sas, VA)〇
[0299] 向該溶液中,以8. 5w/v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇(平均分子量 6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉(最終濃度0.4M)。將該溶液置于4°C 的冷室中搖動過夜。在4°C在lOOOOx g下將溶液離心30分鐘。傾析出上清液并且將富 集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將富集了微泡的溶液轉移至amicon 超-15離心過濾單元(標稱分子量100kDa) (Millipore, Billerica, MA)中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌過濾單元并且在5000x g再次離心30分鐘。 從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品(約200~400 yl)。通過微BSA蛋白質測定試劑盒 (Pierce,Rockford,IL)確定蛋白質濃度并且將經富集的微泡溶液貯存在-70度或加工用 于下游使用(例如,蛋白質、RNA和DNA的提?。?br>[0300] 實施例5:通過本發(fā)明的方法從骨髓穿刺液分離微泡
[0301] 從髂嵴分離豬骨髓。使用聚維酮碘7. 5%和異丙醇70%仔細清潔皮膚區(qū)。將11-規(guī) 格的3mm套針(Ranafac,Avon, MA)插入到髂嵴中。使抽吸注射器裝載有5000~1000單位 的肝素以防止骨髓樣品的凝固。抽吸約20~25ml骨髓并且將溶液轉移至50ml錐形離心 管中。替代地,從 AllCells LLC(Emeryville,CA, http://www.allcells.com)獲得正常供 體人骨髓(約50ml)。
[0302] 在室溫下在400x g下將所述50ml錐形管離心30分鐘。收集上清液(非細胞部 分)(每50ml約10~12ml)并且置于新的50ml維形離心管(Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)。以1:10 (骨髓上清液比培養(yǎng)基)的比率加入無菌的a -最低必需培養(yǎng)基 (a -MEM) (Mediatech Inc. , Manassas, VA)。將溶液轉移至新的50ml維形管中并且在4°C在 2000x g下離心30分鐘。將上清液轉移到新的50ml錐形管中并且向這種溶液中以8. 5w/ v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇(平均分子量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉(最終濃度0? 4M)。
[0303] 將所述溶液置于4°C的冷室中搖動過夜。在4°C在lOOOOxg下將溶液離心30分鐘。 傾出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將富集了微泡的 溶液轉移至amicon超-15離心過濾單元(標稱分子量100kDa) (Millipore, Billerica, MA) 中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌所述過濾單元并且再次在 5000x g下離心30分鐘。從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品(約200~400 yl)。通過微 BSA蛋白質測定試劑盒(Pierce, Rockford, IL)確定蛋白質濃度并且將經富集的微泡溶液 貯存在-70度或加工用于下游使用(例如,蛋白質、RNA和DNA的提?。?br>[0304] 收集細胞部分并且加工用于間充質干細胞分離或骨髓完全分離。
[0305] 實施例6:通過本發(fā)明的方法從尿液分離微泡
[0306] 分離約500ml清潔接取的人尿并且置于50ml錐形管(Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)中。
[0307] 將所述50ml錐形管在4°C在400x g下離心30分鐘。取出上清液并且置于新的 50ml維形離心管(Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)中。將溶液轉移至新的 50ml錐形管并且在4°C在2000x g下離心30分鐘。將上清液轉移至新的50ml錐形管,并 且向這種溶液中以8. 5w/v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇(平均分子量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉(最終濃度 0? 4M)。
