專利名稱：清除粘附性微泡的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血源性樣本中產生的粘附性微泡的預處理方法，該方法在測定微泡時不影響在血樣采集前存在于血中的循環(huán)微泡的測定，還涉及正確測定循環(huán)微泡的方法，及其用于測定的試劑或試劑盒。
背景技術：
當在動脈粥樣硬化癥、彌散性血管內凝血癥以及這類病癥中血栓形成時，活化的血小板釋放微泡。已知微泡有各種功能，如通過凝血因子與膜表面上的磷脂結合/聚集而促進凝血的作用，對單核細胞、血小板和各種內皮細胞的活化作用，以及白細胞-血小板/白細胞-白細胞/內皮細胞-白細胞的粘附促進作用。因此，微泡不僅被認為是血小板活化的標記，還與血栓形成和動脈硬化的進展密切相關(見非專利文件1)。因而，對于以時間推測涉及上述事件的疾病的狀況，重要的診斷方法之一就是測定血液中微泡的量。但是，血小板易于被物理刺激活化，據(jù)此，微泡從活化的血小板中釋放。例如，由于取血樣時或者血漿或血清的分離過程中的物理震動，污染的血小板被活化，從而增加了并不反映取血樣后血源性樣本的臨床狀況的微泡。這些微泡增加了血源性樣本中存在的微泡量，并導致難以準確判定患者病狀。因此，需要一種方法，其能通過消除取血樣后產生的微泡的影響而準確測定取血樣前血中的微泡。
非專利文件1Nomura S.，Int.J.Hematol.，74397-404，2001發(fā)明內容本發(fā)明要解決的問題為了解決血樣采集后，血源性樣本在制備中產生的微泡(粘附性微泡)所導致的上述問題，本發(fā)明的目的是提供消除粘附性微泡的方法，利用此方法正確測定血液中循環(huán)微泡的方法，及其用于測定的試劑。
所述問題的解決方法根據(jù)這種實際情況，經過滲入研究，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，典型為BSA(牛血清白蛋白)的白蛋白與血樣采集后產生的微泡(粘附性微泡)產生特異性相互作用，以消除其在免疫分析中的影響，并有助于通過免疫分析正確測定僅存在于血樣采集之前的微泡(循環(huán)微泡)。本發(fā)明完全以前述結果為基礎，并具體提供以下發(fā)明。
血源性樣本的預處理方法，其用于消除血樣采集后血源性樣本中產生的粘附性微泡的影響，特征在于將白蛋白加入到血源性樣本中。
根據(jù)[1]所述的方法，其中所述的白蛋白是BSA。
血源性樣本中循環(huán)微泡的免疫分析方法，其包括通過將白蛋白加入血源性樣本中消除血樣采集后在血源性樣本中產生的粘附性微泡的影響的步驟，以及對血源性樣本中的循環(huán)微泡進行免疫學分析的步驟。
根據(jù)[3]所述的方法，其中所述的循環(huán)微泡通過將抗所述循環(huán)微泡的抗體與對所述微泡特異的表面表位連接，并測定由此結合的抗體水平而進行免疫學分析。
根據(jù)[4]所述的方法，其中如上所述的表面表位存在于循環(huán)微泡的糖蛋白上。
根據(jù)[5]所述的方法，其中如上所述的表面糖蛋白是GpIb-IX。
根據(jù)[6]所述的方法，其特征在于所述的抗體根據(jù)結合抗體的標記或酶來檢測。
根據(jù)[7]所述的方法，其特征在于包含如下步驟，其中循環(huán)微泡與抗GpIX的固定抗體結合，隨后使識別微泡上GpIb的抗體反應。
測定血源性樣本中循環(huán)微泡的試劑盒，其至少包括白蛋白、標記的抗GpIb抗體和抗GpIX抗體。
根據(jù)[9]所述的試劑盒，其中所述的白蛋白為BSA。
根據(jù)[9]或[10]所述的試劑盒，其中所述的抗GpIX抗體被包被于板中。
本文中，患者血液中存在的微泡稱作“循環(huán)微泡”，而在血樣采集期間或之后因人工操作而活化的血小板上釋放的微泡，因其與白蛋白有親和力，稱作“粘附性微泡”。
本發(fā)明提出的血源性樣本指含有血液或從該血液中制備的一種或多種血液成分的溶液，并優(yōu)選其中的血小板已被清除的樣本。具體而言，該樣本可以包括血漿，還可以根據(jù)血份的測定，包含以生理鹽水或緩沖液稀釋而得到溶液。
所述的白蛋白指來源于人類、除人類以外的哺乳動物和鳥類的白蛋白，除人類以外的哺乳動物可以包括，例如，牛、馬、猴、狗、兔和鼠，鳥類可以包括雞作為典型的例子。特別是可包括作為典型例子的牛血清白蛋白(BSA)，另外，可包括人血清白蛋白(HAS)和卵清蛋白作為合適的例子。
