專利名稱：促尿鈉排泄化合物、軛合物及其用途的制作方法
1.相關(guān)申請本申請基于遞交日為2004年5月26日，未決的，題為“促尿鈉排泄化合物、軛合物及其用途”的美國臨時專利申請第60/574,436號，并要求其優(yōu)先權(quán)。本申請將該申請中全部公開內(nèi)容都全文引用作為參考，與此同時，出于這些權(quán)利要求合法主張的全部目的，本申請還要求該專利申請中遞交日所主張的權(quán)益。
2.政府支持聲明本發(fā)明是在NIH撥款#1 R43 HL074529-01資助的研究計劃下申請的。美國政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
3.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及促尿鈉排泄化合物軛合物和促尿鈉排泄化合物變體，及其在治療充血性心臟病和與該病癥相關(guān)病癥中的用途。例如，本發(fā)明的所述組合物提供了具有藥理活性的促尿鈉排泄劑和原藥，其可適用于口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)或皮下給藥的制劑中。本發(fā)明還提供了制備所述促尿鈉排泄化合物軛合物，化合物以及含有這些化合物和軛合物的制劑制劑的方法，同時還提供了使用這些軛合物和化合物的方法。例如，所述促尿鈉排泄化合物軛合物包含如下的促尿鈉排泄肽該肽包括NPR-A結(jié)合基序，至少一個修飾部分軛合位點，同時還包括與所述修飾部分軛合位點連接的至少一個修飾部分。在一些實施方案中，所述化合物軛合物保留了天然促尿鈉排泄肽的藥理活性，與此同時，還具有改進的特征，例如改進的生物利用率，對蛋白水解活性提高的抗性，和/或在血液中延長的活性。在其他實施方案中，所述化合物軛合物被作為可水解原藥提供，與天然促尿鈉排泄肽相比，原藥形式其藥理活性有所降低，并且當所述原藥在體內(nèi)水解后，可以釋放出具有活性的促尿鈉排泄化合物。
本發(fā)明還涉及重組肽和蛋白領(lǐng)域，以及制備這些重組肽和蛋白的方法。尤其是，本申請在此公開了促尿鈉排泄肽和蛋白質(zhì)的類似物。在一些實施方案中，本發(fā)明所述促尿鈉排泄化合物的類似物被描述成具有如下的氨基酸序列與所述對應的促尿鈉排泄肽的天然序列相比，該序列具有至少一個取代的氨基酸。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的促尿鈉排泄化合物的類似物被描述成具有以下肽的天然形式的藥理活性腦型促尿鈉排泄肽(BNP)，尤其是人BNP(hBNP)，尿擴張素，犬腦促尿鈉排泄肽(cBNP)，心房促尿鈉排泄肽(ANP)，尤其是人ANP(hANP)，樹眼鏡蛇促尿鈉排泄肽(DNP)，或C-型促尿鈉排泄肽(CNP)，尤其是人CNP(hCNP)。
4.發(fā)明背景無論性別或種族如何，心血管疾病是美國人的頭號死亡原因。在這些疾病當中，充血性心力衰竭(CHF)是唯一一類呈普遍上升趨勢的疾病(Massie and Shah 1997；Packer and Cohn 1999)。根據(jù)美國心臟協(xié)會的報道，從1979年到1999年，由于CHF出院和死亡的患者數(shù)量都大約升高了2.5倍。目前，大約有5百萬美國人被診斷患有CHF，并且每年還會新增大約550,000個病例(美國心臟協(xié)會2001)。這種致命的疾病總是伴隨著巨大的金錢花費。事實上，這是最大的單項醫(yī)療保險開銷(Kayser 2002)。據(jù)估計，治療CHF的直接和間接費用高達560億美元(Hussar 2002)。用于治療HF的醫(yī)院花費甚至比那些治療所有類型癌癥費用合起來的兩倍還多(O’Connell and Bristow 1994)。
CHF是一種常見的死亡原因，其通常都伴隨有高額的間接治療費用以及較高的死亡率。一旦患者被診斷患有CHF，一年內(nèi)的死亡率為約20％(美國心臟協(xié)會2001)。由于相同病癥的再次入院可能性也非常高，近來也進行了若干關(guān)于再次入院的研究(Chin and Goldman 1997；Krumholz，Parent et al.1997；Krumholz，Chen et al.2000)。確診一年內(nèi)的再次入院率超過35％是很常見的(Tsuchihashi，Tsutsui et al.2001)。這樣頻繁的復發(fā)會導致多次急救就診以及入院治療(Krumholz，Parentet al.1997)。多次入院治療和不充分的治療就是那些患CHF的患者面對的現(xiàn)狀。
一項最近的隨機研究表明，基于家庭的干涉可以極大地降低CHF患者的重新入院率，延長存活率，并且改善生活質(zhì)量(Stewart，Marley etal.1999)。在一項針對社會經(jīng)濟因素的獨立研究中，Tsuchihashi等人認為，為了降低與CHF相關(guān)的死亡率和總開銷，門診處理和基于家庭的照顧都是必要的(Tsuchihashi，Tsutsui et al.2001)。顯而易見，在這一不斷增長的市場中，亟需針對基于門診病人的應用廣泛的新療法。
腦型促尿鈉排泄肽(BNP)是涉及心血管、腎臟和內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)的肽家族之一。它是在1988年發(fā)現(xiàn)的(Sudoh，Kangawa et al.1988)，幾乎是在心房促尿鈉排泄肽(ANP)發(fā)現(xiàn)之后的十年。雖然它最初是從豬腦中分離得到的，但其卻以對心血管平滑肌和內(nèi)皮細胞中的受體具有活性而為公眾所知。BNP是一種由心臟產(chǎn)生的內(nèi)源肽。其首先是以原前-BNP產(chǎn)生的，隨后縮短兩倍成為活性形式，即具有一個二硫鍵的32個氨基酸的肽。
如圖1所示，BNP結(jié)合于促尿鈉排泄肽受體A(NPR-A)，其是細胞表面的膜結(jié)合蛋白。該結(jié)合事件引發(fā)了細胞液中由鳥苷酸環(huán)化酶導致的cGMP合成。正是通過這種第二信使，使得BNP實現(xiàn)了與其相關(guān)聯(lián)的心血管、腎臟和內(nèi)分泌效應?？梢酝ㄟ^幾種不同的方式實現(xiàn)對BNP的調(diào)節(jié)?？梢詫⒔Y(jié)合于NPR-A和刺激cGMP產(chǎn)生的BNP分子從循環(huán)中去除，還可以通過其他方法在不引起其他反應的條件下去除BNP。最常見的去除方式是通過與清除受體、促尿鈉排泄肽受體C(NPR-C)的結(jié)合來實現(xiàn)。當與NPR-C結(jié)合后，所述肽即被攝入細胞并且被酶促清除。另一種主要的清除方式是采用中性肽內(nèi)切酶(NEP)的降解，所述內(nèi)切酶是細胞表面的一種膜結(jié)合酶。最后，通過腎濾過作用將BNP清除至較低水平。
