不會獲益 于包含激酶抑制劑、例如RAF或BRAF抑制劑的治療方案。
[0033] 治療由突變的BRAF驅(qū)動的癌癥的藥物已經(jīng)被開發(fā)和現(xiàn)在正在被開發(fā)。這些藥物 中的兩種，威羅菲尼和達拉非尼已獲美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于治療晚期黑素瘤。威 羅菲尼是B-raf抑制劑，其中斷由突變的BRAF(盡7V600E)驅(qū)動的B-Raf/MEK/ERK途徑。同 樣，達拉非尼是突變的BRAF(盡7V600E/K)的強效抑制劑。因此，使用本文所述的方法，已 被鑒定具有突變的BRAF的受試者可以獲益于包含靶向或抑制突變的BRAF和/或其下游信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑的治療方案。例如，所述受試者可以獲益于包含威羅菲尼或達拉非尼的治療 方案，而沒有突變的BRAF的受試者可能不會獲益于包含威羅菲尼或達拉非尼的治療方案。 [0034] 在一些方面，本文公開的方法可用于評價受試者對治療方案的反應(yīng)性。例如，通過 本文公開的方法可以檢測BRAF突變，和BRAF突變的存在指示所述受試者可能對特定治療 方案具有反應(yīng)性。例如，所述治療方案包含激酶抑制劑例如RAF或BRAF抑制劑、或靶向突 變的BRAF和/或來自突變的BRAF的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物。受試者對特定治療方案的反應(yīng) 性的判定可用于選擇治療方案。
[0035] 的確，本文所述的分離方法和技術(shù)提供了以下的迄今為止尚未實現(xiàn)的優(yōu)勢：1)選 擇性地分析疾病-或腫瘤-特異性核酸的機會，其可通過在液體樣品內(nèi)將疾病-或腫瘤-特 異性微泡與其它微泡分離而實現(xiàn)；2)與通過從液體樣品中直接提取核酸所得的收率/完整 性相比，具有更高序列完整性的核酸種類的明顯更高的收率；3)可擴展性（scalability)， 例如檢測低水平表達的核酸，可通過從更大體積的血清中沉淀更多微泡而增加靈敏度；4) 更純的核酸，其中在核酸提取步驟之前從微泡沉淀物中排除蛋白和脂質(zhì)、死細胞碎片和其 它潛在污染物和PCR抑制劑；和5)在核酸提取方法中的更多選擇，因為微泡沉淀物的體積 比起始血清的體積小得多，使得可以使用小體積柱濾器從這些微泡沉淀物中提取核酸。
[0036] 微泡優(yōu)選地是從采自受試者體液的樣品中分離出來。如本文使用的，"體液"是 指分離自受試者身體的任何部位的液體樣品，優(yōu)選外周部位，包括但不限于血液、血漿、血 清、尿、痰、脊髓液、胸膜液、乳頭抽吸液、淋巴液、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的液體、淚液、 唾液、乳汁、淋巴系統(tǒng)液、精液、腦脊液、器官系統(tǒng)內(nèi)液體（intra-organsystemfluid)、腹 水液、支氣管肺泡灌洗液（BAL)、囊腫液、腫瘤囊腫液、羊水及其組合。優(yōu)選地，所述體液是 血漿、血清、腦脊液、腹水液、支氣管肺泡灌洗液或囊腫液。在某些實施方案中，優(yōu)選體液樣 品在2-20ml的范圍內(nèi)。在一些方面，可以優(yōu)選使用較大體積的樣品，用于在檢測稀有遺傳 突變（例如本文所述的BRAF突變）中增加準(zhǔn)確率。在一些方面，所述體液樣品在以下范圍 內(nèi)：1-25ml，例如，2-25ml、2-20ml、2-15ml、2-10ml、4-25ml、4-20ml、4-15ml、4-10 ml、6_25ml、 6-20ml、6_15ml、6_10ml、8_25ml、8_20ml、8_15ml、10_25ml、10_20ml、 10-15ml、15-25ml或 15-20ml。
[0037] 術(shù)語"受試者"意圖包括顯示出或預(yù)料具有微泡的所有動物。在具體的實施方案 中，所述受試者是哺乳動物，人或非人靈長類動物、狗、貓、馬、牛，其他農(nóng)場動物，或嚙齒動 物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠等）。術(shù)語"受試者"和"個體"在本文可以互換地使用。
