從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和生物流體分離并純化微泡的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供從 細(xì)胞培養(yǎng)上清液和生物液體分離并純化微泡的方法。本發(fā)明還提供微泡的藥物組合物，其 用于促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合、刺激組織再生、改造疤痕組織、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、改變腫瘤細(xì)胞的 生長(zhǎng)和/或可動(dòng)性、或改變正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或可動(dòng)性。本發(fā)明還提供欲用作診斷試劑 的微泡的組合物以及制備所述微泡的組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微泡是由許多（即使不是全部）體外和體內(nèi)的細(xì)胞類型分泌的并且存在于諸如例 如血液、間質(zhì)液、尿液、唾液和眼淚等生物流體中。微泡是由細(xì)胞的原生質(zhì)膜形成的包含脂 質(zhì)雙層的囊泡并且在尺寸上是不均勾的，范圍在約2nm至約5000nm。在本文中將形成微泡 的細(xì)胞稱為"宿主細(xì)胞"。微泡是囊泡的異質(zhì)群體并且包括例如外皮層、微粒、微泡、納米囊 泡、脫落囊泡和膜顆粒。
[0003] 微泡在它們的膜表面顯示出來(lái)自于它們的宿主細(xì)胞的膜蛋白質(zhì)，并且還可以在微 泡中含有來(lái)自于所述宿主細(xì)胞的分子，諸如例如mRNA、miRNA、tRNA、RNA、DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì) 或感染性顆粒。這些分子可以起因于或者是導(dǎo)入到所述宿主細(xì)胞中的重組分子。微泡在細(xì) 胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且可以在體內(nèi)局部或遠(yuǎn)側(cè)發(fā)揮作用，通過(guò)與靶細(xì)胞融合、將微 泡上和/或中的分子運(yùn)輸?shù)剿霭屑?xì)胞中而誘導(dǎo)細(xì)胞的改變。例如，微泡已經(jīng)牽連到抗腫 瘤逆轉(zhuǎn)、癌癥、腫瘤免疫抑制、轉(zhuǎn)移、腫瘤-基質(zhì)相互作用、血管生成和組織再生。微泡還可 以用來(lái)診斷疾病，因?yàn)橐呀?jīng)證明它們攜帶了多種疾病的生物標(biāo)志物，包括例如心臟病、HIV 和白血病。
[0004] 盡管微泡較重要，但是以有用的量分離微泡并同時(shí)保存它們的結(jié)構(gòu)和功能的完整 性仍然是個(gè)問(wèn)題。傳統(tǒng)的工序采用超速離心以從樣本中分離微泡。
[0005] 例如，美國(guó)專利7, 807, 438公開了一種用于分離丙型肝炎病毒的方法。該方法包 含從感染了丙型肝炎病毒（HCV)的個(gè)體的血漿分離出稱為外來(lái)體的顆粒并且從這些外來(lái) 體顆粒提取RNA。
[0006] 在另一個(gè)例子中，美國(guó)專利申請(qǐng)US20030198642A1公開了來(lái)源于抗原呈遞細(xì)胞中 的富集了 MHC II類的隔室的[外]來(lái)體……[以用于]……接種賦形劑。
[0007] 在另一個(gè)例子中，美國(guó)專利申請(qǐng)US20060116321A1公開了用于在介導(dǎo)免疫抑制反 應(yīng)中使用的方法和組合物。該組合物…包含具有免疫抑制活性的外來(lái)體。此種外來(lái)體可以 來(lái)源于各種不同的細(xì)胞類型，包括抗原呈遞細(xì)胞，諸如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在分離外來(lái) 體之前，所述細(xì)胞可以經(jīng)基因工程化以表達(dá)能夠增強(qiáng)所述外來(lái)體的免疫抑制活性的分子和 /或暴露于一種或多種試劑（諸如細(xì)胞因子或細(xì)胞因子抑制劑），所述試劑也能夠增強(qiáng)外來(lái) 體的免疫抑制活性。本發(fā)明還涉及此種外來(lái)體用于治療與免疫系統(tǒng)的不希望的活化有關(guān)的 疾病和病癥的用途。本發(fā)明還包括從血清中分離的已經(jīng)證明具有免疫抑制性的外來(lái)體。
[0008] 超速離心可能損傷微泡，導(dǎo)致囊泡的裂解或破裂。如果將此種損傷的微泡導(dǎo)入到 體內(nèi)的話，微泡的損傷可能在體內(nèi)引發(fā)副反應(yīng)。
[0009] 其他人已經(jīng)嘗試了替代方法以分離微泡。但是，所采用的所述替代方法經(jīng)常分離 出微泡的子級(jí)分（sub-fraction)或效率低下。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)US2011003008A1公開 了一種由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的顆粒并且包含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的至少一種生物學(xué)性 質(zhì)。所述生物學(xué)性質(zhì)可以包含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（MSC-CM)的生物活性，諸如心 臟保護(hù)或縮小梗死面積。所述顆?？梢园遗莼蛲鈦?lái)體。