在正常情況下，在心房和心室中都能低量產(chǎn)生BNP。然而，當心室在心代償過程中進行收縮時，BNP的產(chǎn)量急劇升高。雖然也涉及到心房，但心室依然是主要的產(chǎn)生位置。在CHF發(fā)病時，響應于在心代償過程中心室的收縮，心臟產(chǎn)生了BNP。BNP的效應包括尿鈉增多，利尿，血管舒張和舒張壓降低。這些效應都是通過第二信使，即環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)的作用產(chǎn)生的。當BNP與促尿鈉肽受體A(NPR-A)，即位于血管、腎臟和肺內(nèi)皮細胞表面的膜結(jié)合受體相互作用時，引發(fā)了cGMP的產(chǎn)生。BNP的血漿濃度隨著CHF嚴重程度的增加而增加。除了這樣的增加，BNP的有益效果會在嚴重的CHF中受到鈍化，從而在明顯的CHF中提高相對缺乏狀態(tài)的可能性?；蛘?，考慮到目前采用的旨在測定BNP的血漿濃度的分析方法不能將前原-BNP和成熟形式特異性區(qū)分開來，在明顯的CHF中，這種原-激素并未被充分地加工成其成熟形式。因此，無論是心臟產(chǎn)生的BNP量過量，或者是前原-BNP并未充分地轉(zhuǎn)化成其活性形式，其有益作用都會降低。由于其產(chǎn)生于心臟疾病發(fā)病的早期，BNP就成了檢測患者具有逐漸發(fā)展成CHF的較高風險的重要診斷標記(Yamamoto，Burnett et al.1996；McDonagh，Robbet al.1998；Richards，Nicholls et al.1998；Nagaya，Nishikimi et al.2000；Kawai，Hata et al.2001；Maisel，Krishnaswamy et al.2002；McNairy，Gardetto et al.2002)。
BNP可以幾種方式發(fā)揮作用來緩解心失代償。顧名思義，BNP可導致鈉的排泄和尿排出量的上升，其能夠降低充血。其還可作為血管舒張劑來發(fā)揮作用，該效果可通過若干其他作用得到增強。這些作用中最值得注意的是BNP在干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中起的作用。這導致了腎素的抑制，而腎素是血管收縮肽血管緊張素產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。其可以抑制血管組織襯里上皮細胞的過度生長，當其保持未受抑制狀態(tài)時，可以極大地降低血流。BNP發(fā)揮緩解心代償作用的最后一種方式是其松弛性作用。其可改善心室的心肌舒張，從而導致較低的舒張壓。
在將肽用作藥物時有許多客觀的限制。消化道和血液中的蛋白質(zhì)水解作用是將肽用作治療劑的主要障礙。非內(nèi)源性肽所遭遇到的另一個難題是免疫原性。綜上，制藥業(yè)的策略是采用藥物化學的方法生產(chǎn)小的非肽類分子。雖然這一方法有所成功，但其成本高，費時，且在藥代動力學和毒性方面具有不確定性。此外，在肽受體上對具有激動劑活性的有機小分子進行鑒定也格外地具有挑戰(zhàn)性。
迄今為止，盡管“PEG化”蛋白的使用已經(jīng)日臻成熟，但其還是僅局限于注射用途。本發(fā)明提供了可口服的多肽軛合物，例如人腦型促尿鈉排泄肽(hBNP)。特別地，本發(fā)明提供了包括如下組成的軛合物在充血性心力衰竭的治療制劑中，與治療性肽和蛋白相連的PAG。這些制劑隨后可發(fā)揮作用來保護hBNP免受蛋白水解酶的消化，并允許這一制劑作為有效的人促尿鈉排泄肽受體A的激動劑。作為這種激動劑活性的結(jié)果，cGMP的產(chǎn)量會有所升高。
2001年8月，hBNP(天然肽)被FDA批準為治療急性充血性心力衰竭的藥物，商品名為Natrecor_(Nesiritide(奈西立肽))。Natrecor_是在12年中第一個被批準用于治療CHF的藥物。其是通過靜脈連續(xù)灌注48小時以上進行給藥的。由于該藥物昂貴并要求住院治療，Natrecor_僅被用于大多數(shù)急性病例。與一些其他的治療相比，盡管Natrecor_昂貴且使用不便，其還是通過減少患者在重癥監(jiān)護病房所度過的時間而較為便宜。
目前，約有5百萬美國人患有CHF，并且每年還新加超過550,000個病例(美國心臟協(xié)會2001)。目前，用于治療CHF的直接開銷已超過200億美元(美國心臟協(xié)會2001)。伴隨著現(xiàn)已獲得的能夠在心臟病發(fā)生之前就對發(fā)生心力衰竭進行檢測的診斷方法，亟需可用于門診病人或基于家庭應用的用途廣泛的藥物。
5.發(fā)明概述本發(fā)明廣泛地包括了與其天然存在對應物相比具有一種或多種益處的若干天然存在的促尿鈉排泄肽、蛋白、類似物的變體和修飾形式，以及這些促尿鈉排泄肽的化學軛合物。例如，這些益處包括對蛋白酶降解的抗性的提高，在血流中持續(xù)時間的延長，和/或穿過細胞膜屏障的能力的改善。
如本發(fā)明某些實施方案所述的促尿鈉排泄化合物軛合物包括如下的促尿鈉排泄化合物，該促尿鈉排泄化合物含有促尿鈉排泄蛋白受體A結(jié)合基序(NPR-A)，至少一個修飾部分軛合位點，以及至少一個與所述修飾部分軛合位點結(jié)合的修飾部分。如本說明書所述，由于與所述促尿鈉排泄化合物連接的修飾部分可作為所述軛合物的一部分，所以，與不含有修飾部分的天然促尿鈉排泄化合物相比，所述促尿鈉排泄化合物軛合物可具有被修飾的親水性質(zhì)。例如并不局限于此，正如在此將更詳細說明的那樣，所述修飾部分可采取任一尺寸(大小)、形狀、取代和構(gòu)象的寡聚物形式。
在一些情況下，與天然促尿鈉排泄化合物的對應未軛合形式相比，所述促尿鈉排泄化合物軛合物的特征在于其至少部分增加了對酶降解，例如蛋白水解的抗性。與對應的未軛合天然促尿鈉排泄化合物相比，這些化合物軛合物的進一步特征在于其保留了生物學活性，例如cGMP刺激活性的治療顯著性百分比。所述保留的cGMP刺激活性通常為體內(nèi)測定的促尿鈉排泄肽未軛合形式的cGMP活性的至少30％，40％，50％，60％，70％，90％，95％，或者甚至高于99％或100％。與未修飾(未軛合)的促尿鈉排泄化合物相比，具有修飾部分的本發(fā)明所述促尿鈉排泄化合物軛合物的其他改進特征包括所述促尿鈉化合物穿過GI道并且進入血流的能力的改善；所述促尿鈉化合物親水性、疏水性或雙親性的改善；所述促尿鈉化合物在水性環(huán)境或有機溶劑中的溶解性的改善；所述促尿鈉化合物穿過細胞膜的能力的改善；所述促尿鈉化合物穿過血腦屏障的能力的改善；所述促尿鈉化合物靶定某種受體、細胞、組織或器官的能力的改善；以及所述促尿鈉化合物的藥代動力學的分布的改善。在優(yōu)選實施方案中，在pH為約2，時間少于約2小時的條件下，所述促尿鈉化合物的生物學活性成分的降解要弱于未修飾(未軛合)的生物學活性促尿鈉排泄化合物的降解。在存在有血漿、蛋白酶、肝臟勻漿、酸性條件和/或堿性條件的情況下，所述促尿鈉排泄化合物的促尿鈉排泄化合物成分作為所述促尿鈉排泄化合物軛合物的成分，例如可比未軛合促尿鈉排泄化合物更穩(wěn)定。
本發(fā)明的促尿鈉排泄肽軛合物可包括與所述天然肽相關(guān)的抗高血壓效應，心血管效應，腎效應，和/或內(nèi)分泌效應。在一些實施方案中，對所述促尿鈉排泄肽的修飾將保護諸如hBNP的肽免于蛋白水解并協(xié)助其穿過消化道遞送至系統(tǒng)循環(huán)中，從而導致尿鈉增多，利尿，和/或血管舒張。本發(fā)明的促尿鈉排泄肽軛合物可因此被作為口服制劑(而不是在醫(yī)院環(huán)境中持續(xù)數(shù)天的靜脈灌注)有效地進行遞送?？梢灶A期，通過進行此前尚無可能的自我給藥，這一優(yōu)點可降低與其他CHF治療相關(guān)的醫(yī)院費用，并且將促尿鈉排泄肽，尤其是hBNP的治療用途擴展至包括早期(例如1類)和慢性CHF以及急性CHF。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是非免疫原性肽軛合物，其對分解酶具有增強的抗性，同時適于口服遞送且能夠穿過腸上皮。