[0038] 從生物樣品中分離微泡的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，差速離心方法描述于 Raposo等人（Raposo等人，1996)的論文，類似的方法詳述于本文的實施例部分。陰離子 交換和/或凝膠滲透色譜的方法描述于美國專利號6, 899, 863和6, 812, 023。蔗糖密度梯 度或細胞器電泳的方法描述于美國專利號7, 198, 923。磁性活化細胞分選（MACS)的方法描 述于（Taylor和Gercel_Taylor，2008)。納米膜超濾濃縮器方法描述于（Cheruvanky等人， 2007)。優(yōu)選地，可以通過新開發(fā)的使用獨特微流體平臺以高效和選擇性地分離腫瘤來源的 微泡的微芯片技術(shù)，從受試者的體液中鑒定和分離微泡。該技術(shù)，如Nagrath等人（Nagrath 等人，2007)的論文所述，可用于使用該論文教導(dǎo)的類似捕獲和分離原理來鑒定和分離微 泡。前述參考文獻中的每篇都通過引用結(jié)合到本文中，用于這些方法的教導(dǎo)。
[0039] 在一個實施方案中，分離自體液的微泡中，對起源于特定細胞類型，例如，肺、胰 腺、胃、腸、膀胱、腎、卵巢、睪丸、皮膚、結(jié)直腸、乳房、前列腺、腦、食道、肝、胎盤、胎兒細胞的 那些進行富集。因為微泡通常攜帶來自它們的供體細胞的表面分子如抗原，表面分子可以 用于鑒定、分離和/或富集來自特定供體細胞類型的微泡（Al-Nedawi等人，2008;Taylor 和Gercel-Taylor，2008)。以這種方式，可以對起源于不同細胞群體的微泡中的核酸含量 進行分析。例如，腫瘤（惡性及非惡性）微泡攜帶腫瘤相關(guān)的表面抗原，并可以通過與這些 特異性腫瘤關(guān)聯(lián)的表面抗原而檢測、分離和/或富集。在一個實例中，該表面抗原是上皮細 胞粘附分子（EpCAM)，其對來自肺癌、結(jié)直腸癌、乳癌、前列腺癌、頭頸部癌、和肝起源的微泡 具有特異性，但對血液細胞起源的微泡沒有特異性（Balzar等人，1999 ;Went等人，2004)。 在另一個實例中，該表面抗原是CD24,CD24是對尿微泡具有特異性的糖蛋白（Keller等 人，2007)。在又一個實例中，該表面抗原選自以下組的分子：⑶70、癌胚抗原（CEA)、EGFR、 EGFRvIII，和其他變體、Fas配體、TRAIL、鐵傳遞蛋白受體、p38. 5、p97和HSP72。另外，腫瘤 特異性微泡可以表征為缺少表面標(biāo)記，如⑶80和⑶86。
[0040] 特定細胞類型的微泡的分離可以通過，例如使用對期望表面抗原具有特異性的抗 體、適配體、適配體類似物或分子印跡聚合物完成。在一個實施方案中，該表面抗原對癌癥 類型具有特異性。在另一個實施方案中，該表面抗原對細胞類型具有特異性，該細胞類型 不一定是癌性的?；诩毎砻婵乖奈⑴莘蛛x方法的一個實例在美國專利號7, 198, 923 中提供。如美國專利號5, 840, 867號和5, 582, 981、W0/2003/050290以及Johnson等人 (Johnson等人，2008)的出版物中描述的，適配體及其類似物特異性地結(jié)合表面分子，并可 以用作重新獲得細胞類型特異性的微泡的分離工具。分子印跡聚合物也特異性地識別表 面分子，如美國專利號6, 525, 154、7, 332, 553和7, 384, 589以及Bossi等人（Bossi等人， 2007)的出版物中描述的，并且是重新獲得和分析細胞類型特異性微泡的工具。前述參考文 獻中的每篇均結(jié)合到本文中，用于這些方法的教導(dǎo)。
[0041] 優(yōu)選地，使用基于親和力的過濾柱，從體液樣品中分離微泡。例如，所述柱含有特 異性地結(jié)合腫瘤來源的微泡或來自某種組織（欲患病組織、腫瘤組織）或特異性細胞類型 的微泡的試劑或部分。例如，所述柱含有特異性地結(jié)合微泡表面呈現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原的試 劑或部分，使得目標(biāo)微泡保留在柱上，而其它細胞、碎片和非特異性微泡可被棄去。在使用 基于親和力的過濾柱之前，可通過離心或過濾，預(yù)處理體液樣品。
[0042] 或者，微泡可通過離心、過濾和/或濃縮步驟的組合而分離。例如，可以首先通過 使用包括至少一個過濾步驟的方法，預(yù)處理體液樣品。例如，粗濾器（coursefilter) (0.8 微米）用于去除細胞和細胞碎片。該過濾后可接著超濾步驟，以去除溶劑和小分子分析物， 同時保留微泡。在最初過濾中使用的濾器可以是足以去除細胞和細胞碎片的任何尺寸，例 如，大于0. 22微米的任何尺寸。為了分離微泡，預(yù)處理的樣品再經(jīng)過過濾濃縮步驟，其中具 有分子量截止的濾器用于保留和濃縮直徑大于10nm的微泡。例如，再將樣品濃縮至體積 小于1ml，優(yōu)選100-200ul。例如，所述分子量截止為至少100kDa。