對于加入所述白蛋白的時間，白蛋白可以在測定前加入血源性樣本中，并且例如在ELISA方法中，所述白蛋白可以在抗體固化到板上后加入。對于加入的形式沒有特別的限制，但是優(yōu)選以液態(tài)加入，并且將所述白蛋白事先溶解在生理鹽水或等滲緩沖液中，然后可以將其加入。待加入的白蛋白的量優(yōu)選5％或以上的終濃度，例如，典型的終濃度約為5至10％。加入后，優(yōu)選靜置或搖晃使得粘附性微泡吸附到所述白蛋白上，優(yōu)選進行所述白蛋白的處理一小時或更久，并優(yōu)選4小時或更久。因此，人工活化的血小板釋放的微泡與所述白蛋白相互作用，通過利用微泡膜表面抗原的抗體而將其清除出免疫分析系統(tǒng)，并對循環(huán)微泡的測定基本沒有影響。
以白蛋白處理基本不影響血源性樣本中原有的循環(huán)微泡，并且該循環(huán)微泡能通過利用微泡特性的標準免疫分析來測定。
只要免疫方法的程序是，以微泡膜表面上的抗原分子(表位)為基礎，通過利用抗該表位的抗體和通過量化所述分子，進行微泡的測定和量化，則免疫方法不受特別限制。例如，典型的ELISA法、RIA法或聚集法。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體可以包括抗GpIb-GPIX復合體和/或糖蛋白(包括個體糖蛋白、GpIb或GpIX)的抗體。在微泡上觀察到的對所述血小板特異的其他糖蛋白包括GpIa-IIa、GpIIb-IIIa和GpIIIb。
結合于循環(huán)微泡的抗體本身可被標記，或者可以采用標記的第二抗體，如，與鼠單克隆抗體(第一抗體)特異結合的標記的抗鼠免疫球蛋白。多克隆抗體或單克隆抗體均可用，但優(yōu)選采用單克隆抗體。所述的標記物可以是能夠給出信號的任何成分，如，酶(過氧化物酶，堿性磷酸酶等)、發(fā)色團、熒光團(FITC等)、放射性同位素、著色顆粒物、染料、膠態(tài)金屬等。
此外，本發(fā)明的一個實施方案將在下文中通過實施采用例如BSA的ELISA而詳細描述。
將上述所制備的血源性樣本成分的10至150μl的等分試樣加入96孔板的每一孔中，所述96孔板已事先用抗GpIX抗體包被并給予脫脂奶封閉，然后，向其中加入BSA溶液，形成5％的終濃度。之后，為了將新產生的粘附性微泡吸附到BSA上，所述板在室溫下或37℃下培養(yǎng)一小時或更久，優(yōu)選4小時或更久。隨后，用清洗溶液，如大約0.02至0.1％的Tween 20/PBS，徹底清洗該板。然后，加入過氧化物酶標記的抗GpIb抗體。用同樣的清洗溶液徹底清洗該板。然后加入所述酶的底物以產生顏色。因此，通過利用基于膜表面表位GpIb-GpIX復合體的抗體，就可能以酶反應產生的著色底物的量來定量循環(huán)微泡的量。通過上述操作，人工操作產生的粘附性微泡被BSA俘獲，并與系列免疫分析所用的抗體不產生反應。從而可能僅測定原來存在于血中的目標循環(huán)微泡。
可以提供一種用于測定循環(huán)微泡的試劑盒，其包含用于上述操作的各種抗體和試劑等。具體而言，在試劑盒中包括以BSA為代表的白蛋白或其溶液，用于有效去除人工操作產生的粘附性微泡，識別所述蛋白復合體的抗體，其典型地為抗微泡膜表面上的GpIb和GpIX的抗體為代表(抗體其一或二者被標記)，必要的話，第二抗體和酶底物(當酶作為標記使用時)等。例如，當用于識別的抗體是與生物素結合的抗GpIb抗體時，可以包括過氧化物酶標記的抗生物素蛋白作為測定用試劑盒的第二試劑。因此可以提供包括過氧化物酶底物、用于測定循環(huán)微泡的試劑盒。
如從下列實施例可以顯見的，已經發(fā)現(xiàn)，通常在血處理階段從被污染的活化血小板中釋放的粘附性微泡，可以通過用白蛋白預處理而從免疫分析系統(tǒng)中充分清除，而只有原來存在于血中的循環(huán)微泡可被測定。


圖1顯示了利用人工活化的樣本、從具有高度微泡的患者中得到的樣本和正常的樣本，通過BSA進行的粘附性微泡的吸附實驗。
本發(fā)明的最佳實施模式本發(fā)明將參考實施例進行更詳細的描述。該實施例僅用于舉例說明而描述，而非限制本發(fā)明。
實施例1方法1.制備假陽性(活化的)樣品含有3.8％檸檬酸的全血樣品，來自循環(huán)微泡(PDMP血小板源性微粒)值正常的健康成年男性，儲存在4℃冰箱中12小時，以新產生PDMP(粘附性微泡)。冷卻的全血(2mL)用臺式離心機以3000rpm離心20分鐘，收集上清液(600μL)，制成活化樣品。該活化樣品用生理鹽水稀釋2倍和4倍，用于ELISA。