本發(fā)明還提供了若干制備所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法。這些修飾部分，例如，可采用線性和分支PAG或其他聚合結(jié)構(gòu)的形式。
6.定義除非另有說明，本說明書中所采用的所有技術(shù)和科學術(shù)語都與本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)理解相一致。用于本發(fā)明說明書中的術(shù)語僅旨在對特定的實施方案進行描述而并非旨在對本發(fā)明進行限制。小標題的使用是為了方便讀者亦非對本發(fā)明進行限制。和在本文中通過其商品名所涉及到的任一商品藥的藥品說明書一樣，在此涉及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都被全文引用作為參考。
除非文中特別說明，單數(shù)形式的“a”，“an”和“the”也都包括了復數(shù)形式。
正如在本說明書和權(quán)利要求中所用到的，這些術(shù)語的意義如下除非特別說明，在本說明書中的“氨基酸”是指以L或D立體異構(gòu)形式存在的任一天然存在、人工生產(chǎn)或合成的氨基酸。術(shù)語“殘基”可以與術(shù)語“氨基酸”相互替換，并通常被指定在氨基酸的給定序列的特定位置上。
正如37C.F.R.§1.822(b)中所指定的那樣，用于本說明書中的全部氨基酸縮寫都為美國專利和商標局所接受。本發(fā)明的說明書中使用的是以下單字母氨基酸縮寫。Xaa用于指代未知或未命名的氨基酸。在此提供的位于特定殘基結(jié)構(gòu)上的整數(shù)是該殘基的位置編號。這一殘基編號可用來與單字母氨基酸名稱相連，如下所述，可對促尿鈉排泄肽類似物，例如hBNP和ANP中發(fā)生取代的殘基進行指定。
因此，例如，當合成了突變體hBNP，即野生型hBNP的3位殘基上的賴氨酸(K)為精氨酸(R)所替代時，可使用“BNPK3R”或“hBNP(1-32)K3R”進行命名。如下所示，可以采用逗號將每個取代分隔開來的方式對多個取代的情況進行指名。
術(shù)語“hBNP(1-32)K3R，K14R，K27R”是指上述的hBNP序列具有在殘基位置3的賴氨酸為精氨酸所取代(即，K3R)，殘基位置14的賴氨酸為精氨酸所取代(即，K14R)和殘基位置27的賴氨酸為精氨酸所取代(即，K27R)的三重hBNP突變體。其他的突變體也可按類似的方式進行定義。
術(shù)語“hBNP(1-32)K3R，K14R”是指在hBNP殘基位置3和14的賴氨酸為精氨酸所取代的雙重突變體。
A＝ala＝丙氨酸 L＝leu＝亮氨酸 nle＝正亮氨酸R＝arg＝精氨酸 K＝lys＝賴氨酸 cha＝環(huán)己基丙氨酸N＝asn＝天冬酰胺M＝met＝甲硫氨酸A*＝har＝高精氨酸D＝asp＝天冬氨酸F＝phe＝苯丙氨酸orn＝鳥氨酸C＝cys＝半胱氨酸P＝pro＝脯氨酸 pen＝青霉胺Q＝gln＝谷氨酰胺S＝ser＝絲氨酸 phg＝苯基甘氨酸E＝glu＝谷氨酸 T＝thr＝蘇氨酸 mpa＝巰基丙酸G＝gly＝甘氨酸 W＝trp＝色氨酸 a＝ala*＝D甘氨酸H＝his＝組氨酸 Y＝tyr＝酪氨酸 C*＝高半胱氨酸I＝ile＝異亮氨酸V＝val＝纈氨酸“兩性分子的”是指具有能夠溶解于水和脂類中的能力和/或具有親水性和疏水性的特征，而術(shù)語“兩性部分”和“兩性化合物”則是指具有兩性分子特征，和/或當與肽或非肽藥物連接時，能夠增加所得軛合物，例如，PEG-脂肪酸寡聚物，糖脂肪酸寡聚物雙親性的部分。
“生物學活性”是指具有治療或藥理活性的制劑，例如激動劑、部分激動劑或拮抗劑。
在本說明書中的“有效量”是指無毒性但足以提供所需要治療效果的量。正如下文所指出的，，根據(jù)患者的年齡，患者的一般情況，擬進行治療病癥的嚴重程度，所給藥的特殊生物學活性制劑等，所需要的確切量在患者與患者之間有所差異。在任一單個病例中，適當?shù)摹坝行А绷慷伎梢杂杀绢I(lǐng)域所屬技術(shù)人員參考相關(guān)文本和文獻和/或采用常規(guī)的實驗來進行確定。
“可水解的”是指可在生理條件下水解的分子鍵。
“親水性的”是指溶解于水的能力，而術(shù)語“親水性部分”或“親水物”則是指具有親水性，和/或當與其他化學實體連接時，能夠增加所述化學實體親水性的部分。實例包括但不限于糖和諸如聚乙二醇的聚烷撐部分。
“親脂性的”是指對脂肪具有親和性，例如能夠在脂肪和脂肪組織中積累的化學物質(zhì)，能夠在脂類中溶解，和/或能夠穿透生物膜，與生物膜相互作用和/或橫貫生物膜的能力，而術(shù)語“親脂性部分”或“親脂物”則是指具有親脂性，和/或當與其他化學實體連接時，能夠增加所述化學實體親脂性的部分。
“低級烷基”是指具有1，2，3，4，5或6個碳原子的取代或未取代的烷基部分。
“單分散的”是指這樣的化合物混合物，該混合物中約100％的所述化合物都具有相同的分子量。
在本發(fā)明所述組合物中，“藥用的”成分，例如鹽，載體，賦形劑或稀釋劑，是指能與所述組合物中其他成分配伍的成分，其能夠在不消除所述生物學活性制劑的生物學活性條件下與本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物軛合物結(jié)合，并可適用于本說明書所提供的患者而不產(chǎn)生不適當?shù)母弊饔?例如毒性、刺激，和過敏反應)。當所述藥物組合物產(chǎn)生的風險高于其提供的益處時，副作用即為“不適當?shù)摹?。藥用成分的例子包括，但不限于，任意的標準藥物載體，例如磷酸緩沖鹽溶液，水，諸如油/水乳劑的乳劑，微乳劑和多種類型的濕潤劑。
“聚烷撐二醇”或PAG是指線性或分支的聚烷撐二醇聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)和聚丁二醇(PBG)，及其組合(例如，包括兩種或更多種不同PAG亞單位，例如兩種或更多種選自PEG，PPG，PPG和PBG亞單位的不同PAG亞單位的線性或分支的聚合物)，還包括了聚烷撐二醇的單烷基醚。在特定的實施方案中，所述聚烷撐二醇是聚乙二醇或“PEG”。術(shù)語“PEG亞單位”是指單個聚乙二醇單位，即，-(CH2CH2O)-。術(shù)語“PPG亞單位”是指單個聚丙二醇單位，即，-(CH2CH2CH2O)-。術(shù)語“PBG亞單位”是指單個聚丁二醇單位，即，-(CH2CH2CH2CH2O)-。PAG亞單位還可包括烷基側(cè)鏈，例如甲基，乙基或丙基側(cè)鏈。
“原藥”是指經(jīng)過化學衍生得到的生物學活性制劑，因此，當對患者給藥后，所述原藥可被代謝從而產(chǎn)生具有生物學活性的制劑。
在本說明書中的“治療”或“進行治療”是指能夠給予患疾病或病癥患者以益處的任意類型的治療，包括改善患者的疾病(例如，在一種或多種癥狀方面)，延緩所述疾病的發(fā)展，預防或延緩所述疾病或病癥的發(fā)生，增強正常的生理官能等。
7.