[0043] 在微泡分離和濃縮后，在核酸提取前，樣品用RNA酶抑制劑預(yù)處理，以防提取的 RNA的消化并提高提取品質(zhì)。任選地，所述樣品可以用合適緩沖液洗滌至少一次，以進一步 富集或純化微泡部分。在某些實施方案中，所述樣品用合適緩沖液洗滌兩次，以進一步富集 或純化微泡部分。任選地，在DNA和/或RNA提取之前，將濃縮的微泡在用于預(yù)處理步驟的 濾器上裂解。
[0044] 任選地，在微泡分離或核酸提取之前，可將對照顆粒加入樣品中，以起到內(nèi)部對照 的作用，以評價微泡純化和/或核酸提取的效率或品質(zhì)。這些對照顆粒包括Q-0噬菌體、 病毒粒子或含有對照核酸（例如，至少一個對照靶基因）的任何其它顆粒，其可以是天然發(fā) 生的或經(jīng)重組DNA技術(shù)而工程化的。在某些實施方案中，對照顆粒的數(shù)量在加入樣品前是 已知的。對照靶基因可以用實時PCR分析來定量。對照靶基因的定量測定可用于確定微泡 純化或核酸提取過程的效率或品質(zhì)。
[0045] 本文所述的方法可包括使用對照顆粒以確定或評價微泡分離和/或微泡核酸提 取的品質(zhì)。對照顆粒統(tǒng)指在微泡分離或核酸提取過程期間的某個時間點加入的微泡尺寸范 圍的顆粒，其中所述顆粒含有對照核酸，例如DNA或RNA。具體地講，對照核酸包含所測定或 測量的至少一個靶基因，用于確定在分離或提取過程期間的對照顆粒的回收量。
[0046] 優(yōu)選地，對照顆粒是Q-P噬菌體，在本文中稱為"Q-P顆粒"。用于本文所述的方 法的Q-0顆?？梢允翘烊话l(fā)生的病毒顆粒或可以是重組或工程病毒，其中病毒顆粒的至 少一種組分（例如部分基因組或外殼蛋白）是經(jīng)本領(lǐng)域已知的重組DNA或分子生物學(xué)技術(shù) 合成的。Q-0是光滑病毒科家族成員，特征在于線性單鏈RNA基因組，其由3個基因組成， 編碼4種病毒蛋白：外殼蛋白、成熟蛋白、裂解蛋白和RNA復(fù)制酶。因其與平均微泡大小相 似，所以可用分離微泡的相同純化方法，從生物樣品中容易地純化Q-0，如本文所述。另外， Q-0病毒單鏈基因結(jié)構(gòu)的低復(fù)雜性對于其在基于擴增的核酸測定中用作對照而言是有利 的。Q-0顆粒含有所檢測或測定的對照靶基因或?qū)φ瞻行蛄?，用于定量測定樣品中的Q-0 顆粒的量。例如，對照靶基因是Q-0外殼蛋白基因。在將Q-0顆粒加入尿樣品或分離的尿 來源的微泡之后，使用本文所述的提取方法，提取Q-0顆粒的核酸以及微泡和/或尿樣品 的核酸。通過RT-PCR分析可以確定Q-0對照靶基因的檢測，例如與目標(biāo)生物標(biāo)志物（盡7 BRAF)同時。對照靶基因的10倍稀釋的至少2、3或4個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于確定 拷貝數(shù)?？梢员容^檢測的拷貝數(shù)和加入的Q-0顆粒的量，以確定分離和/或提取過程的品 質(zhì)。
[0047] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在核酸提取前，將Q_f3顆粒加入到尿樣品中。例如，在 超濾前和/或預(yù)過濾步驟后，將Q-0顆粒加入到尿樣品中。
[0048]在某些實施方案中，將 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1，000 或 5, 000拷貝的Q-P顆粒加入到體液樣品。在一個優(yōu)選的實施方案中，將100拷貝的Q-P顆 粒加入到體液樣品。Q-0顆粒的拷貝數(shù)可以根據(jù)Q-0噬菌體感染靶細胞的能力來計算。 因此，Q-0顆粒的拷貝數(shù)與Q-0噬菌體的集落形成單位相關(guān)。
[0049] 在自生物樣品中分離微泡后，可以自分離的或富集的微泡部分中提取核酸?？墒?用本領(lǐng)域眾所周知的許多程序，自微泡分離核酸分子，對具體的生物樣品選擇合適的具體 分離程序。提取的核酸可以是DNA和/或RNA。在某些實施方案中，提取DNA。在某些實 施方案中，提取RNA。在某些實施方案中，同時提取DNA和RNA。RNA可以是信使