[0308] 將溶液置于4°C的冷室中搖動過夜。在4°C在lOOOOxg下將溶液離心30分鐘。傾 析出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將富集了微泡的 溶液轉移至amicon超-15離心過濾單元(標稱分子量100kDa) (Millipore, Billerica, MA) 中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌過濾單元并且再次在5000x g下離心30分鐘。從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品(約200~400 yl)。通過微BSA 蛋白質測定試劑盒(Pierce, Rockford, IL)確定蛋白質濃度并且將經富集的微泡溶液貝士存 在-70度或加工用于下游使用(例如,蛋白質、RNA和DNA的提?。?br>[0309] 實施例7:通過本發(fā)明的方法從來自骨髓細胞長期培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離微泡
[0310] 從穿刺液(參見實施例1)獲得骨髓并且使用含有0.1 mM EDTA (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)的0. 8%氯化銨溶液裂解紅血球。在400X g在牛胎兒血清 (Atlanta Biologies, Atlanta, GA)墊層下丸?;泻思毎?分鐘。通過在400X g下丸 粒化5分鐘以在McCoys 5a培養(yǎng)基(Mediatech Inc.,Manassas, VA)中洗滌有核細胞。以 lx 106細胞/ml的密度將所述細胞再懸浮于培養(yǎng)基中并且接種在25、75或225cm2培養(yǎng)瓶 (Corning, Corning, NY)中。
[0311] 培養(yǎng)基由 McCoy's 5a 培養(yǎng)基、1 %碳酸氛納(Life technologies, Carlsbad, CA)、 0.4 % MEM 非必需氨基酸(Life technologies)、0? 8 % MEM 必需氨基酸(Life technologies)、1 % L 谷氨酰胺(Lonza, Allendale, NJ)、0? 1 y M 氫化可的松(Life technologies)、1 % 青霉素 / 鏈霉素(Lonza)、12. 5 % 胎牛血清(Atlanta Biologies)和 12. 5%馬血清(Stem Cell Technology)組成。在33°C和5% C02下培養(yǎng)所述培養(yǎng)物。在 培養(yǎng)的前九周期間,每周通過在不除去任何培養(yǎng)基的情況下添加原始體積的一半的培養(yǎng)基 以進行哺養(yǎng)。如果培養(yǎng)物生長超出九周,將培養(yǎng)基的體積減少至原始體積并且每周加入原 始體積一半的新鮮培養(yǎng)基。
[0312] 在培養(yǎng)約九周之后,取出原始培養(yǎng)基并且貯存。使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細 胞洗滌兩次并且在由McCoy's 5a培養(yǎng)基、1 %碳酸氫鈉、0. 4 % MEM非必需氨基酸、0. 8 % MEM 必需氨基酸(Life technologies)、1% L-谷氨酰胺(Lonza, Allendale, NJ)和 1%青霉素 /鏈霉素(Lonza)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。
[0313] 24小時后,將上清液轉移至50mL維形離心管(Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)并且立即在4°C在400x g下離心10分鐘以將任何非貼壁細胞丸?;?。將 貯存的原始培養(yǎng)基加回到所述細胞中。將上清液轉移至新的50mL錐形離心管中并且在4°C 在2000x g下離心30分鐘以進一步除去細胞和細胞碎片。
[0314] 收集上清液并且置于250ml無菌的丙稀一次性容器(Corning, Corning, NY)中。向 所述上清液中,以8. 5w/v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇(平均分子量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉(最終濃度0? 4M)。將溶液置于4°C的冷室 中搖動過夜。將溶液轉移到50mL錐形離心管中并且在4°C在10000x g下離心30分鐘。傾 析出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將富集了微泡的 溶液轉移至amicon超-15離心過濾單元(標稱分子量100kDa) (Millipore, Billerica, MA) 中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌過濾單元并且在5000x g下 再次離心30分鐘。從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品(約200 yl)。通過微BSA蛋白質測 定試劑盒(Pierce,Rockford,IL)確定蛋白質濃度并且將富集的微泡溶液貯存在-70度或 加工用于下游使用(例如,蛋白質、RNA和DNA的提取)。
[0315] 實施例8:本發(fā)明的微泡的分析
