微泡在醫(yī)學疾病和病況的診斷、預后和治療中的用圖
【專利說明】微泡在醫(yī)學疾病和病況的診斷、預后和治療中的用途
[0001] 相關申請 本申請要求于2012年10月3日提交的美國申請?zhí)?1/709, 337的優(yōu)先權和權益；其全 部內容通過引用結合到本文中。
[0002] 發(fā)明背景 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶BRAF，RAS癌基因沿MEK/ERK信號轉導途徑上的一種下游 效應物，已經(jīng)成為用于人類癌癥的診斷、預后和治療指導的重要生物學標記。突變的BRAF V600E的高度流行意味著該突變在這些癌癥亞類的發(fā)展中是重要的"驅動劑"或"共驅動 劑"。此外，具有BRAF突變的癌癥通常比其無突變的相對物而言更具攻擊性。因此，突變的 BRAF已經(jīng)成為用于精確癌癥治療的極具吸引力的靶標。因此，用于診斷、預后和治療指導的 BRAF的檢測在臨床應用上變得越來越重要。
[0003] 檢測癌癥突變譜、例如BRAF突變的現(xiàn)有技術，包括活檢樣品的分析和在體液例如 血液中循環(huán)的突變腫瘤DNA片段的非侵襲性分析（Diehl等人，2008)。前一種方法是侵 襲性的、復雜的并可能對受試者有害。此外，在侵入性活檢程序中，組織樣品采自有限的 區(qū)域，并因此，可能給出假陽性或假陰性，尤其在不均勻的和/或分散在正常組織中的腫瘤 中。后一種方法因體液中的突變的癌DNA拷貝數(shù)極低而固有地缺乏靈敏度（Gormally等 人，2007)。因此，非常需要用于檢測BRAF突變的非侵入性和靈敏的診斷方法。
[0004] 發(fā)明概述 本發(fā)明解決了用于檢測BRAF突變的非侵入性和高度準確的診斷方法的需求。一般而 言，本發(fā)明特征在于在分離自生物樣品的微泡的DNA和/或RNA中檢測BRAF突變的方法。
[0005] 本發(fā)明特征在于在受試者中診斷疾病或其它醫(yī)學病況的方法，包括自所述受試者 的生物樣品中分離微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中 檢測BRAF突變的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突變的存在指示 所述受試者中的疾病或其它醫(yī)學病況的存在或所述受試者發(fā)展疾病或其它醫(yī)學病況的更 高傾向。
[0006] 本發(fā)明特征在于確定用于治療患有疾病或其它醫(yī)學病況的受試者的治療方案的 方法，包括自所述受試者的生物樣品中分離微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提 取的DNA和/或RNA中檢測BRAF突變的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的 BRAF突變的存在指示使用包含至少一種激酶抑制劑的治療方案。在某些實施方案中，所述 激酶抑制劑是RAF抑制劑或MEK抑制劑。在某些實施方案中，所述RAF抑制劑是BRAF-特 異性抑制劑。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述治療方案包含靶向突變的BRAF或來自突變的 BRAF的下游信號轉導的藥物。例如，所述治療方案包含威羅菲尼（vemurafenib)或達拉非 尼（dabrafenib)。本發(fā)明特征在于這樣的方法，其中所述疾病或其它醫(yī)學病況是癌癥。在 某些實施方案中，所述癌癥是黑素瘤、甲狀腺癌、結直腸癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、胰腺癌、肺 癌、淋巴瘤或白血病。
[0007] 本發(fā)明特征在于這樣的方法，其中所述BRAF突變是活化突變。
[0008] 本發(fā)明特征在于這樣的方法，其中所述BRAF突變編碼突變的BRAF多肽，其中所述 突變的BRAF多肽是V600E。
[0009] 本發(fā)明特征在于這樣的方法，其中所述BRAF突變是T1799A。
[0010] 本發(fā)明特征在于這樣的方法，其中所述生物樣品是體液樣品。在一些方面，所述 體液樣品是血漿、血清、腦脊液或腹水液。在其他優(yōu)選的實施方案中，所述體液樣品是支氣 管肺泡灌洗液（BAL)和囊腫液。在一些方面，所述體液樣品在以下范圍內：1-25ml，例如， 2-25ml、2-20ml、2-15ml、2-10ml、4-25ml、4-20ml、4-15ml、4-10ml、6-25ml、 6-20 ml、6_15ml、6_10ml、8_25ml、8_20ml、8_15ml、10_25ml、10_20ml、10_15ml、15_25ml 或 15-20ml〇