圖1所示為BNP的作用方式和調(diào)節(jié)方式。
圖2所示為寡聚物活化和遵循三層次軛合策略的軛合的代表性示意圖。1類修飾部分是非水解性的，2類修飾部分是微PAG化的，而3類修飾部分是可完全水解性的。
圖3所示為HAEC細胞的環(huán)GMP產(chǎn)生與hBNP或hBNP軛合物的濃度間的函數(shù)關(guān)系。(■＝天然的，▲＝BN-002，_＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)圖4所示為BNP和BNP軛合物的胰蛋白酶消化。(-●-＝時間(分鐘)比％BND1，·●·＝時間(分鐘)比％BND2，_＝時間(分鐘)比％BND2，_＝時間(分鐘)比％BN034 D1，■＝時間(分鐘)比％BN034 D2)圖5所示為大鼠口服給藥之后不同時間的hBNP軛合物的血漿水平。(■＝BN-002，▲＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)圖6a-d所示為1類、2類和3類軛合物的檢測結(jié)構(gòu)和結(jié)果的數(shù)據(jù)。
8.發(fā)明詳述如本發(fā)明某些實施方案所述的促尿鈉排泄化合物軛合物包含有如下的促尿鈉排泄化合物，該促尿鈉排泄化合物包括促尿鈉排泄蛋白受體A結(jié)合基序(NPR-A)，至少一個修飾部分軛合位點，以及至少一個與所述修飾部分軛合位點結(jié)合的修飾部分。如本說明書所述，由于與促尿鈉排泄化合物連接的修飾部分可作為所述軛合物的一部分，所以，與不含有修飾部分的天然促尿鈉排泄化合物相比，所述促尿鈉排泄化合物軛合物可具有被修飾的親水性性質(zhì)。例如但并不局限于此，正如在此將更詳細說明的那樣，所述修飾部分可采取任一大小、形狀、取代和構(gòu)象的寡聚物形式。
8.1促尿鈉排泄化合物本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物軛合物含有如下的促尿鈉排泄化合物，該促尿鈉排泄化合物包括有促尿鈉排泄肽受體，例如NPR-A的結(jié)合位點，以及與修飾部分結(jié)合的軛合位點。
8.1.1天然促尿鈉排泄肽促尿鈉排泄化合物可含有來自不同種屬，例如人類、犬類和大鼠天然促尿鈉排泄肽，例如ANP，BNP，CNP或DNP，尿擴張素的氨基酸序列。優(yōu)選的天然促尿鈉排泄肽是人BNP，大鼠BNP，犬BNP或hANP。天然序列還可包括原-促尿鈉排泄肽和前-原肽。
8.1.2促尿鈉排泄化合物類似物促尿鈉排泄化合物還可以是天然促尿鈉排泄肽(促尿鈉排泄類似物)的生物學活性類似物。例如，生物學活性類似物可以是具有截短、缺失、插入、取代、替換、側(cè)鏈延伸和融合蛋白的天然促尿鈉排泄化合物，或者是不會消除該原始化合物生物學活性的前述化合物的組合。優(yōu)選地，所述類似物包括天然或人工NPR-A結(jié)合基序，并且保留了一些或全部的NPR-A結(jié)合活性。
可采用多種方式獲得促尿鈉排泄肽類似物。例如，可以在不消除相互結(jié)合能力的條件下，用某些氨基酸取代天然促尿鈉排泄肽結(jié)構(gòu)中的另一些氨基酸。在一些情況中，正如在本領(lǐng)域中所描述的那樣，與清除受體NPC-C相比，這樣的修飾可導致對NPR-A的親和力的升高，從而獲得延長的半衰期。
優(yōu)選地，所述類似物可包括促尿鈉排泄分子結(jié)合基序，例如NPR-A結(jié)合基序。
所述促尿鈉排泄肽可以，例如，具有以下序列CFGRXMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO 1)，其中X是包括有修飾部分軛合位點的化合物，例如，氨基酸殘基。在一些實施方案中，X含有與修飾部分連接的氨基酸。例如，X可含有與修飾部分連接的Lys或Cys。在其他實施方案中，X還可以是除賴氨酸之外的氨基酸；在這些實施方案中，本發(fā)明的另一方面是未軛合的肽，其中X是精氨酸，或者可以建立軛合位點的除賴氨酸之外的其他氨基酸。
這些實施方案的其他結(jié)構(gòu)是CFGRX1MDRIX2GLGC(SEQ ID NO.2)，其中X1是賴氨酸，X2是一個至四個氨基酸。X2可以是S，SS，SSS，SSSS(SEQ ID NO.3)，K，KS，KSS或KSSS(SEQ ID NO.4)。其中K可包括于X2中或X2的部分序列中，作為修飾部分軛合位點。
所述促尿鈉排泄化合物可以，例如，具有以下結(jié)構(gòu)X1-CFGRX3MDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.5)，其中，X1和X2中至少之一存在，X1是1到10個氨基酸的肽，其中X2是1，2，3，4，5或6個氨基酸的肽，且其中X3是除賴氨酸之外的氨基酸，例如精氨酸。例如，X1可包括hBNP的全部或從其N末端的1-10個氨基酸殘基序列的C末端片段。在一個實施方案中，X1包括SPZ1MVQGSG-(SEQ ID NO6)，SPZ1MVQG(SEQ ID NO.7)，SPZ1MVQ(SEQ ID NO.8)，SPZ1MV(SEQ ID NO.9)，SPZ1M(SEQ ID NO.10)，SPZ1，PZ1MVQGSG(SEQ ID NO.11)，Z1MVQGSG(SEQ ID NO.12)，其中Z1是賴氨酸或精氨酸。當Z1是賴氨酸時，可以提供修飾部分軛合位點。在另一個實施方案中，X2可包括hBNP的全部或從其C末端的1-6個氨基酸殘基序列的N末端片段。在一個實施方案中，X2是序列Z2VLRRH(SEQ.ID.NO.13)，Z2VLRR(SEQ.ID.NO.14)，Z2VLR(SEQ.ID.NO.15)，Z2VL，K，R，RVLRR(SEQ.ID.NO.16)，RVLR(SEQ.ID.NO.17)，RVL，RV或R，其中Z2可以是賴氨酸或精氨酸。當Z2是賴氨酸時，可以提供修飾部分軛合位點。當Z1是賴氨酸時，Z2可以是除賴氨酸之外的氨基酸，而當Z2是賴氨酸時，Z1可以是除賴氨酸之外的氨基酸?；蛘?，X1和X2可以是從任意促尿鈉排泄肽獲得的任意N末端或C末端氨基酸序列。在一些實施方案中，可以存在有N-末端和/或C末端序列，但卻不能是hBNP的N末端和C末端序列或其任意片段。應該理解未軛合促尿鈉排泄化合物也是本發(fā)明的一個方面。
在一個實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物類似物具有以下氨基酸序列X1MVQGSGC1FGRX2MDRISSSSGLGC2X3(SEQ ID NO.18)，其中X1，X2和X3都獨立選自Lys和除Lys之外的氨基酸，而且其中X1，X2和X3中至少有一個是Lys且X1，X2和X3中至少有一個是除Lys之外的氨基酸；且C1和C2是半胱氨酸并可通過二硫鍵結(jié)合。應該理解未軛合的肽類似物也是本發(fā)明的一個方面。
在一個實施方案中，X1，X2和X3中至少有一個是Arg。在其他實施方案中，X1是Lys，X2是Arg且X3是Arg。這一實施方案還可包括如本說明書所述的氨基酸序列，至X1的N末端和/或至X3的C末端。例如，所述N末端序列，當存在時，可以是S-或SP-，而所述C末端，當存在時，可以是-VLRRH(SEQ ID NO.19)，-VLRR(SEQ ID NO.19)，-VLR，-VL或-V。在一些實施方案中，存在有N-末端和/或C末端序列，但卻不能是hBNP或其片段的N末端和C末端。
在其他實施方案中，所述促尿鈉排泄肽類似物包括以下氨基酸序列CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(SEQ ID NO 20)，其中，X1和X2中至少有一個是氨基酸，該氨基酸包括與所述修飾部分結(jié)合的修飾部分軛合位點，而另一個則是任意其他氨基酸或未軛合的Lys。在一個實施方案中，X1是在其側(cè)鏈與所述修飾部分結(jié)合的Lys，而X2是其他氨基酸，例如Gly或Arg?；蛘?，X2是在其側(cè)鏈與所述修飾部分結(jié)合的Lys，而X1是其他氨基酸，例如Gly，Arg或除賴氨酸之外的氨基酸。在其他實施方案中，X1是在其側(cè)鏈與所述修飾部分結(jié)合的Lys，而X2是未軛合的Lys。或者，X2是在其側(cè)鏈與所述修飾部分結(jié)合的Lys，而X1是未軛合的Lys。應該理解所述未軛合的肽也是本發(fā)明的一個方面。
實際上，可以根據(jù)本發(fā)明對任意促尿鈉排泄肽進行修飾。例如，作為適合于進行修飾的候選物的肽/蛋白描述在PCTUS0217567中，在此具體引入用作參考。BNP，例如，包括有天然序列中的Lys殘基，其可優(yōu)選作為寡聚物的軛合位點。在BNP為天然肽的本發(fā)明某些實施方案中，所希望的是從所述肽的結(jié)合區(qū)域去除任意的軛合位點或去除結(jié)合位點。當希望寡聚物不與所述肽序列的特定Lys殘基連接時，可使用其他氨基酸，例如精氨酸來取代所述Lys。例如，在這一區(qū)域與非水解性寡聚物的軛合的活性是至關(guān)重要的，盡管本申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)在Lys14位置上的軛合導致所保留的活性量很明顯。因此，希望采用具有類似化學性質(zhì)但卻不易軛合的氨基酸來替換這樣的軛合位置。例如，在hBNP序列中，可采用Arg來取代Lys14，由此使得所述肽在該肽序列的Lys3上更容易與天然BNP軛合?？梢赃x擇氨基酸取代方法使用不容易軛合的氨基酸來替換Lys。
在一些情況下，所需要的是添加適于軛合的其他位置。例如，在一些實施方案中，可采用Lys殘基替代荷正電的氨基酸殘基，例如，在ANP肽(天然序列)中，可采用Lys替代Arg27。