[0316] 通過電子顯微鏡分析微泡的樣品。對于透射電子顯微鏡(TEM),將微泡的每 個樣本加載在 formvar-涂布的 150 目銅格概(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington,PA)上20分鐘。使所述格柵排干并且漂浮在2 %戊二醛滴上5分鐘,然后在雙 蒸水(DD0H)中洗滌,隨后在4%水性醋酸雙氧鈾的滴上染色并且在DD0H中洗滌多次。在 Philips CM 10電子顯微鏡中在80kV檢查所述格柵。
[0317] 圖5示出了通過實施例1中所描述的超速離心法分離的(圖A和B)和根據實施 例3中描述的本發(fā)明的方法分離的(圖C和D)來源于人類骨髓來源的間充質干細胞的微 泡的電子顯微照片。圖6示出了通過實施例1中所描述的超速離心法分離的(圖A和B) 和根據實施例3中描述的本發(fā)明的方法分離的(圖C和D)來源于豬骨髓來源的間充質干 細胞的微泡的電子顯微照片。圖7示出了通過實施例1中所描述的超速離心法分離的(圖 A和B)和根據實施例3中描述的本發(fā)明的方法分離的(圖C和D)來源于小鼠骨髓來源的 間充質干細胞的微泡的電子顯微照片。
[0318] 圖5~7示出了通過本發(fā)明的方法分離的微泡相對于通過超速離心分離的微泡之 間的差異。通過本發(fā)明的方法分離的微泡具有更加平滑、無波紋且看起來更"完整"的邊緣。
[0319] 圖8示出了根據本發(fā)明的方法從人類血漿分離的微泡的電子顯微照片。使用PEG 分離實現(xiàn)的形狀和尺寸的不均勻性表明分離了所有類型的微泡。在根據本發(fā)明的方法從豬 血漿(圖9)和人尿液(圖10)分離的微泡中觀察到了類似的不均勻性。
[0320] 為了分析微泡的樣品中的蛋白質表達,在RIPA緩沖液(Cell signaling technology, Danvers, MA)中裂解細胞和微泡并且通過微BSA測試試劑盒 (Pierce,Rockford,IL)估算蛋白質濃度。將約20微克裂解物加載在各泳道中并且通過兔 抗-63 抗體(SBI Biosciences, Mountain View, CA)、兔抗 _hsp70(SBI Biosciences)、兔 STAT3(Cell signaling technology)和/或免磷_STAT3(Cell signaling technology)過 夜探測所述膜(1:1000)。
[0321] 外來體標志物(HSP 70和⑶63)的存在證實了本發(fā)明的方法能夠分離外來體。另 外,所述外來體還含有轉錄因子STAT3和活化磷酸化形式磷酸-STAT3。參見圖11。
[0322] 實施例9 :本發(fā)明的微泡對成纖維細胞增殖與迀移的影響
[0323] 為了研究本發(fā)明的微泡促進或增強傷口愈合的能力,測試了微泡模擬真皮成纖維 細胞的增殖的能力。從Life Technology (Carlsbad, CA)獲得正常人成年真皮成纖維細胞。 根據IRB批準的協(xié)議(IND#BB IND 13201),從雖然進行標準護理和高級傷口護理治療但持 續(xù)2年仍然沒有愈合跡象的傷口采集慢性創(chuàng)傷患者成纖維細胞(壓力足潰瘍和糖尿病足 潰瘍)。將正常和慢性創(chuàng)傷成纖維細胞以5x 10A3細胞/孔接種在24孔組織培養(yǎng)板(BD Biosciences, San Jose, CA)上。在第0天和第3天進行MTT細胞增殖測定。在第0天加入 微泡。在3天后,PEG分離的和超速離心分離的微泡在提高正常和慢性創(chuàng)傷成纖維細胞兩 者的生長上近似等價。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和耗盡了微泡的條件培養(yǎng)的MSC培養(yǎng)基顯示 出很少的生長。參見圖12。
[0324] 在共培養(yǎng)實驗中,將正常成年成纖維細胞和來自糖尿病足潰瘍的成纖維細胞接種 于24孔板中。每孔接種以達到100%匯合(約lx 105細胞/孔)。為了避免細胞增殖的影響, 在刮擦的2小時前,將培養(yǎng)基替換為新鮮的無血清含有10 y g/ml絲裂霉素的培養(yǎng)基。然后 使用lml的無菌移液器吸頭在鋪滿的單層上劃線以留下0. 4~0. 5mm寬的刮痕。然后立即 除去培養(yǎng)基(以及任何脫落的細胞)。使用含有微泡(PEG或超速離心來源的)、PBS或耗盡 了微泡的MSC條件培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)基(10% FBS)替換所除去的培養(yǎng)基。在刮擦后即刻以 及處理3天后通過采集數字化圖像來監(jiān)測被刮擦的區(qū)域。使用倒轉1X81奧林巴斯顯微鏡 (Olympus America, Center Valley, PA, http://www. olympusamerica. com)和0RCA-AG濱松 數碼相機(Hamamatsu Photonics K. K. , Hamamatsu City, Shizuoka Pref. , Japan, http:// www.hamamatsu.com)獲取數字化圖像。處理三天后,根據本發(fā)明的方法分離的微泡顯示出 最大的迀移(基本上關閉傷口),其次是來源于超速離心的微泡。對照(PBS)和耗盡了微泡 的MSC條件培養(yǎng)基(耗盡的)顯示出很少的迀移。參見圖13。