[0010] 在另一個(gè)例子中，美國(guó)專利申請(qǐng)US20120070858A1公開了一種通過(guò)基于外來(lái)體 的預(yù)先確定Zeta電位的電荷吸引機(jī)制使用氧化鐵（Fe 304)的超順磁性納米顆粒從血小板 分離外來(lái)體的方法。該方法涉及氧化鐵納米顆粒的使用，該氧化鐵納米顆粒是預(yù)先合成的 [sic (照抄原文）]、具有預(yù)先確定的正電荷并且結(jié)合到生物樣品中含有的負(fù)電荷外來(lái)體。 在培育的過(guò)程中，所述陽(yáng)離子磁性納米顆粒由于靜電相互作用而被外來(lái)體膜的表面吸收。 所述材料在磁場(chǎng)中的暴露使得能夠分離結(jié)合至所述納米顆粒的外來(lái)體。這種技術(shù)的成功已 經(jīng)通過(guò)流式細(xì)胞儀[sic]對(duì)所述外來(lái)體的表征[sic]而得到了證實(shí)。該方法由于能夠分離 并純化外來(lái)體而不會(huì)改變它們的原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，所以已經(jīng)證明其適合于此目的。
[0011] 在另一個(gè)例子中，PCT專利申請(qǐng)W02012169970A1公開了連同對(duì)流層析、流化床或 共沉淀的應(yīng)用而在生物材料（如抗體、病毒、細(xì)胞和細(xì)胞器）的純化中使用約束共水化劑的 材料和方法。
[0012] 因此，仍然需要提供一種無(wú)損傷且以充足的量分離并純化微泡的方法，所分離的 微泡隨后可以用于診斷疾病、治療或研究。
[0013] 本發(fā)明提供了用于從生物流體分離微泡的方法，其不會(huì)損傷所述微泡的結(jié)構(gòu)和/ 或功能的完整性。本發(fā)明還提供用于從生物流體分離外皮層、微粒、微泡、納米囊泡、脫落囊 泡、凋亡小體或膜顆粒的方法，其不會(huì)損傷它們的結(jié)構(gòu)和/或功能的完整性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種從細(xì)胞培養(yǎng)上清液或生物流體分離和/或純 化微泡的方法，其利用沉淀劑通過(guò)置換溶劑化的水而從所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液或生物流體中 沉淀出所述微泡。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 分離的微泡的制劑隨后被純化。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑隨后被純化以 產(chǎn)生外皮層的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑隨后被純化以產(chǎn)生微粒的 制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑隨后被純化以產(chǎn)生納米囊泡的制劑。在 一個(gè)實(shí)施方式中，所這分離的微泡的制劑隨后被純化以產(chǎn)生脫落囊泡的制劑。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述分離的微泡的制劑隨后被純化以產(chǎn)生膜顆粒的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 分離的微泡的制劑隨后被純化以產(chǎn)生凋亡小體的制劑。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)血管生成。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑促進(jìn)或增強(qiáng)患者中的血管生成。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)神經(jīng)元再 生。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑促進(jìn)或增強(qiáng)患者中的神經(jīng)元再生。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)細(xì)胞增殖。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑促進(jìn)或增強(qiáng)患者中的細(xì)胞增殖。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)細(xì)胞迀移。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的微泡的制劑促進(jìn)或增強(qiáng)患者中的細(xì)胞迀移。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述傷口為三度燒傷。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述傷口是二度燒傷。
