、胰腺癌、腦癌（諸如成膠質(zhì)細胞瘤）、惡性血液病、肝細胞癌、子宮頸癌、 子宮內(nèi)膜癌、頭頸部癌、食道癌、胃腸道間質(zhì)瘤（GIST)、腎細胞癌（RCC)或胃癌。結(jié)腸直腸癌 可以是CRC Dukes B或Dukes C-D。惡性血液病可以是B-細胞慢性淋巴細胞白血病、B-細 胞淋巴瘤-DLBCUB-細胞淋巴瘤-DLBCL-生發(fā)中心樣、B-細胞淋巴瘤-DLBCL-活化的B-細 胞樣和伯基特氏腫瘤。所述表型還可以為癌前病況，如Barrett食管。
[0225] 所述表型還可以為炎癥性疾病、免疫性疾病或自身免疫性疾病。例如，所述疾病可 以是炎癥性腸?。↖BD)、克羅恩?。–D)、潰瘍性結(jié)腸炎（UC)、盆腔炎、血管炎、牛皮癬、糖尿 病、自免疫肝炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡（SLE)、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎干燥癥、CREST綜合癥、硬皮病、 風(fēng)濕性疾病、器官排斥、移植物抗宿主病、原發(fā)性硬化性膽管炎或敗血癥。
[0226]所述表型可以為心血管疾病，諸如動脈粥樣硬化、充血性心臟衰竭、易損斑塊、中 風(fēng)或缺血。心血管疾病或病況可以是血壓升高、管腔狹窄、血管閉塞或血栓形成事件。
[0227]所述表型還可以是神經(jīng)疾病，諸如多發(fā)性硬化（MS)、帕金森病（PD)、阿耳茨海默 氏病（AD)、精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁、自閉癥、朊病毒疾病、皮克病、癡呆、亨廷頓 ?。℉D)、唐氏綜合癥、腦血管病、拉斯姆森腦炎、病毒性腦膜炎、神經(jīng)精神系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (NPSLE)、肌萎縮側(cè)索硬化、克-雅各伯病、格斯特曼一施特勞斯納病（Gerstmann-Straussl er-Scheinker)、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷（例如中風(fēng)）、腦外傷、微生物感染、或 慢性疲勞綜合征。所述表型還可以是諸如纖維肌痛、慢性神經(jīng)性疼痛、或外周神經(jīng)性疼痛的 病況。
[0228]所述表型還可以是傳染病，諸如細菌、病毒或酵母感染。例如，所述疾病或病況可 以是惠普爾氏病、朊病毒疾病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜 炎、瘧疾、結(jié)核病或流感。可以在外來體中評估病毒蛋白，諸如HIV或HCV樣顆粒，以表征病 毒情況。
[0229] 所述表型還可以是圍產(chǎn)期或懷孕相關(guān)性病況（例如先兆子癇或早產(chǎn)）、代謝性疾 病或病況（諸如與鐵代謝相關(guān)的代謝性疾病或病況）。代謝性疾病或病況也可以是糖尿病、 炎癥或圍產(chǎn)期病況。
[0230] 表型可以通過任何合適的測定方法檢測，諸如例如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、PCR等?？?以組合所述測定方法以進行多于一種表型的多重分析?？梢詰?yīng)用于本發(fā)明的微泡的測定方 法的例子公開于PCT申請W02009092386A3和W02012108842A1中。
[0231] 在所述生物標(biāo)志物為RNA的情況下，可以通過美國專利8, 021，847中公開的方法 從本發(fā)明的微泡中分離RNA。
[0232] 在一個實施方式中，在用于診斷美國專利7, 897, 356中公開的病癥診斷試驗中使 用本發(fā)明的微泡。
[0233] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 211，653中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于癌癥診斷試驗中。
[0234] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 216, 784中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于癌癥診斷試驗中。
[0235] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 278, 059中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于前列腺癌診斷試驗中。
[0236] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 343, 725中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于癌癥存活預(yù)后診斷試驗中。
[0237] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 349, 568中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于癌癥存活預(yù)后診斷試驗中。
[0238] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 349, 560中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于急性淋巴細胞性白血病診斷試驗中。
[0239] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 349, 561中公開的方法，將本發(fā)明的微泡用 于急性淋巴細胞性白血病診斷試驗中。
[0240] 在一個實施方式中，在丙型肝炎病毒診斷試驗中利用本發(fā)明的微泡。在一個實施 方式中，根據(jù)美國專利7, 807, 438中描述的方法，從本發(fā)明的微泡中提取丙型肝炎病毒RNA 以測試丙型肝炎病毒在患者中的存在。
[0241] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 349, 574中公開的方法，在用于確定患者對 癌癥治療的反應(yīng)的診斷試驗中利用本發(fā)明的微泡。