[0325] 圖14示出了微泡對來源于糖尿病足潰瘍的成纖維細胞的細胞迀移的影響。類似 于圖13中的結果,根據本發(fā)明的方法分離的微泡喚起了最大的迀移,其次是使用實施例1 中描述的超速離心法分離的微泡。對照(PBS)和耗盡了微泡的MSC條件培養(yǎng)基(耗盡的) 顯示出很少的迀移。
[0326] 實施例10 :將本發(fā)明的微泡攝入到細胞中
[0327] 使用磷脂細胞接頭染料PKH-26 (紅色)按照制造商的指示(Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)標記根據本發(fā)明的方法從條件培養(yǎng)基分離的人類MSC微泡。使用 Vybrant-Dio (Life technology)按照制造商的指示標記正常皮膚成纖維細胞。將正常皮膚 成纖維細胞接種在涂布有纖維結合蛋白(Sigma-Aldrich)的4-孔Nunc*Lab-Tek*II室玻 片(Thermo Fisher Scientific Inc, Weston,FL) (5x 103 細胞/孔)上。根據制造商的指 示使用核染料Hoechst 33342 (Life technology)對細胞進行染色。使用PKH-26標記的微 泡將Dio標記的成纖維細胞處理24小時。使用倒轉1X81奧林巴斯顯微鏡和0RCA-AG濱松 數碼相機獲得圖像。正常皮膚成纖維細胞(使用綠色脂質膜染料Dio染色的)展示了將通 過PEG沉淀分離的PKH-26標記的人類MSC MV攝入到了核周圍位置。參見圖15和圖16。 在圖16中,在核周圍位置看到了微泡。
[0328] 實施例11:本發(fā)明的微泡作為類風濕關節(jié)炎的診斷的用途
[0329] 將正常皮膚成纖維細胞以lx 105細胞/孔的密度接種于6孔組織培養(yǎng)板(BD Biosciences)中。使成纖維細胞缺乏血清過夜并且使用下列物質進行處理:PBS (對照); 10微克根據本發(fā)明的方法從獲自于患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血漿分離的微泡(人血 漿MV PEG沉淀);10微克根據本發(fā)明的方法從使用骨髓來源的間充質干細胞條件培養(yǎng)的培 養(yǎng)基分離的微泡(人類hMSC MV PEG沉淀);10微克通過超速離心從使用骨髓來源的間充 質干細胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離的微泡(人類hMSC MV超速離心);PBS對照;和耗盡的培 養(yǎng)基對照(耗盡了 MV的hMSC條件培養(yǎng)基)。在成纖維細胞中STAT3磷酸化的量大于在根 據本發(fā)明的方法分離的微泡中STAT3磷酸化的量。參見圖17。
[0330] 實施例12 :本發(fā)明的微泡作為轉移性黑色素瘤的診斷的用途
[0331] BRAF是一種制造稱為B-Raf的蛋白質的人類基因。已經鑒定出與人類癌癥相關的 超過30種BRAF基因的突變。我們已經設計了用于擴增與轉移性黑色素瘤有聯(lián)系的BRAF 突變形式的per引物。所述突變?yōu)樵贐RAF中的外顯子15中的T1799A突變。這導致在密 碼子600處的纈氨酸(V)被替換為谷氨酸(E)(現(xiàn)在稱為V600E)。這種突變的存在對于通 過BRAF抑制劑Vemurafenib的治療是必需的。
[0332]已經從ATCC (Washington DC, Maryland)獲得的 SK_Mel28 細胞系在BRAF 中的外顯 子15中具有T1799A突變。根據本發(fā)明的方法分離的微泡獲自于通過在EMEM(ATCC)+10% 血清(Atlanta biologies, Atlanta, Georgia)中培養(yǎng)3天的條件培養(yǎng)基。
[0333]使用 Qiagen's (Hilden, Germany) AUPrep DNA/RNA 試劑盒對所分離的微泡加工 以進行 DNA 和 RNA 的分離。使用 iScript?反轉錄 Supermix (Biorad, Hercules, CA)反 轉錄約 50ng 來自 SK-MEL28 細胞和微泡的 RNA。利用 Platinum? PCR SuperMix(Life technology)根據制造商的指示,將2 y 1等份試樣用于PCR。此外,利用Platinum?PCR 3即6-丨1根據制造商的指示,將801^來自31(-1^128細胞和微泡的0嫩用于?〇?。在3%瓊 脂糖凝膠上運行PCR產物并且通過Biorad凝膠-doc系統(tǒng)可視化。結果示于圖18中。
[0334] 所使用的引物為:
[0335]序列1:
[0336]正向:AGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
[0337]反向:CTGATGGGACCCACTCCATC
[0338] 擴增片段長度:70
[0339]序列2 :
[0340]正向:GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTG
[0341]反向:CTGATGGGACCCACTCCATC
[0342] 擴增片段長度:82
[0343] 此外,在RIPA緩沖液中裂解微泡的樣品并且通過微BSA測定試劑盒估算蛋白 質濃