[0011] 現(xiàn)在將詳細描述本發(fā)明的各方面和實施方案?？梢岳斫?，可以對細節(jié)進行修改，而 不偏離本發(fā)明的范圍。此外，除非上下文另有需要，否則單數(shù)術語將包括復數(shù)，復數(shù)術語將 包括單數(shù)。
[0012] 所確定的所有專利、專利申請和出版物都通過引用明確地結合到本文中，用于描 述和公開例如在這些出版物中描述的方法學的目的，所述方法學可用于本發(fā)明。提供這些 出版物僅為其先于本申請申請日的公開內容。在這一點上不應視為承認本發(fā)明人由于在先 發(fā)明或任何其他原因而無權享有先于這樣的公開內容。對日期的所有聲明或對這些文件內 容的表現(xiàn)都基于申請人可得的信息而不構成對這些文件的日期或內容的準確性的任何承 認。
[0013] 附圖簡述 圖1是樣品081 (深灰色）和055 (淺灰色）的實時PCR數(shù)據(jù)的圖示。擴增曲線代表 對自樣品081提取的DNA的一式三份的QPCR測定。根據(jù)來自腫瘤組織的活檢數(shù)據(jù)，在樣品 081中檢測到BRAF突變（V600E)，但在樣品055中未檢測到。ARn代表歸一化到參考熒光 信號和基線焚光的報告信號；log(ARn)對PCR循環(huán)數(shù)作圖。
[0014] 圖2是對于自樣品MGHSS04提取的RNA的實時PCR數(shù)據(jù)的圖示。根據(jù)來自腫瘤組 織的活檢數(shù)據(jù)，檢測BRAF突變。ARn代表歸一化到參考熒光信號和基線熒光的報告信號； log(ARn)對PCR循環(huán)數(shù)作圖。
[0015] 圖3是對于自樣品091提取的RNA的實時PCR數(shù)據(jù)的圖示。根據(jù)來自腫瘤組織的 活檢數(shù)據(jù)，在樣品091中檢測到無突變。Rn代表歸一化到參考熒光信號和基線熒光的報告 信號；log(ARn)對PCR循環(huán)數(shù)作圖。
[0016] 發(fā)明詳述 微泡由真核細胞脫落，或從質膜中出芽，到細胞外面。這些膜囊泡的尺寸是不均勻的， 其直徑范圍為約l〇nm至約5000nm。由細胞內多泡體胞吐釋放的小微泡（直徑為約10至 lOOOnm，更經(jīng)常為約30至200nm)在本領域中稱為"外來體（exosome)"。本文描述的方法 和組合物同樣適用于所有尺寸，優(yōu)選30至800nm的微泡。
[0017] 在一些文獻中，術語"外來體"也指含有參與mRNA降解和核仁小RNA(snoRNA)、 核內小RNA(snRNA)和核糖體RNA(rRNA)加工的核糖核酸外切酶的蛋白質復合體（Liu等 人，2006b;vanDijk等人，2007)。此類蛋白質復合體沒有膜，并且不是本文使用的那些 術語，"微泡"或"外來體"。
[0018] 近來，研究已經(jīng)揭示出微泡內的核酸具有作為生物標志物的作用。使用自微泡中 提取的核酸被認為有可能免除對活檢的需求，突出顯示出微泡生物學的巨大的診斷潛力 (Skog等人，2008)。本文所述的方法特征在于自微泡中提取的核酸用于檢測BRAF突變的 用途，用于診斷、預測受試者中的疾病或醫(yī)學病況的存在，或用于評價或確定患有疾病或醫(yī) 學病況的受試者的治療方案。
[0019] BRAF RAF激酶是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它們是促分裂原-活化蛋白（MAP)激酶途 徑的關鍵組分，該途徑是信號轉導途徑，在基因表達、細胞生長、增殖、分化和程序性細胞死 亡的調節(jié)中起到根本性作用。MAP激酶途徑在真核生物中是保守的，其功能是經(jīng)由受體和磷 酸化級聯(lián)而轉導胞外信號到細胞核，用于活化轉錄因子；所述胞外信號例如激素、細胞因子 和各種生長因子。信號轉導途徑是通過胞外促分裂原信號所致的受體酪氨酸激酶的活化而 啟動。受體酪氨酸激酶活化Ras，一種GTP酶，其導致膜募集和RAF蛋白的活化。RAF的活 化繼而導致磷酸化和隨后的蛋白激酶MEK的活化。MEK然后使ERK磷酸化，這可直接和間接 活化轉錄因子，導致參與細胞增殖和生存的多種調芐基因的表達。