可以選擇通過突變來增加軛合位置，從而使得突變和軛合都不會削減所得的肽軛合物的活性，尤其是其對NPR-A的親和性。在一個實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物被定義為這樣的天然hBNP氨基酸序列，其中具有一個或多個插入在所述hBNP序列之內(nèi)和/或加入到所述hBNP序列末端的Lys殘基，和/或缺失或被保守取代所替換的一個或多個天然Lys殘基。優(yōu)選地，這樣的取代或插入是所述促尿鈉排泄肽的一種或多種末端氨基酸序列。
在一些實施方案中，可以在所述N-末端或其附近對軛合位置進行插入、替換或添加，例如，在N-末端氨基酸序列內(nèi)進行插入或替換，優(yōu)選地在所述N-末端，或在所述N-末端開始的第1，2，3，4或5個氨基酸位置上，或者在形成構(gòu)成環(huán)的部分Cys橋的N-末端的Cys開始，沿N-末端方向的第1，2，3，4，5，6，7，8或9個氨基酸位置上。在優(yōu)選實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物被定義為這樣的天然hBNP序列，該天然hBNP序列具有一個或多個選自Lys3→Arg，Lys14→Arg，Arg30→Lys和Lys27→Arg的突變，一個或多個突變并不會消除所述促尿鈉排泄肽化合物的生物學活性。添加多于一個的修飾部分，例如寡聚物可以改善酶的穩(wěn)定性和/或增強吸收。
許多所述促尿鈉排泄肽類似物都包括天然促尿鈉排泄肽的環(huán)狀成分，例如hBNP的Cys10-Cys26，其中Cys10和Cys26通過二硫鍵結(jié)合由此形成了環(huán)。在一些情況下，所述環(huán)可包括與天然序列有區(qū)別的氨基酸取代、缺失和/或插入，只要這些取代、缺失和/或插入不會削減該天然序列的活性。這些改變的環(huán)序列的示例可參見Schoenfelda等人的″Mutations in B-type natriuretic peptide mediating receptor-A selectivity，″FEBS Letters 414(1997)263-267，在此將其全文引用作為參考，其描述了與促尿鈉排泄肽受體C(NPR-C)相比對促尿鈉排泄肽受體A(NPR-A)優(yōu)選結(jié)合的BNP變體(美國專利第6,525,022號和第6,028,055號)。又如，所述促尿鈉排泄環(huán)可包括這樣的天然環(huán)，該天然環(huán)具有不會削減該環(huán)促尿鈉排泄活性的一個或多個保守性取代，例如，在一些情況中，所述環(huán)可具有天然環(huán)(例如，hBNP的天然環(huán))的序列并具有1，2，3，4，5，6，7或8個保守性取代。在其他實施方案中，可以通過去除一組不影響生物學活性的氨基酸來縮短所述環(huán)。在一個實施方案中，所述肽類似物包括hBNP的Cys10-Cys26環(huán)，其中Lys14被Gly或Arg所取代。在其他實施方案中，所述環(huán)的SSSS(SEQ ID NO.3)成分被改變或缺失。
此外，所述促尿鈉排泄肽環(huán)或天然環(huán)的類似物可包括N-末端和/或C-末端，例如天然促尿鈉排泄肽的末端，例如，hBNP1-9和hBNP27-32。所述末端是不影響生物學活性的單個氨基酸或肽。在一些情況下，所述末端可以包括與天然序列有區(qū)別的氨基酸取代、缺失和/或插入，只要這些取代、缺失和/或插入不會削減該天然序列的活性即可。在一個實施方案中，所述末端都是基于天然序列，但卻縮短了一個或多個氨基酸。例如，所述N-末端，當其存在時，可選自hBNP片段8-9，7-9，6-9，5-9，4-9，3-9，2-9和1-9；且任意前述片段中的一個或多個Lys殘基都被Gly或Arg殘基所取代。類似的，所述C-末端，當其存在時，可選自hBNP片段27-28，27-29，27-30，27-31和27-32；且任意前述hBNP片段，其中的一個或多個Lys殘基已被Gly或Arg殘基所取代。優(yōu)選的環(huán)加末端促尿鈉排泄肽包括hBNP片段1-29；hBNP片段1-26；和任意的前述hBNP片段，其中的一個或多個Lys殘基被Gly或Arg殘基所取代。
除了前述的類似物，適于本發(fā)明使用的多種類似物已描述在現(xiàn)有技術(shù)中。例如，申請日為1992年5月19日的美國專利第5,114,923號，其在此被全文引用作為參考，描述了通式為R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.21)具有促尿鈉排泄活性的肽，其中，R1選自(H)；GIy-；Ser-Gly-；Gly-Ser-Gly-；Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.22)；Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.23)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.24)；Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.25)；Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO.26)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.27)；和R3-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.28)，其中R3是人類蛋白1-99位的102個氨基酸序列或其C-末端部分，而R2是(OH)，NH2，NHR′或其中的修飾部分′和修飾部分″獨立為低級烷基(1-4C)或R2是Lys；Lys-Val；Lys-Val-Leu；Lys-Val-Leu-Arg(SEQ ID NO.29)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg(SEQ ID NO.30)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQID NO.31)；或其酰胺(NH2，NHR′或NR′修飾部分″)。
申請日為1990年2月2日的美國專利第4,904,763號，其全文在此被引用作為參考，也描述了適用于本發(fā)明的促尿鈉排泄肽類似物，例如X-Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu GlyCys Lys VaI Leu Arg Arg His-OH(SEQ ID NO.32)，其中X是H，H-Gly-Ser-Gly-，或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO.33)。
申請日為1990年2月27日的美國專利第4,904,763號(其全文在此被引用作為參考)描述了適用于本發(fā)明的其他三促尿鈉排泄肽類似物，包括X-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Y(SEQ ID NO.34)(其中2個半胱氨酸通過二硫鍵成橋)，其中X為H或H-Asp-Ser-Gly，且Y為-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.35)，-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-OH(SEQ ID NO.36)，-Asn-Val-Leu-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.37)，-Asn-Val-Leu-Arg-OH(SEQID NO.38)，-Asn-Val-Leu-OH(SEQ ID NO.39)或Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.40)，或其鹽。其他適用于PCT公開WO8912069號的類似物組合于1989年12月14日公開。
在公開于2003年6月12日的美國專利公開第20030109430號中描述了適用于本發(fā)明的其他促尿鈉排泄肽類似物組合，在此將其全文引用作為參考。該公開內(nèi)容描述了具有促尿鈉排泄活性通式為R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg/Lys-Leu/Met-Asp-Arg-Ile-Lys-Met-Gly/Ser-Ser-Leu/Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.41)的肽，其中R1選自(H)；Gly-；Ser-Gly-；Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-；Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.42)；Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.43)；Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ IDNO.44)；Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.45)；Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.46)；Ser-Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.47)；或豬、犬或人BNP天然上游序列的10-109氨基酸序列，或其組合物；R2是(OH)，NH2，或NR′R″，其中R′和R″獨立為低級烷基(在此情況中，1-4C)或者是Asn/Lys；Asn/Lys-Val；Asn/Lys-Val-Leu；Asn/Lys-Val-Leu-Arg(SEQ ID NO.48)；Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys(SEQ ID NO.49)；Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys-Tyr/His(SEQ ID NO.50)；或其酰胺(NH2或NR′R″)，條件為如果通式是R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.51)，且R1為Asp-Ser-Gly-，那么R2就不能是Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO.52)。