[0021 ] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其減少患者中的疤痕形 成。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其減少患者皮膚中的皺 紋形成。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其用于在患者中診斷疾 病的存在和/或進(jìn)展。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。在替代的實(shí)施方 式中，所述疾病是炎癥/自身免疫性疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 疾病是移植物抗宿主病。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其可以促進(jìn)復(fù)雜組織結(jié) 構(gòu)的功能再生與組織機(jī)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其可以 在患有再生障礙性貧血的患者中再生造血組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離 的微泡的制劑，其可以在具有患病、損傷或丟失的皮膚的患者中再生選自于由上皮組織、間 質(zhì)組織、神經(jīng)組織、血管組織和附屬結(jié)構(gòu)組成的組中的至少一種組織。在一個(gè)實(shí)施方式中， 本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其可以再生來(lái)自于所有三種胚層的組織和/或細(xì)胞。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其用于調(diào)節(jié)患者的免疫 系統(tǒng)。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其增強(qiáng)了移植到患者中 的組織或細(xì)胞的成活率。在一個(gè)實(shí)施方式中，在患者接受移植的組織或細(xì)胞之前，使用所述 分離的微泡的制劑治療患者。在替代的實(shí)施方式中，在患者接受所述移植的組織或細(xì)胞之 后，使用所述分離的微泡的制劑治療患者。在替代的實(shí)施方式中，使用所述分離的微泡的制 劑治療所述組織或細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，在移植之前使用所述分離的微泡的制劑治療 所述組織或細(xì)胞。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其含有選自于由來(lái)自于 宿主細(xì)胞的RNA、DNA和蛋白質(zhì)組成的組中的至少一種分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主 細(xì)胞經(jīng)工程化以表達(dá)選自于由RNA、DNA和蛋白質(zhì)組成的組中的至少一種分子。在一個(gè)實(shí)施 方式中，將含有選自于由來(lái)自宿主細(xì)胞的RNA、DNA和蛋白質(zhì)組成的組中的至少一種分子的 所述分離的微泡的制劑用作治療劑。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 并入到本文并且構(gòu)成本說(shuō)明書一部分的附圖闡述了本發(fā)明的各種實(shí)施方式，并且 與描述一起進(jìn)一步用于解釋本發(fā)明的原理并且使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠制造和使用 本發(fā)明。在附圖中，相同的參考數(shù)字指示相同或功能相似的元素。本發(fā)明的更完全的理解 及其許多伴隨的優(yōu)點(diǎn)將容易獲得，因?yàn)樵谶B同考慮所述附圖并參見(jiàn)以下說(shuō)明說(shuō)明時(shí)能夠使 它們變得更好理解，其中：
[0029] 圖1示出了用于通過(guò)超速離心分離微泡的試驗(yàn)記錄示意圖。
[0030] 圖2示出了本發(fā)明的微泡分離方法的一個(gè)實(shí)施方式。
[0031]圖3示出了本發(fā)明的微泡分離方法的替代實(shí)施方式。
[0032] 圖4示出了通過(guò)過(guò)濾促進(jìn)生物流體的澄清和析出的微泡的收集的裝置的一個(gè)實(shí) 施方式。
[0033] 圖5示出了通過(guò)實(shí)施例1中所描述的超速離心法分離的（圖A和B)和根據(jù)本 發(fā)明的方法分離的（圖C和D)來(lái)源于使用人類骨來(lái)髓源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的 (conditioned)培養(yǎng)基的微泡的電子顯微照片，放大倍數(shù)如圖中所示。
[0034] 圖6示出了通過(guò)實(shí)施例1中所描述的超速離心法分離的（面板A和B)和根據(jù)本 發(fā)明的方法分離的（圖C和D)來(lái)源于使用豬骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基 的微泡的電子顯微照片，放大倍數(shù)如圖中所示。
[0035] 圖7示出了通過(guò)實(shí)施例1中所描述的超速離心法分離的（圖A和B)和根據(jù)本發(fā) 明的方法分離的（圖C和D)來(lái)源于使用小鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基 的微泡的電子顯微照片，放大倍數(shù)如圖中所示。
[0036] 圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的方法從人類血漿分離的微泡的電子顯微照片。圖A至C 示出了在增加放大倍數(shù)下的微泡，如圖中的比例尺所示。
[0037] 圖9示出了根據(jù)本發(fā)明的方法從豬血漿分離的微泡的電子顯微照片。圖A至C示 出了在增加放大倍數(shù)下的微泡，如圖中的比例尺所示。
[0038] 圖10示出了根據(jù)本發(fā)明的方法從人尿液分離的微泡的電子顯微照片。圖A至C 示出了在增加放大倍數(shù)下的微泡，如圖中的比例尺所示的。
[0039] 圖11示出了免疫印跡，其報(bào)告了 HSP70、CD63、STAT 3和磷酸化的STAT3在人類骨 髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的裂解物中、通過(guò)超速離心（hMSC MV超速離心）或通過(guò)如實(shí)施例3 中所描述的本發(fā)明的方法（hMSC PEG沉淀）制備的從使用人類骨髓來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng) 的培養(yǎng)基分離的微泡中的表達(dá)。還分析了來(lái)源于通過(guò)如實(shí)施例3中所述的本發(fā)明的方法制 備的人血漿和人尿液的微泡。分別為（人血漿PEG沉淀）和（人尿液PEG沉淀）。
[0040] 圖12示出了從使用人類骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡 對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞（A)、從糖尿病足潰瘍獲得的真皮成纖維細(xì)胞（B)和從壓力足部 潰瘍獲得的真皮成纖維細(xì)胞（C)的增殖的影響。還比較了通過(guò)超速離心分離的微泡（MV U/ C)和通過(guò)本發(fā)明的方法分離的微泡（MV PEG)的影響。將使用PBS或微泡耗盡的培養(yǎng)基處 理的成纖維細(xì)胞納入作為對(duì)照。使用MTT測(cè)定法確定增殖。
[0041]圖13示出了從使用人類骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡 對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞的迀移的影響，其通過(guò)成纖維細(xì)胞迀移至已被刮掉的區(qū)域中的能力來(lái) 確定。標(biāo)記了 "處理前"的圖示出了在添加測(cè)試處理前的除去了細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板的代表 性區(qū)域。以所示的濃度使用根據(jù)本發(fā)明的方法分離的微泡（PEG沉淀）和通過(guò)超速離心分 離的微泡（超速離心）測(cè)試成纖維細(xì)胞迀移的影響。將使用PBS或微泡耗盡的培養(yǎng)基處理 的成纖維細(xì)胞納入作為對(duì)照。
[0042]圖14示出了從使用人類骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡 對(duì)從糖尿病足潰瘍獲得的人真皮成纖維細(xì)胞的迀移的影響，其通過(guò)成纖維細(xì)胞迀移至已被 刮掉的區(qū)域中的能力來(lái)確定。標(biāo)記了"處理前"的圖示出了在添加測(cè)試處理前的除去了細(xì) 胞的細(xì)胞培養(yǎng)板的代表性區(qū)域。以所示的濃度使用根據(jù)本發(fā)明的方法分離的微泡（PEG沉 淀）和通過(guò)超速離心分離的微泡（超速離心）測(cè)試成纖維細(xì)胞迀移的影響。將使用PBS或 微泡耗盡的培養(yǎng)基處理的成纖維細(xì)胞納入作為對(duì)照。
[0043]圖15示出了本發(fā)明的微泡向人真皮成纖維細(xì)胞中的攝入。在標(biāo)記了 "Hoechst33342"的圖中示出了使用Hoechst 33342染料解析的細(xì)胞核。在標(biāo)記了 "Vybrant-Dio"的圖中示出了使用vybrant染料解析的細(xì)胞。在標(biāo)記了"PKH標(biāo)記的MV"的 圖中示出了使用PKH染料解析的微泡。在標(biāo)記了 "復(fù)合"的圖中可以看到其中重疊所有三 種染料獲得的圖像的圖。
[0044]圖16示出了本發(fā)明的微泡向人真皮成纖維細(xì)胞中的攝入。在標(biāo)記了 "Hoechst33342"的圖中示出了使用Hoechst 33342染料解析的細(xì)胞核。在標(biāo)記了 "Vybrant-Dio"的圖中示出了使用vybrant染料解析的細(xì)胞。在標(biāo)記了"PKH標(biāo)記的MV"的 圖中示出了使用PKH染料解析的微泡。在標(biāo)記了 "復(fù)合"的圖中可以看到其中重疊所有三 種染料獲得的圖像的圖。
[0045] 圖17示出了使用如下物質(zhì)處理的人真皮成纖維細(xì)胞的裂解物的免疫印跡：根據(jù) 本發(fā)明的方法從獲自于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的血漿分離的微泡（人血漿MV PEG沉 淀）；根據(jù)本發(fā)明的方法從使用骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡 (人類hMSC MV PEG沉淀）；通過(guò)超速離心從使用骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離的微泡（人 hMSC MV超速離心）；PBS對(duì)照；和耗盡的培養(yǎng)基對(duì)照（耗盡了 MV的hMSC條件培養(yǎng)的培養(yǎng) 基）。
[0046] 圖18示出了含有包含T1799A突變的BRAF的外顯子15的區(qū)域的存在，其中： SK-MEL28細(xì)胞，使用引物1從RNA擴(kuò)增（第3道）；SK-MEL28細(xì)胞，使用引物2從RNA擴(kuò)增 (第4道）；根據(jù)本發(fā)明的方法從使用SK-MEL28細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡，使用引 物1從RNA擴(kuò)增（第5道）；根據(jù)本發(fā)明的方法從使用SK-MEL28細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分 離微泡，使用引物2從RNA擴(kuò)增（第6道）；SK-MEL28細(xì)胞，使用引物1從DNA擴(kuò)增（第7 道）；SK-MEL28細(xì)胞，使用引物2從DNA擴(kuò)增（第8道）；根據(jù)本發(fā)明的方法從使用SK-MEL28 細(xì)胞分離的微泡，使用引物1從DNA擴(kuò)增（第9道）；和根據(jù)本發(fā)明的方法從使用SK-MEL28 細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡，使用引物2從DNA擴(kuò)增（第10道）。
[0047] 圖19示出了 V600E BRAF在SK-MEL28細(xì)胞的裂解物和根據(jù)本發(fā)明的方法從使用 SK-MEL28細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡的裂解物中的存在。
[0048] 圖20示出了根據(jù)本發(fā)明的方法從使用獲自于表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP)的小鼠 的骨髓來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡向人真皮成纖維細(xì)胞中的攝入。標(biāo) 記了"Hoechst33342"的圖中示出了使用Hoechst 33342染料解析的細(xì)胞核。標(biāo)記了 "Vybrant-Dio"的圖中示出了使用vybrant染料解析的細(xì)胞。標(biāo)記了 "GFP"的圖中示出了 GFP-標(biāo)記的微泡。在標(biāo)記了 "復(fù)合"的圖中可以看到其中重疊所有三種染料獲得的圖像的 圖。
[0049] 圖21示出了根據(jù)本發(fā)明的方法從使用獲自于表達(dá)GFP的小鼠的骨髓來(lái)源的干細(xì) 胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡向人真皮成纖維細(xì)胞中的攝入。標(biāo)記了 "H〇eChst33342" 的圖中示出了使用Hoechst 33342染料解析的細(xì)胞核。標(biāo)記了"Vybrant-Dio"的圖中示出 了使用vybrant染料解析的細(xì)胞。標(biāo)記了 "GFP "的圖中示出了 GFP-標(biāo)記的微泡。在標(biāo)記 了"復(fù)合"的圖中可以看到其中重疊所有三種染料獲得的圖像的圖。
[0050] 圖22示出了來(lái)自以下的傷后5天的全層傷口的組織切片：(A)未處理的動(dòng)物；(B) 根據(jù)本發(fā)明的方法從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡； (C)鹽水；和（D)通過(guò)超速離心從自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離的微泡。
[0051] 圖23示出了傷后7天的用如下物質(zhì)處理的動(dòng)物上的二度燒傷的圖片，所述物質(zhì) 是：(A)通過(guò)超速離心從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微 泡；(B)根據(jù)本發(fā)明的方法從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的 微泡；和（C)未處理的動(dòng)物。（D)示出了受傷7天后的使用通過(guò)超速離心從使用自體骨髓 來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡處理的動(dòng)物中的全層傷口。箭頭指示使 用通過(guò)超速離心分離的微泡處理的全層傷口在第7天的膿腫形成（40X)。這未在使用根據(jù) 本發(fā)明的方法制備的微泡處理的全層傷口中觀察到。
[0052] 圖24示出了來(lái)自使用根據(jù)本發(fā)明的方法從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條 件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡處理的動(dòng)物傷后28天的二度傷口的組織玻片。
[0053] 圖25示出了來(lái)自使用鹽水處理的動(dòng)物傷后28天的二度傷口的組織玻片。
[0054] 圖26示出了來(lái)自使用根據(jù)本發(fā)明的方法從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條 件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡處理的動(dòng)物傷后28天的全層傷口的組織玻片。
[0055] 圖27示出了來(lái)自使用根據(jù)本發(fā)明的方法從使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞條 件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡處理的動(dòng)物傷后28天的全層傷口的組織玻片。A示出了新神經(jīng) 生長(zhǎng)（箭頭）和血管生成（圈）。B示出了新神經(jīng)生長(zhǎng)（箭頭）