[0242] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20120058492A1中公開的方法，在用于 診斷惡性腫瘤的診斷試驗中利用本發(fā)明的微泡。
[0243] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20120238467A1中公開的方法，在用于 診斷癌癥或不良妊娠結(jié)果的診斷試驗中利用本發(fā)明的微泡。
[0244] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20120214151A1中公開的方法，將本發(fā) 明的微泡用于尿液中HIV的診斷試驗中。
[0245] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20120309041A1中公開的方法，將本發(fā) 明的微泡用于心血管事件診斷試驗中。
[0246] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT申請W02012110099A1中公開的方法，將本發(fā)明的微 泡用于心血管事件診斷試驗中。
[0247] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT申請W02012126531A1中公開的方法，將本發(fā)明的微 泡用于心血管事件診斷試驗中。
[0248] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT申請W02013110253A3中公開的方法，將本發(fā)明的微 泡用于心血管事件診斷試驗中。
[0249] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT申請W02012135844A2中公開的方法，將本發(fā)明的微 泡用于黑色素瘤診斷試驗中。
[0250] 在一個實施方式中，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的診斷測試中利用本發(fā)明的微泡，其通過 測試根據(jù)本發(fā)明的方法分離的微泡以觀察生物標(biāo)志物BRAF的存在?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)印跡 或替代地通過PCR來確定BRAF的存在。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤試驗?zāi)軌驒z測 野生型和惡性BRAF。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤試驗?zāi)軌驒z測惡性BRAF的剪接變 體。
[0251] 在一個實施方式中，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的診斷試驗中利用的微泡是使用包含圖3 中概述的步驟的方法分離的。
[0252] 在一個實施方式中，微泡獲自于希望診斷轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的存在的患者。在一個 實施方式中，微泡獲自于患者的血漿。
[0253] 在一個實施方式中，使用下列兩個引物組中的一個通過PCR確定轉(zhuǎn)移性黑色素瘤 的存在：
[0254] 序列 1 :
[0255] 正向：AGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
[0256]反向：CTGATGGGACCCACTCCATC
[0257] 擴增片段長度：70
[0258] 序列 2 :
[0259] 正向：GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTG
[0260] 反向：CTGATGGGACCCACTCCATC
[0261] 擴增片段長度：82
[0262] 在另一個實施方式中，使用小鼠抗-BRAF V600E抗體（NewEast Biosciences, Malvern, PA)，通過蛋白質(zhì)印跡確定轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的存在。
[0263] 本發(fā)明的微泡在療法中的用途
[0264] 本發(fā)明的微泡可以用作療法以治療疾病。
[0265] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20030198642A1中描述的方法，將本發(fā) 明的微泡用作疫苗。
[0266] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20060116321A1中描述的方法，將本發(fā) 明的微泡用于調(diào)節(jié)或抑制患者的免疫反應(yīng)。
[0267] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT專利申請W006007529A3中描述的方法，將本發(fā)明的 微泡用于調(diào)節(jié)或抑制患者的免疫反應(yīng)。
[0268] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT專利申請W02007103572A3中描述的方法，將本發(fā)明 的微泡用于調(diào)節(jié)或抑制患者的免疫反應(yīng)。
[0269] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 288, 172中描述的方法，將本發(fā)明的微泡用 于調(diào)節(jié)或抑制患者的免疫反應(yīng)。
[0270] 在一個實施方式中，根據(jù)PCT專利申請W02011000551A1中描述的方法，將本發(fā)明 的微泡用作癌癥的療法。
[0271] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利申請US20120315324A1中描述的方法，將本發(fā) 明的微泡用作癌癥或炎癥性疾病的療法。
[0272] 在一個實施方式中，根據(jù)美國專利8, 343, 485中描述的方法，將本發(fā)明的微泡用 作血管損傷的療法。
[0273] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于向細胞遞送分子。所述分子的遞送可能 有用于治療或預(yù)防疾病。在一個實施方式中，根據(jù)PCT申請W004014954A1中描述的方法進 行所述遞送。在替代的實施方式中，根據(jù)PCT申請W02007126386A1中描述的方法進行所述 遞送。在替代的實施方式中，根據(jù)PCT申請W02009115561A1中描述的方法進行所述遞送。 在替代的實施方式中，根據(jù)PCT申請W02010119256A1中描述的方法進行所述遞送。
[0274] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于促進或增強傷口愈合。在一個實施方式 中，所述傷口是三度燒傷。在一個實施方式中，所述傷口是二度燒傷。
[0275] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于促進或增強患者中的血管生成。
[0276] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于促進或增強患者中的神經(jīng)元再生。
[0277] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于減少患者中的疤痕形成。
[0278] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于減少患者皮膚中的皺紋形成。
[0279] 在一個實施方式中，將本發(fā)明的微泡用于協(xié)調(diào)患者中的復(fù)雜的組織再生。
[0280] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其能夠促進復(fù)雜組織結(jié) 構(gòu)的功能再生和機化。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其能夠在患 有再生障礙性貧血的患者中再生造血組織。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微 泡的制劑，其能夠在具有患病、損傷或丟失的皮膚的患者中再生至少一種組織，所述組織選 自由上皮組織、基質(zhì)組織、神經(jīng)組織、血管組織和附屬結(jié)構(gòu)組成的組中。在一個實施方式中， 本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其能夠再生來自所有三個胚層的組織和/或細胞。
[0281] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其用于調(diào)節(jié)患者的免疫 系統(tǒng)。
[0282] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其增強移植到患者中的 組織或細胞的存活。在一個實施方式中，在接受移植的組織或細胞之前，使用所述分離的微 泡的制劑治療所述患者。在替代的實施方式中，在接受移植的組織或細胞之后，使用所述分 離的微泡的制劑治療所述患者。在替代的實施方式中，使用所述分離的微泡的制劑處理所 述組織或細胞。在一個實施方式中，在移植之前使用所述分離的微泡的制劑處理所述組織 或細胞。
[0283] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種分離的微泡的制劑，其含有從由來自宿主細 胞的RNA、DNA、脂質(zhì)、碳水化合物、代謝物、蛋白質(zhì)和它們的組合組成的組中選擇的至少一種 分子。在一個實施方式中，所述宿主細胞被工程化以表達選自由RNA、DNA、脂質(zhì)、碳水化合 物、代謝物、蛋白質(zhì)和它們的組合組成的組中的至少一種分子。在一個實施方式中，將含有 從由來自宿主細胞的RNA、DNA、脂質(zhì)、碳水化合物、代謝物、蛋白質(zhì)和它們的組合組成的組中 的至少一種分子的所述分離的微泡的制劑用作治療劑。
[0284] 下列實施例進一步闡明了本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的限制。
[0285] 實施例
[0286] 實施例1:通過超速離心從細胞培養(yǎng)基分離微泡
[0287] 本實施例闡明了從細胞培養(yǎng)基或任何生物流體分離微泡的典型方法。圖1中示出 了從細胞培養(yǎng)基分離微泡的方法的概要?？偟膩碚f，將細胞培養(yǎng)于補充有不含微泡的血清 (所述血清可以通過超速離心、過濾、沉淀等耗盡微泡）的培養(yǎng)基中。在將細胞培養(yǎng)一段時 間后，將培養(yǎng)基取出并且轉(zhuǎn)移至錐形管中并且在4°C在400x g下離心10分鐘以丸?；?細胞。隨后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的錐形管中并且在4°C在2000x g下離心30分鐘以進一步 除去細胞和細胞碎片。其隨后可以是另一個離心步驟（例如，l〇〇〇〇x g，30分鐘以進一步耗 盡細胞碎片和/或去除較大的微泡）。將得到的上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管中，稱量以確保重 量相等并且在4°C在70000+x g下超速離心70分鐘以丸?；⑴荨?br>[0288] 隨后棄去這種上清液并且將所述丸粒再懸浮于冰冷的PBS中。在4°C在70000+x g下將該溶液超速離心70分鐘以丸?；⑴?。將富集了微泡的丸粒重懸浮于小體積（約 50-100 yl)的適合緩沖液（例如，PBS)中。
[0289] 實施例2:通過本發(fā)明的方法從細胞培養(yǎng)基分離微泡