[0020] BRAF，也稱為v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl、B-RAF、BRAF1、B-RAF1、NS7和 RAFB1，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的RAF家族成員。該家族由3種高度保守的激酶組成： ARAF(或A-RAF)、CRAF(RAF-1或C-RAF)和BRAF。如本文使用的，"BRAF"包括所有已知 的人類BRAF同源物和變體，以及與BRAF具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同源 性的其它核酸和多肽。在某些實施方案中，BRAF被鑒定為包含Genbank檢索號NM_004333 (SEQIDNO: 1)所示的核酸序列，其中起始密碼子和終止密碼子以斜體和下劃線表示，導致 在氨基酸600的突變的共同致癌突變以下劃線和黑體表示： CGCCTCCCTTCCCCCTCCCCGCCCGACAGCGGCCGCTCGGGCCCCGGCTCTCGGTTATAAG^r^GCGGCGCT GAGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCGCGGAGCCGGGCCAGGCTCTGTTCAACGGGGACATGGAGCCCGAGGCCGGCGCCG GCGCCGGCGCCGCGGCCTCTTCGGCTGCGGACCCTGCCATTCCGGAGGAGGTGTGGAATATCAAACAAATGATTAAG TTGACACAGGAACATATAGAGGCCCTATTGGACAAATTTGGTGGGGAGCATAATCCACCATCAATATATCTGGAGGC CTATGAAGAATACACCAGCAAGCTAGATGCACTCCAACAAAGAGAACAACAGTTATTGGAATCTCTGGGGAACGGAA CTGATTTTTCTGTTTCTAGCTCTGCATCAATGGATACCGTTACATCTTCTTCCTCTTCTAGCCTTTCAGTGCTACCT TCATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCACAAAAACCTATCGTTAG AGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGGAGTTACAGTCCGAGACAGTCTAAAGAAAG CACTGATGATGAGAGGTCTAATCCCAGAGTGCTGTGCTGTTTACAGAATTCAGGATGGAGAGAAGAAACCAATTGGT TGGGACACTGATATTTCCTGGCTTACTGGAGAAGAATTGCATGTGGAAGTGTTGGAGAATGTTCCACTTACAACACA CAACTTTGTACGAAAAACGTTTTTCACCTTAGCATTTTGTGACTTTTGTCGAAAGCTGCTTTTCCAGGGTTTCCGCT GTCAAACATGTGGTTATAAATTTCACCAGCGTTGTAGTACAGAAGTTCCACTGATGTGTGTTAATTATGACCAACTT GATTTGCTGTTTGTCTCCAAGTTCTTTGAACACCACCCAATACCACAGGAAGAGGCGTCCTTAGCAGAGACTGCCCT AACATCTGGATCATCCCCTTCCGCACCCGCCTCGGACTCTATTGGGCCCCAAATTCTCACCAGTCCGTCTCCTTCAA AATCCATTCCAATTCCACAGCCCTTCCGACCAGCAGATGAAGATCATCGAAATCAATTTGGGCAACGAGACCGATCC TCATCAGCTCCCAATGTGCATATAAACACAATAGAACCTGTCAATATTGATGACTTGATTAGAGACCAAGGATTTCG TGGTGATGGAGGATCAACCACAGGTTTGTCTGCTACCCCCCCTGCCTCATTACCTGGCTCACTAACTAACGTGAAAG CCTTACAGAAATCTCCAGGACCTCAGCGAGAAAGGAAGTCATCTTCATCCTCAGAAGACAGGAATCGAATGAAAACA CTTGGTAGACGGGACTCGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACAAAGAATTGGATCTGG ATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTGATGTG