度。底土約50微克加載在各泳道中并且通過小鼠抗-BRAF V600E抗體（NewEast Biosciences, Malvern, PA)對膜進(jìn)行探測過夜（1:1000)。以1:10000稀釋度將二次抗體山 羊抗-小鼠（Pierce)施用1小時(shí)。蛋白質(zhì)印跡顯示了 SKMEL28細(xì)胞和MV裂解物中的BRAF V600E檢測。
[0344] 實(shí)施例13:通過本發(fā)明的方法從使用GFP-標(biāo)記的骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培 養(yǎng)物條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離微泡
[0345]從 Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)獲得在人類泛素 C啟動(dòng)子 (C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)的指引下表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白（GFP)的純合子轉(zhuǎn)基 因小鼠。已知這些小鼠在所有組織中均表達(dá)GFP。
[0346] 通過C02室息對GFP-小鼠（約3~4周齡）實(shí)施安樂死。在髖關(guān)節(jié)上側(cè)和踝關(guān)節(jié) 下側(cè)切斷四肢。收獲后肢并且除去皮膚、肌肉和所有結(jié)締組織。然后將骨骼置于冰冷的無 菌IXPBS的平皿中并且在PBS中洗滌數(shù)次。使用剪刀剪掉每一根骨頭的端部。迫使具有 溫?zé)崤囵B(yǎng)基（補(bǔ)充有20%牛胎兒血清和1 %青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的a-MEM)的10cc 注射器通過骨軸以將所有的骨髓提取到150mm盤中。將此重復(fù)數(shù)次以確保所有的骨髓被取 出。將細(xì)胞混合物吸移數(shù)次以離解細(xì)胞并且將細(xì)胞懸浮液通過細(xì)胞過濾器（70 ym尺寸） (BDBiosciences,SanJose,CA)以除去大細(xì)胞團(tuán)塊或骨顆粒。
[0347] 將初始培養(yǎng)物以2~3x 105細(xì)胞/cm 2接種于組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)皿（BD Biosciences，San Jose，CA)中并且置于37°C、95%潮濕空氣和5%C02中的細(xì)胞培 養(yǎng)器中。72~96小時(shí)之后，除去非貼壁細(xì)胞，使用PBS沖洗培養(yǎng)瓶一次，并且向瓶 中加入新的培養(yǎng)基。使細(xì)胞生長直至達(dá)到80%匯合，然后通過胰蛋白酶-EDTA(Life technologies, Carlsbad, CA)傳代。以 1:4 的比分開細(xì)胞。
[0348] 替代地，在37°C將冰凍的GFP小鼠-MSC解凍并且立即在37°C在95%潮濕空氣和 5% C02中在補(bǔ)充有20%牛胎兒血清和1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的a-MEM中培養(yǎng)。 與上述類似，將它們擴(kuò)增。
[0349] 在瓶中生長所述細(xì)胞直到達(dá)到100%匯合（約1周）。將上清液轉(zhuǎn)移到50mL錐形 離心管（Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)中并且立即在 4°C在 400x g 下離心 10分鐘以丸?；魏畏琴N壁細(xì)胞。將上清液轉(zhuǎn)移至新的50mL錐形離心管中并且在4°C在 2000x g下離心30分鐘以進(jìn)一步除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
[0350] 收集上清液并且置于250ml無菌的聚丙稀一次性容器（Corning, Corning, NY)中。 向該上清液中，以8. 5w/v%加入不含核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇（平均分子量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉（最終濃度0? 4M)。將溶液置于4°C的冷室 中搖動(dòng)過夜。將所述溶液轉(zhuǎn)移到50mL錐形離心管并且在4°C在10000X g下離心30分鐘。 傾析出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)。將富集了微泡的 溶液轉(zhuǎn)移至amicon超-15離心過濾單元（標(biāo)稱分子量lOOkDa) (Millipore, Billerica, MA) 中并且在5000x g下離心30分鐘。使用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌所述過濾單元并且再次在 5000x g下離心30分鐘。從過濾裝置的底部回收濃縮的樣品（約200~400 yl)。通過微 BSA蛋白質(zhì)測定試劑盒（Pierce, Rockford, IL)確定蛋白質(zhì)濃度并且將經(jīng)富集的微泡溶液 貯存在-70度或加工用于下游使用（例如，蛋白質(zhì)、RNA和DNA的提取）。
[0351] 為了確定微泡的細(xì)胞攝入，根據(jù)制造商的說明使用Vybrant-Dio (Life technology)標(biāo)記正常人皮膚成纖維細(xì)胞。將正常皮膚成纖維細(xì)胞接種在纖維結(jié)合蛋白 (Sigma-Aldrich)涂布的4-孔Nunc*Lab_Tek*II 室玻片（Thermo Fisher Scientific Inc) (5x 103細(xì)胞/孔）上。按照制造商的指示使用核染料Hoechst 33342 (Life technology) 將細(xì)胞染色。使用從表達(dá)GFP的小鼠MSC分離的微泡將Dil標(biāo)記的成纖維細(xì)胞處理24小 時(shí)。使用倒數(shù)1X81奧林巴斯顯微鏡和0RCA-AG濱松數(shù)碼相機(jī)獲取圖像。參見圖20和圖 21。重要的是，這些圖像示出了含有GFP的微泡被細(xì)胞吸收。
[0352] 實(shí)施例14 :本發(fā)明的微泡作為用于促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合的用途
[0353] 使用10mm打孔活檢儀在豬背上制造全層傷口。根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法（"常 規(guī)的"超速離心法）或通過實(shí)施例3中描述的方法從使用自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條 件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離微泡。在受傷的時(shí)刻和在第1天和第2天通過局部注射將30微克微 泡施用至所述傷口。對照使用鹽水處理或使其暴露于空氣中愈合。5天之后，使動(dòng)物安樂 死，并檢查傷口。
[0354] 圖22示出了受傷5天后的傷口的組織學(xué)。在第5天，使用根據(jù)本發(fā)明的方法（即 根據(jù)實(shí)施例3中描述的方法）分離的微泡處理的傷口看起來比鹽水對照、空氣暴露對照和 使用通過超速離心制備的微泡處理的傷口更小。與使用根據(jù)本發(fā)明的方法制備的微泡處 理的傷口和兩個(gè)對照相比，使用通過超速離心制備的微泡處理的傷口顯示出增強(qiáng)的炎癥反 應(yīng)。
[0355] 在另一個(gè)研究中，使用加熱至100°C的黃銅棒在豬背上產(chǎn)生二度燒傷傷口。根據(jù)實(shí) 施例1中描述的方法（"常規(guī)的"超速離心法）或通過實(shí)施全3中描述的方法從使用自體 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基分離微泡。在受傷的時(shí)刻和在第1天及第2天 通過局部注射將30微克微泡施用于所述傷口。對照使用鹽水處理或使其暴露于空氣中愈 合。
[0356] 在實(shí)驗(yàn)的過程中（燒傷后長達(dá)28天），與使用根據(jù)本發(fā)明的方法（即，根據(jù)實(shí)施 例3中描述的方法）制備的微泡處理的傷口相比，使用通過超速離心制備的微泡處理的傷 口顯著更加紅腫。參見圖23,類似地，使用通過超速離心制備的微泡處理的傷口比鹽水對照 和空氣暴露對照顯著更加紅腫。使用根據(jù)本發(fā)明的對照制備的微泡處理的燒傷傷口沒有表 現(xiàn)出比對照顯著更加紅腫。
[0357] 圖23示出了在受傷后的第7天，使用通過超速離心制備的微泡處理的傷口、根據(jù) 本發(fā)明的方法制備的微泡處理的傷口和空氣暴露對照之間的炎癥的差異。在顯微鏡下，在 使用通過超速離心制備的微泡處理的全層傷口和燒傷傷口兩者中均看到了膿腫形成。使用 通過超速離心制備的微泡所注意到的炎癥被認(rèn)為是由于受損的微泡引起的，其可以容易地 刺激炎癥級聯(lián)反應(yīng)。通過包括附加顆粒，本發(fā)明的微泡還可以賦予附加益處。
[0358] 圖24示出了使用通過本發(fā)明的方法分離的微泡處理的燒傷28天后的二度豬燒傷 傷口。存在膠原的顯著重塑，具有基礎(chǔ)物質(zhì)的外觀。這些發(fā)現(xiàn)象征著具有III型膠原形成 的真皮重塑。還存在真皮表皮誘導(dǎo)，其產(chǎn)生了似乎良好錨定至真皮的加厚表皮。這些發(fā)現(xiàn) 在疤痕形成中是未觀察到的且更符合真皮再生。形成在疤痕上的表皮由于不能良好的錨定 至疤痕真皮而容易再次受傷。
[0359] 圖25示出了使用鹽水處理的燒傷28天后的二度豬燒傷傷口。存在極微的真皮再 生，具有扁平的表皮。重要的網(wǎng)脊形成的不足高度地暗示著不充分錨定的表皮。這些發(fā)現(xiàn) 更加象征著具有持續(xù)傷害的風(fēng)險(xiǎn)的疤痕形成。
[0360] 圖26示出了使用根據(jù)本發(fā)明的方法分離的微泡處理的受傷28天后的全層豬傷 口。存在神經(jīng)（由箭頭示出）向重塑真皮中的生長，可能是由所施用的微泡所刺激的。神 經(jīng)生長伴隨著血管生成反應(yīng)（圓圈區(qū)域）。神經(jīng)似乎是完善的組織結(jié)構(gòu)，而不是歸因于簡 單軸突出芽。這是一種獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)且從未被報(bào)道過，并且在對照傷口或使用通過超速離心 制備的微泡處理的傷口也未觀察到。這些觀察高度象征著復(fù)雜組織再生，其具有從所有胚 層（包括表皮、間質(zhì)、血管及神經(jīng)組織）生成成熟元素的能力。那么，這些方法似乎可以廣 泛適用于治療許多病況，包括外胚層、內(nèi)胚層和中胚層來源的組織的外傷、炎癥、腫瘤及退 化性病癥。
[0361] 圖27示出了受傷28天后使用通過本發(fā)明的方法分離的微泡處理的全層豬傷口。 該圖在更大的放大倍率下示出了圖26中所描述的觀察內(nèi)容。在A)中，神經(jīng)生長似乎跟隨著 與血管生成反應(yīng)有關(guān)的路徑。這一發(fā)現(xiàn)使人感興趣，因?yàn)楸娝苤?，神?jīng)生長在胚胎發(fā)育中 追隨血管生成。再次，這些發(fā)現(xiàn)象征著組織再生。B)示出了處于更高能力（higher power) 下的神經(jīng)。C)更好地示出了與神經(jīng)生長鄰近的血管生成。
[0362] 在豬全層傷口模型中的全部治療組（對照和微泡治療的）中均看到了骨形成。參 見圖28。動(dòng)物接受總計(jì)1.44mg微泡（一半根據(jù)本發(fā)明的方法制備的和一半通過超速離心 制備的）。此后，似乎存在刺激骨在所有傷口中形成的全身效果。骨形成傾向于更多地發(fā)生 在更多的炎癥傷口中，表明了局部炎癥介質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)和微泡的全身效應(yīng)。
[0363] 實(shí)施例15 :本發(fā)明的微泡作為用于重新填充骨髓和重新生成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的療法的 用途
[0364] 使用兩個(gè)循環(huán)的400cGy y射線對C57/CJ6 (GFP )進(jìn)行致死劑量照射以消融其宿 主骨髓祖細(xì)胞。在照射之后，使用燒蝕分?jǐn)?shù)鉺：YAG激光器在約2cm2面積中處理所述小鼠。 在激光處理之后，將一塑料室附著于皮膚，并且向室中加入獲自于同系基因GFP +轉(zhuǎn)基因小 鼠的骨骼來源的細(xì)胞。所述GFP+骨髓細(xì)胞包括新收獲的全骨髓細(xì)胞、沿襲陰性選定的骨髓 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓完全培養(yǎng)細(xì)胞（如本申請中所描述的）。在施用細(xì)胞后的4~ 6周，通過循環(huán)GFP +細(xì)胞檢測，僅有少數(shù)動(dòng)物能夠?qū)崿F(xiàn)嵌合狀態(tài)。參見圖29。驚奇地，許多 動(dòng)物都存活了，沒有供體骨髓移植的跡象?？偣?0%的接收細(xì)胞的動(dòng)物存活了下來（在所 有給予細(xì)胞的組中）。在不同的組之間，接受沿襲陰性選擇的細(xì)胞（45%)以及新骨髓細(xì)胞 (30%)的動(dòng)物的存活率最高。沒有接受細(xì)胞的對照照射動(dòng)物具有100%的死亡率。細(xì)胞因 子都沒有類似地營救類似致死劑量照射的動(dòng)物并且在這些存活的動(dòng)物中均不能展示功能 供體骨髓的植入。由遞送的細(xì)胞分泌的微泡可能擔(dān)負(fù)著宿主骨髓的恢復(fù)，從而導(dǎo)致了這些 動(dòng)物的存活。我們已經(jīng)證明，新鮮骨髓（其包括沿襲陰性細(xì)胞）和間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生了可 以實(shí)現(xiàn)這種效果的充足量的微泡。
[0365] 在另一個(gè)研究中，使用兩個(gè)循環(huán)的400cGyy射線對C57/CJ6(GFP )進(jìn)行致死劑量 照射以抑制它們的毛發(fā)生長和部分消融它們的骨髓。在照射之后，剃光小鼠的背部并且使 用燒蝕分?jǐn)?shù)鉺：YAG激光器在約2cm 2面積中處理所述小鼠。在激光處理之后，將一塑料室附 著于皮膚，并且向室中加入獲自于同系基因GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓來源的細(xì)胞。所述GFP + 骨髓細(xì)胞包括新收獲的全骨髓細(xì)胞、沿襲陰性選定的骨髓細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓完全 培養(yǎng)細(xì)胞（如本申請中所描述的）。在施用細(xì)胞后的4~6周，通過循環(huán)GFP +細(xì)胞檢測，在 動(dòng)物中不能夠?qū)崿F(xiàn)嵌合狀態(tài)。參見圖30。接受單獨(dú)的激光處理的動(dòng)物從不具有到具有非常 微少的短粗硬的毛發(fā)生長。圖30(A)。在給予骨髓細(xì)胞的動(dòng)物中，存在顯著、長期持續(xù)的毛 發(fā)生長。圖30 (A和B)。這些發(fā)現(xiàn)在使用GFP+沿襲陰性選定的細(xì)胞和全新GFP +骨髓細(xì)胞 處理的小鼠中是最驚人的。在2周內(nèi)可以檢測到毛發(fā)生長并且持續(xù)生長數(shù)月。在新毛發(fā)生 長區(qū)域中進(jìn)行皮膚切片檢查，但未檢測到GFP +細(xì)胞。通過FACS分析在任何動(dòng)物中也均不 能檢測到骨髓細(xì)胞的功能植入。圖30(C)。如同圖29中的例子，已經(jīng)證明，細(xì)胞因子在恢復(fù) 毛發(fā)生長中沒有這種效果。由所遞送的細(xì)胞分泌的微泡可能是刺激毛發(fā)生長的原因。
[0366] 實(shí)施例16:本發(fā)明的微泡用于促進(jìn)或刺激血管生成以及用于促進(jìn)或刺激成纖維 細(xì)胞增殖的用途
[0367]骨髓穿刺液微泡的分離:從Allcells，Inc. (Alameda, CA)獲得約25ml新鮮全骨 髓。將骨髓小心地置于新的50ml錐形離心管中并且在室溫下在400x g下離心30分鐘。小 心地取出上清液（約15ml)并且置于新的50ml錐形離心管（Thermo Fisher Scientific Inc, Weston, FL)中并且在4°C下在2000x g下離心30分鐘。再次小心地取出上清液并且 置于新的50ml錐形離心管中，向其中以1:10(骨髓上清液比培養(yǎng)基）的比率加入無菌的 a _ 最低必需培養(yǎng)基（a _MEM) (Mediatech Inc.，Manassas, VA)。向這種溶液中，以 8. 5w/ v%加入無核糖核酸酶和蛋白酶的聚乙二醇（平均分子量6000) (Sigma Aldrich, Saint Louis, M0)以及氯化鈉（最終濃度0.4M)。將所述溶液置于4°C的冷室中搖動(dòng)過夜。將所述 溶液在4°C在10000x g下離心30分鐘。傾析出上清液并且將富集了微泡的丸粒再懸浮于 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中。將所述富集了微泡的溶液轉(zhuǎn)移至amicon超-15離心過濾單元 (標(biāo)稱分子量100kDa)(Millipore，Billerica，MA)中并且在5000x g下離心30分鐘。使用 磷酸鹽緩沖鹽水洗滌所述過濾單元并且再次在5000x g下離心30分鐘。從過濾裝置的底 部回收經(jīng)濃縮的樣品（約200-400 y 1)。
[0368]血管牛成測定:使用內(nèi)皮管道形成測定法（Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)測量血管生成。在75-cm2組織培養(yǎng)瓶中，將凍存的原代人 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC) (Invitrogen Life Technologies)在補(bǔ)充有2%低血清生長補(bǔ)充 的培養(yǎng)基200PRF(Invitrogen Life Technologies)中生長6天。然后以3x 104的密度將細(xì) 胞接種于含有不存在補(bǔ)充的培養(yǎng)基的24孔組織培養(yǎng)板中。隨后使用骨髓微泡（約100 y g) 處理HUVEC細(xì)胞。將PBS用作賦形劑對照。在37°C和5% 0)2下將經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)6小 時(shí)。將2iig/ml濃度的Calcein AM熒光染料用于可視化表示管形成。使用倒轉(zhuǎn)1X81奧林 巴斯顯微鏡（Olympus America, Center Valley, PA)獲得焚光圖像。與賦形劑（PBS)對照 相比，骨髓MV顯示出顯著的管形成能力（參見圖31)。
[0369]牛長測定:將正常成年成纖維細(xì)胞接種于24-孔板（10000細(xì)胞/孔）的生長培養(yǎng) 基（5% FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素）中以用于測定。在過夜培養(yǎng)之后，隨機(jī)選 定三孔并且使用 NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Invitrogen Life technologies) 進(jìn)行染色（第0天）。使用EVOS FL自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)（Invitrogen Life technologies) 獲取熒光圖像。使用含有骨髓來源的微泡（約100 yg)或PBS(賦形劑對照）再喂養(yǎng)成纖 維細(xì)胞并且在三天后（第3天）染色和成像。骨髓來源的微泡處理的成纖維細(xì)胞在數(shù)量上 增加了約三倍（與第0天相比）并且比率顯著大于對照（圖32,面板A和圖32,面板B)。
[0370] 盡管上文通過參照實(shí)施例和優(yōu)選的實(shí)施方式闡明了本發(fā)明的各個(gè)方面，但可以理 解的是，本發(fā)明的范圍不受前述說明的界定，而是由根據(jù)專利法原則適當(dāng)解釋的下列權(quán)利 要求來界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用沉淀劑從生物流體分離和/或純化微泡的方法，所述沉淀劑通過置換溶劑 化的水從所述生物流體沉淀出微泡。2. -種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)血管生成。3. -種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)神經(jīng)元再生。4. 一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)細(xì)胞增殖。5. -種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)細(xì)胞迀移。6. -種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合。7. -種分離的微泡的制劑，其減少疤痕形成。8. -種分離的微泡的制劑，其減少皺紋形成。9. 一種分離的微泡的制劑，其用于診斷疾病在患者中的存在和/或進(jìn)展。10. 如權(quán)利要求9所述的分離的制劑，其中，所述疾病是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。11. 一種分離的微泡的制劑，其促進(jìn)復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的功能再生和機(jī)化。12. -種分離的微泡的制劑，其能夠再生患有再生障礙性貧血的患者中的造血組織。13. -種分離的微泡的制劑，其能夠在具有患病、損傷或缺失的皮膚的患者中再生至少 一種選自如下組的組織，所述組選由上皮組織、基質(zhì)組織、神經(jīng)組織、血管組織和附屬結(jié)構(gòu) 組成。14. 一種分離的微泡的制劑，其能夠再生來自所有三種胚層的組織和/或細(xì)胞。15. -種分離的微泡的制劑，其用于調(diào)節(jié)患者的免疫系統(tǒng)。16. -種分離的微泡的制劑，其增強(qiáng)植入到患者中的組織或細(xì)胞的存活。17. 如權(quán)利要求16所述的分離的微泡的制劑，其中，在接受所述植入的組織或細(xì)胞之 前，使用所述分離的微泡的制劑治療所述患者。18. 如權(quán)利要求16所述的分離的微泡的制劑，其中，在接受所述植入的組織或細(xì)胞之 后，使用所述分離的微泡的制劑治療所述患者。19. 如權(quán)利要求16所述的分離的微泡的制劑，其中，使用所述分離的微泡的制劑處理 所述組織或細(xì)胞。20. 如權(quán)利要求16所述的分離的微泡的制劑，其中，在移植之前使用所述分離的微泡 的制劑處理所述組織或細(xì)胞。21. -種分離的微泡的制劑，其來源于經(jīng)工程化以表達(dá)選自由RNA、DNA、脂質(zhì)、碳水化 合物、代謝物、蛋白質(zhì)和它們的組合組成的組中的至少一種分子。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和生物液體分離并純化微泡的方法。本發(fā)明還提供微泡的藥物組合物，其用于促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合、刺激組織再生、改造疤痕組織、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、改變腫瘤細(xì)胞的生長和/或可動(dòng)性、或改變正常細(xì)胞的生長和/或可動(dòng)性。本發(fā)明還提供欲用作診斷試劑的微泡的組合物以及制備所述微泡的組合物的方法。
【IPC分類】A61P37/00, C12N15/88, A61K9/127, A61P25/00, G01N1/40, A61P17/00, G01N1/34
【公開號】CN105209881
【申請?zhí)枴緾N201480026884
【發(fā)明人】E·V·巴迪亞瓦斯, A·Q·沙比爾, S·C·戴維斯
【申請人】邁阿密大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年3月12日
【公告號】CA2906502A1, EP2972193A1, US20160184363, WO2014159662A1