2.具有高數(shù)值的樣本制備從顯示有高PDMP值的對象(成年男性)中，用EDTA/ACD(檸檬酸右旋葡萄糖)制血樣(2mL)，用臺式離心機室溫下3000rpm離心20分鐘，收集上清液(600μL)。具有高值的樣本以生理鹽水稀釋2倍和4倍，用于ELISA。
3.正常樣本的制備從PDMP值顯示正常的健康成年男性中，用EDTA/ACD制備血樣，用臺式離心機3000rpm離心20分鐘，收集上清液(600μL)，用于ELISA。
4.ELISA在微泡膜表面上存在的糖蛋白中制備夾心ELISA系統(tǒng)，使用對抗CD42b(GpIb)和CD42a(GpIX)的抗體(抗CD42b抗體NNKY5-5，抗CD42a抗體KMP-9)，所述CD42b和CD42a為對血小板具有特異性的分子。將活化樣本或具有高值的樣本的50μL等分試樣加入用于ELISA的96孔微孔板(由CorningMaxiSorb提供)的每一孔中，該微孔板已被抗CD42a抗體包被，隨后將50μL PBS，2.5％、5％、7.5％或10％的BSA加入每孔中，形成BSA的終濃度為1.25％、2.5％、3.75％或5％。板在室溫下振蕩培養(yǎng)4小時。然后，板用清洗液(0.05％Tween20/PBS)清洗，加入生物素化的抗CD42b抗體，通過加入過氧化物酶標記的抗生物素蛋白形成顏色，用免疫讀數(shù)儀(Immunoreader)讀出450nm處的吸光度(圖1)。
結果在顯示假陽性的活化樣品中，測定值的降低取決于分析中加入孔中的BSA濃度，在BSA終濃度為5％時，數(shù)值降低至接近正常樣本的值。同時，起初顯示出高數(shù)值的具有高值的樣本，則無論BSA的濃度大小，顯示數(shù)值不變。從這些結果，已證實血樣采集后因為操作而新產生的PDMP，可以在分析中通過加入終濃度為5％的BSA，被選擇性清除。
權利要求
1.血源性樣本的預處理方法，其用于消除血樣采集后血源性樣本中產生的粘附性微泡的影響，特征在于將白蛋白加入血源性樣本中。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中白蛋白是BSA。
3.血源性樣本中循環(huán)微泡的免疫分析方法，包括通過將白蛋白加入血源性樣本中消除血樣采集后在血源性樣本中產生的粘附性微泡的影響的步驟，以及對血源性樣本中的循環(huán)微泡進行免疫學分析的步驟。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述的循環(huán)微泡通過將抗所述的循環(huán)微泡的抗體，與對所述微泡特異的表面表位連接，并測定由此結合的抗體的水平而進行免疫學分析。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述的表面表位存在于循環(huán)微泡的糖蛋白上。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述的表面糖蛋白是GpIb-IX。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述的抗體根據(jù)與抗體結合的標記或酶來檢測。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于包含了如下步驟，其中循環(huán)微泡與抗GpIX的固定抗體結合，隨后使識別微泡上GpIb的抗體反應。
9.測定血源性樣本中循環(huán)微泡的試劑盒，其至少包括白蛋白、標記的抗GpIb抗體和抗GpIX抗體。
10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其中所述的白蛋白為BSA。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的試劑盒，其中所述的抗GpIX抗體包被在板中。
全文摘要
用于選擇性測定僅在血中的微泡的方法，其通過用白蛋白預處理血源性樣本以選擇性消除只被人工操作活化的血小板所釋放的微泡來進行。
文檔編號G01N33/543GK1989412SQ20058002534
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月13日 優(yōu)先權日2004年7月26日
發(fā)明者小關靖, 齊藤史郎 申請人:大塚制藥株式會社, 株式會社Jimro