其他的類似物組合公開于申請日為1997年11月26號，Scios的歐洲專利EP0542863B1中，其描述了含有從N末端到C末端的融合蛋白作為Staph V8剪接位點、不含有Glu殘基或Asp-Gly序列的約10-約50kDa的載體蛋白；在所述載體的C末端位置具有Glu殘基或Asp-Gly序列的Staph V8剪接；和；融合于所述剪接位點不含有StaphV8剪接位點的肽；其中所述融合蛋白的pI為約8.0或更高。該專利還描述了6-20個氨基酸的N末端引導序列的用途。
適用于本發(fā)明的其他促尿鈉排泄肽類似物描述在2002年7月4日公開的Daiichi的美國專利公開第20020086843號中(在此將其全文引用作為參考)，其中描述了具有生理學活性的多肽X-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH(SEQ ID NO.53)[其中2個半胱氨酸成橋]，其中X是H，H-Gly-Ser-Gly-，或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.54)。
在進行這樣的置換時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。氨基酸親水指數(shù)對多肽發(fā)揮交互生物學功能中的重要性在本領(lǐng)域中是公知的。普遍接受的是認為氨基酸的相對親水性對所得多肽的二級結(jié)構(gòu)具有影響，其反過來決定了所述蛋白與其他分子的相互作用。在疏水性和荷電特征的基礎(chǔ)上，每一種氨基酸都具有其親水指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知地，可以使用具有類似親水指數(shù)或記分的其他氨基酸對某些氨基酸進行替換，并且依然能夠得到具有類似生物學活性的肽，即依然獲得了生物功能等價的肽。在進行這些改變時，其親水指數(shù)在±2之間的氨基酸置換是優(yōu)選的，那些親水指數(shù)在±1之間的氨基酸置換是更優(yōu)選的，而那些親水指數(shù)在±0.5之間的氨基酸置換是最優(yōu)選的。
可以在親水性的基礎(chǔ)上采用類似的氨基酸進行有效置換在本領(lǐng)域中也是公知的。美國專利第4,554,101號，在此將其全文引用作為參考，認為蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性，是由其鄰近氨基酸的親水性所控制的，其與所述蛋白質(zhì)的生物學性質(zhì)有關(guān)。在美國專利第4,554,101號中，對以下氨基酸殘基進行了親水性值的指定精氨酸(+3.0)；賴氨酸(±3.0)；天冬氨酸(±3.0±1)；谷氨酸(±3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應該理解，可采用具有類似親水性值的其他氨基酸進行氨基酸置換，并且依然能夠獲得生物學等價的，尤其是免疫學等價的多肽。在這些改變中，其親水性值在±2之間的氨基酸置換是優(yōu)選的，那些親水性值在±1之間的氨基酸置換是特別優(yōu)選的，而那些親水性值在±0.5之間的氨基酸置換是更特別優(yōu)選的。
如上所述，可根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對類似情況，例如其疏水性、親水性、電荷、尺寸等進行氨基酸置換/插入。將各種前述特征納入考慮進行的示例性置換(即，在不顯著改變所述多肽生物學活性條件下對氨基酸進行交換)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，且包括，例如Arg和Lys；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應該理解，可采用多種已知的肽合成技術(shù)制備促尿鈉排泄肽(例如，BNP)類似物，這些技術(shù)包括，但不限于，經(jīng)典(溶液)方法，固相方法，半合成方法，和重組DNA方法。
8.1.3多-BNP肽所述促尿鈉排泄化合物還可以是在序列中具有兩個或更多促尿鈉排泄化合物單位的多肽，并可任選包括介于所述促尿鈉排泄化合物單位之間的間隔序列。所述化合物還可在促尿鈉排泄肽化合物的任意一端或兩端任選包含引導和/或延伸序列。例如，并非旨在對其進行限制，同時未對每種多肽的結(jié)構(gòu)和/或通式進行限制，其可具有以下結(jié)構(gòu)NP-[NP]n；NP-[間隔物-NP]n；引導物-NP-[NP]n；引導序列-NP-[間隔物-NP]n；引導物-[間隔物-NP]n；
引導物-[間隔物-NP]n-延長物；引導物-NP-[間隔物-NP]n-延長物；其中，n可以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10；NP是促尿鈉排泄肽或促尿鈉排泄肽類似物；間隔物可以是被酶或酶混合物剪切的氨基酸殘基或一系列氨基酸殘基，優(yōu)選為不存在于NP中的氨基酸殘基或氨基酸序列(例如，Glu-Asp-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.55)；Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)；Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)；Arg-Val；Asp-Lys；Lys-Ile；Arg-Thr；Arg-Ile)；引導物可以是，例如，單個氨基酸，氨基酸序列，肽(例如，引導肽或信號肽)，或蛋白；且引導物被選定阻止N末端進行軛合，從而協(xié)助所述多肽(例如，可使用酶混合物V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)剪切的(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-(SEQ ID NO.58)，(His)6-Ala-Asp-Arg-Thr-Arg-Arg-(SEQ ID NO.59)或(His)6-Ala-Asp-Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.60)，其中X可以是任一氨基酸或可由弗林蛋白酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Glu-Arg-Arg(SEQ ID NO.61)；可由尿激酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Val-(SEQ ID NO.62)；可由腸激酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Lys(SEQ ID NO.63)或(His)6-Ala-Asp-Lys-Ile(SEQ IDNO.64)；可由凝血因子Xa或凝血因子10a剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Thr(SEQ ID NO.65)或(His)6-Ala-Asp-Arg-Ile-)(SEQ ID NO.66)的純化，改進溶解度和/或協(xié)助細胞分泌(例如，Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67))，和/或純化(例如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68))；與此同時，優(yōu)選地采用不剪切NP的酶進行酶學剪切或化學剪切從所述所述多肽剪切引導物；所述引導物可以是來自于天然NP的引導肽。
延伸物可以是，例如，單個氨基酸，氨基酸序列，肽(例如，引導肽或信號肽)，或蛋白；且延伸物被選定阻止N末端進行軛合，從而協(xié)助所述多肽(例如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-)(SEQ ID NO.68)的純化，改進溶解度，和/或協(xié)助細胞分泌(例如，可使用酶混合物V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)和內(nèi)蛋白酶(Asp-N)剪切的Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，Arg-Thr-Arg-Arg-(SEQ ID NO.56)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)，其中X可以是任一氨基酸或可由弗林蛋白酶剪切的Arg-Glu-Arg-Arg(SEQ ID NO.69)；可由尿激酶和羧肽酶B混合物剪切的Arg-Val-；Asp-Lys或可由腸激酶剪切的Lys-Ile；可由凝血因子Xa或凝血因子10a剪切的Arg-Thr或Arg-Ile-)；與此同時，優(yōu)選地采用不剪切NP的酶進行酶學剪切或化學剪切從所述多肽優(yōu)選地剪切所述延伸物。
可優(yōu)選地選擇諸如那些包括在間隔物之內(nèi)的酶剪切位點，或?qū)⒁龑锖?或延伸物與NP分開的酶剪切位點，從而使得單種酶或酶混合物就能夠剪切全部的剪切位點。例如，所述剪切位點可以是為弗林蛋白酶所剪切的Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)。
在一個實施方案中，引導物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，間隔物是Glu-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.70)。這一實施方案可被V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)所剪切。所得產(chǎn)物是NP-Glu或NP-Glu軛合物。
在其他實施方案中，引導物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.71)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.72))(其中X可以是任意氨基酸)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg(SEQID NO.71)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.72))(其中X可以是任意氨基酸)，而間隔物是Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)(其中X可以是任意氨基酸)。這一實施方案可被弗林蛋白酶所剪切。所得產(chǎn)物是NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，引導物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val(SEQ IDNO.73)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val(SEQ ID NO.73)，而間隔物是Arg-Val。這一實施方案可被尿激酶/羧肽酶B混合物所剪切。所得產(chǎn)物是NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，引導物肽是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Asp-Lys(SEQID NO.74)或-Lys-Ile(SEQ ID NO.75))，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Asp-Lys或-Lys-Ile)，而間隔物是Asp-Lys或Lys-Ile。這一實施方案可被腸激酶所剪切。所得產(chǎn)物是NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，引導物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr(SEQID NO.76)或-Arg-Ile(SEQ ID NO.77))，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr(SEQ ID NO.76)或-Arg-Ile(SEQ ID NO.77))，而間隔物是Arg-Thr或Arg-Ile。這一實施方案可被凝血因子Xa或凝血因子10a/羧肽酶B混合物所剪切。所得產(chǎn)物是NP或NP軛合物。
在另一實施方案中，間隔物是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.78)，引導物是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.79)，延伸肽是(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.80)。在這個實施方案中，可以在受控條件下使用胰蛋白酶和羧肽酶B來釋放出NP或NP軛合物。
在另一實施方案中，間隔物是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.81)，引導物是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.82)，延伸物是(His)6-AAA-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.83)，其中AAA是長度為3-40氨基酸殘基的任意氨基酸序列，優(yōu)選為3-15個殘基。在這個實施方案中，可以在受控條件下使用胰蛋白酶和羧肽酶B來釋放出NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.84)，引導物是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.85)，而延伸物是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.86)。在這個實施方案中，可以使用凝血酶(thrombine)和羧肽酶B的酶混合物來釋放NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Ala-Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.87)，引導物是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.88)，而延伸物是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.89)。在這個實施方案中，可以使用凝血酶和羧肽酶A的酶混合物來釋放NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Met-Met，引導物是Met-Met，而延伸物是(His)6-AAA-Met-Met(SEQ ID NO.90)，其中AAA是長度為3-40氨基酸殘基的任意氨基酸序列。在這個實施方案中，可以使用CNBr來釋放NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Asp-Asp-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.91)，引導物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.92)，而延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.58)。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)和內(nèi)蛋白酶Asp-N的混合物來釋放NP或NP軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Glu-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.93)，引導物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸肽是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)來釋放NP或NP軛合物從而產(chǎn)生NP-Glu，其是一種新的NP類似物或NP-Glu的軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Glu-Glu，在C末端的引導物是Glu-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO.94)，而延伸物是Glu-Gly-Asp-Ala(His)6-Glu(SEQ ID NO.95)，其中所述C末端連接于融合部分，即適當?shù)娜诤系鞍?，其能夠，例如被腸激酶所剪切。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)來釋放NP或NP軛合物從而產(chǎn)生NP-Glu，其是一種新的NP類似物或NP Glu的軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Glu-Glu，引導物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，其中所述N-末端連接于融合部分，即適當?shù)娜诤系鞍?，其能夠，例如被腸激酶所剪切。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)來釋放NP或NP軛合物從而產(chǎn)生NP-Glu，其是一種新的NP類似物或NP Glu的軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Glu-Glu，引導物是Glu-Gly-Asp-Ala-Glu(SEQ ID NO.96)，而延伸物是Glu-Gly-Asp-Ala-Glu(SEQ ID NO.96)，所述C末端連接于融合部分，即適當?shù)娜诤系鞍?。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)來釋放NP或NP軛合物從而產(chǎn)生NP-Glu，其是一種新的NP類似物或NP Glu的軛合物。