[0290] 本實施例闡明了如何通過本發(fā)明的方法從細胞培養(yǎng)基分離微泡。圖2和圖3中示 出了從具有培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基分離微泡的方法的概要?？偟貋碚f，將細胞培養(yǎng)于補充有不 含微泡的血清（所述血清可以通過超速離心、過濾、沉淀等耗盡微泡）的培養(yǎng)基中。在將細 胞培養(yǎng)一段時間后，取出培養(yǎng)基并且轉(zhuǎn)移至錐形管中并且在4°C在400x g下離心10分鐘以 丸粒化細胞。隨后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的錐形管中并且在4°C在2000x g下離心30分鐘以 進一步除去細胞和細胞碎片。其隨后可以是另一個離心步驟（例如，l〇〇〇〇x g，30分鐘以進 一步耗盡細胞碎片和除去較大的顆粒）。
[0291] 然后在4°C使用8. 5% w/v PEG 6000和0. 4M NaCl沉淀微泡。將這種混合物在4°C 在10000X g下旋轉(zhuǎn)30分鐘。除去上清液并且將丸粒再懸浮于適合的緩沖液（例如PBS) 中。其可以用于即刻的下游反應(yīng)或進一步純化。進一步純化工序可以包括使用離心過濾器 (例如100kDa的MWC0)、免疫親和、HPLC、切向流過濾、相分離/分配、微流體等。
[0292] 實施例3:通過本發(fā)明的方法從使用骨髓來源的干細胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離微 泡
[0293]正常供體的人骨髓獲自 AllCells LLC(Emeryville, CA, http://www. allcells. com)。通過標(biāo)準的塑料貼壁法分離MSC。使用Ficoll-Paque Premium(密度：1. 077g/ml)根 據(jù)制造商的協(xié)議（GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)通過低密度離心分離骨 髓單核細胞。在界面處收集單核細胞，在補充有2 % FBS (Atlanta Biologies, Atlanta, GA) 的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中洗滌三次，并且再懸浮于由a-最低必需培養(yǎng)基（a-MEM) (Mediatech Inc.，Manassas, VA)和 20% FBS, 1%青霉素 / 鏈霉素（Lonza，Allendale，NJ) 和1%谷氨酰胺（Lonza)組成的MSC培養(yǎng)基中。
[0294] 將MSC細胞或單核細胞各自的初始培養(yǎng)物以2~3x 105細胞/cm 2接種于組織培 養(yǎng)處理的培養(yǎng)皿（BD Biosciences，San Jose, CA)中并且置于37°C、95%潮濕空氣和5% C02的細胞培養(yǎng)器中。48~72小時之后，除去非貼壁細胞，使用PBS沖洗培養(yǎng)瓶一次，并且 向瓶中加入新鮮培養(yǎng)基。使細胞生長直到實現(xiàn)80%匯合，然后通過胰蛋白酶-EDTA(Life technologies, Carlsbad, CA)傳代。以1:4比例將細胞分開到5層的多層培養(yǎng)瓶（BD Biosciences)中。替代地，在37°C下將冰凍的MSC解凍并且立即在37°C、95%潮濕空氣和 5% C02中在補充有20%不含微泡的牛胎兒血清和1 %青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的a -MEM 中培養(yǎng)。類似于上述對它們進行擴增。
[0295] 使細胞在多層培養(yǎng)瓶中生長直到達到80~90%匯合。使用PBS沖洗培養(yǎng)瓶兩次 并且加入補充有1 %青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的a -MEM。24小時之后，將所述條件培養(yǎng) 基轉(zhuǎn)移到50mL維形離心管（Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)中并且立即在 4°C在400x g下離心10分鐘以丸粒化任何非貼壁細胞。將上清液轉(zhuǎn)移至新的50mL錐形離 心管中并且在4°C在2000x g下離心以進一步去除細胞和細胞碎片。
[0296] 收集上清液并且置于250ml無菌的聚丙稀一次性容器（Corning, Corning, NY) 中。向所述上清液中，以8. 5w/v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇（平均分子 量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉（最終濃度0.4M)。將該溶液置 于4°C的冷室中搖動過夜。將溶液轉(zhuǎn)移至50mL錐形離心管中并且在4°C在10000X g下 離心30分鐘。傾析出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS) 中。將富集了微泡的溶液轉(zhuǎn)移至amicon超-15離心過濾單元（標(biāo)稱分子量限制100kDa) (Millipore, Billerica, MA)中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌 所述過濾單元并且再次在5000x g下離心30分鐘。從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品（約 200 y 1)。通過微BAS蛋白質(zhì)測定試劑盒（Pierce, Rockford, IL)確定蛋白質(zhì)濃度并且將經(jīng) 富集的微泡溶液貯存在-70度下或加工用于下游使用（例如，蛋白質(zhì)、RNA和DNA提取）。
[0297] 實施例4:通過本發(fā)明的方法從血漿分離微泡
[0298] 通過靜脈穿刺采集約6~8ml血液（人和豬）并且置于BD真空采血管塑料EDTA 淡紫色管（BD Biosciences，San Jose，CA)中。在室溫下在400x g將靜脈穿刺管離心30分 鐘。取出血衆(zhòng)（約3~4ml)并且置于新的50ml錐形離心管（Thermo Fisher Scientific Inc，WeSt〇n，F(xiàn)L)中。以1:10(血漿比培養(yǎng)基）的比率加入無菌的a-最低必需培養(yǎng)基 (a -MEM)(Mediatech Inc. , Manas