在其他實施方案中，間隔物是Glu-Glu，引導物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸物是Glu-(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.97)，其中所述N末端連接于融合部分，即適當?shù)娜诤系鞍?。在這個實施方案中，可以使用V8蛋白酶(內(nèi)蛋白酶Glu-C)來釋放NP或NP軛合物從而產(chǎn)生NP-Glu，其是一種新的NP類似物或NP Glu的軛合物。
8.2修飾部分修飾部分是修飾促尿鈉排泄化合物的部分，例如BNP肽化合物，并提供了具有如本說明書所述的所希望性質(zhì)的化合物。例如，所述修飾部分可以在多種環(huán)境(例如GI腸道，和/或血流)中降低促尿鈉排泄化合物的分解速度，從而使得具有修飾形式的促尿鈉排泄化合物要比缺乏所述修飾部分的促尿鈉排泄化合物在這樣的環(huán)境中降解的要少一些。優(yōu)選的修飾部分是允許所述促尿鈉排泄化合物進行軛合從而保留了治療顯著百分比的母體促尿鈉排泄化合物的生物學活性的那些部分。
8.2.1影響穩(wěn)定性、溶解性和/或生物學活性的部分可有多種部分可連接于促尿鈉排泄化合物從而形成本說明書中的促尿鈉排泄化合物軛合物，其能夠修飾母體促尿鈉排泄化合物的穩(wěn)定性，溶解性和/或生物學活性。示例包括親水性聚合物或寡聚物，兩性聚合物或寡聚物，和親脂性聚合物或寡聚物。
所述聚合物(或短鏈寡聚物)可在其主鏈中包括較弱的或可降解的連接。例如，聚烷撐二醇可包括水解不穩(wěn)定的連接，例如交酯，乙交酯，碳酸鹽，酯，氨基甲酸鹽等，其都對水解敏感。這使得所述聚合物可被剪切成低分子量的片段。這些聚合物的例子在，例如，Hubbell等人的美國專利第6,153,211中有所描述。
以下將更詳細地描述代表性的親水性、兩性和親脂性聚合物和寡聚物。
8.2.2親水性部分正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所理解的那樣，所述親水性部分可以是多種親水性部分，包括，但不限于，聚烷撐二醇部分，其他親水性聚合物，糖部分，聚山梨醇酯部分，及其組合。
8.2.2.1聚烷撐二醇部分聚烷撐二醇是具有重復烷撐二醇單位的化合物。在一些實施方案中，所述單位是一致的(例如，聚乙二醇或聚丙二醇)。在其他實施方案中，所述烷撐單位是不同的(例如，聚乙二醇聚丙二醇共聚物，或PLURONICS_)。所述聚合物可以是無規(guī)共聚合物(例如，當環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚合時)或分支或接枝共聚合物。
聚乙二醇，或PEG，是優(yōu)選的聚烷撐二醇，且可適用于生物學應用，因為其具有良好的預期性質(zhì)并被FDA認為是公認安全的(GRAS)。PEG的通式為-(CH2CH2O)n-，其中n可從約2至約4000或更多。PEG通常是無色，無味，水溶性或水混溶的(取決于其分子量)，熱穩(wěn)定，化學惰性，水解穩(wěn)定且通常是無毒的。PEG同樣是生物適合的，并且在體內(nèi)通常不會產(chǎn)生免疫反應。本發(fā)明的優(yōu)選PEG部分包括多種PEG亞單位，這些PEG亞單位選自以下遞增優(yōu)選次序的范圍2-50，2-40，2-30，2-25，2-20，2-15，2-10。在某些實施方案中，所述修飾部分可包括2，3，4，5，6，7，8，9或10個亞單位。
PEG可以是單分散的(例如，如之前本申請人所述的申請日均為2001年6月4日的美國專利申請第09/873,731號和第09/873,797號，在此將其全文引用作為參考)或多分散的，正如在市場上普遍供應的。采用單分散的，意味著所述聚烷撐二醇可以具有單一的分子量，或相對較窄范圍的分子量。使用所述相對低分子量單分散聚合物的一個優(yōu)勢在于其較容易對軛合分子進行限定，從而可以協(xié)助重復性合成和FDA的審批。
所述PEG可以是在每個末端都具有羥基的線性聚合物(在與剩余的促尿鈉排泄化合物軛合之前)。所述PEG還可以是烷氧基PEG，例如甲氧基-PEG(或mPEG)，其中一個末端是相對惰性的烷氧基基團，而另一個末端則是羥基基團(該基團與所述促尿鈉排泄化合物結(jié)合)。所述PEG可以是分支的，其在一個實施方案中可以R(-PEG-OH)m表示，其中R代表中部(通常是多羥基)核心制劑，例如季戊四醇或甘油，且m代表分支的數(shù)量。每個分支都可以不同，并都可以用，例如，醚和/或酯終止。分支數(shù)m可以從3直至100或更高，而可有一個或多個所述末端羥基結(jié)合于剩余的所述促尿鈉排泄化合物，或者進行化學修飾。其他的分支PEG包括通式為(CH3O-PEG-)PR-Z的PEG，其中p等于2或3，R代表中心核，例如Lys或甘油，而Z則代表能夠進行迅速化學活化的基團，例如羧基。其他的分支形式，含側(cè)基的PEG，也具有反應基團，例如羧基，其是沿著PEG主鏈，而不是，或除此之外的，所述PEG鏈的末端。叉狀的PEG可由通式PEG(-LCHX2)n代表，其是另一種形式的分支PEG，其中L是連接基團而X是活化的末端基團。術(shù)語聚乙二醇或PEG代表或包括了所有形式的線性或分支的PEG，而聚烷撐二醇或PEG則包括了全部形式的線性或分支的PEG。
8.2.2.2糖部分正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的那樣，本說明書中的所述促尿鈉排泄化合物可包括糖部分。一般地，所述糖部分是至少一種蔗糖基團的碳水化合物產(chǎn)物。代表性的糖部分包括，但不限于，甘油部分，單糖，雙糖，三糖和寡糖，以及多糖，例如淀粉，糖原，纖維素和多糖膠。特異性的單糖包括C6和更多碳原子(優(yōu)選為C6-C8)的糖，例如葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，核糖和景天庚酮糖；二糖和三糖包括具有兩個或三個單糖單位的部分(優(yōu)選為C5-C8)，例如蔗糖，纖維二糖，麥芽糖，乳糖和棉子糖。含有糖部分的修飾部分的示例如下 使用糖部分進行軛合可參見美國專利第5,681,811號，第5,438,040號和第5,359,030號的描述，在此將其全文引用作為參考。
8.2.2.3聚山梨醇酯部分正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的那樣，本說明書中的所述聚山梨醇酯部分可以是多種聚山梨醇酯部分，包括，但不限于，山梨聚糖酯，和從聚氧乙烯延生得到的聚山梨醇酯。使用聚山梨醇酯部分進行軛合可參見美國專利第5,681,811號，第5,438,040號和第5,359,030號的描述，在此將其全文引用作為參考。
8.2.2.4生物適合的水溶性聚陽離子部分在一些實施方案中，可以采用生物適合的水溶性聚陽離子聚合物。生物適合的水溶性聚陽離子聚合物包括，例如，可作為側(cè)基進行連接的具有陽離子雜環(huán)的任意聚合物?！八苄浴笔侵刚麄€聚合物在20-37℃的溫度下可溶解于水性溶液，例如緩沖鹽水或加入了少量有機溶劑作為助溶劑的緩沖鹽水中。在一些實施方案中，所述聚合物本身并不能充分地溶解于水性溶液中，但卻可通過水溶性聚合物，例如PEG鏈的接枝而溶解在溶液中。示例包括在聚合物主鏈或聚合物側(cè)鏈上具有酰胺基團的聚酰胺，例如，聚-L-Lys和其他荷正電的天然或合成氨基酸或氨基酸混合物的聚氨基酸，包括聚(D-Lys)，聚(鳥氨酸)，聚(Arg)，和聚(組氨酸)，和非肽聚酰胺，例如聚(氨基苯乙烯)，聚(氨基丙烯酸酯)，聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)，聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)，聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)，聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)，聚(氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(乙撐亞胺)，季胺聚合物，例如聚(N，N，N-氯代三甲基氨基丙烯酸酯)，聚(氯代甲基丙烯酰氨基丙基三甲基銨)，和天然或合成的多糖，例如殼聚糖。
8.2.2.5其他親水性部分也可以使用其他的親水性聚合物。示例包括聚(氧乙基化的聚醇)，例如聚(氧乙基化的甘油)，聚(氧乙基化的山梨醇)，和聚(氧乙基化的葡萄糖)；聚(乙烯醇)(″PVA″)；右旋糖苷；基于碳水化合物的聚合物等。所述聚合物可以是基于以上聚合物單體、直鏈或分支的均聚物或無規(guī)或嵌段共聚物和三元共聚物。
適合的其他聚合物特定示例包括，但不限于，聚(唑啉)，雙官能聚(丙烯酰嗎啉)(″PAcM″)，和聚(乙烯吡咯烷酮)(″PVP″)。PVP和聚(唑啉)是本領(lǐng)域公知的聚合物，且其制備對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員而言也是顯而易見的。PacM及其合成和用途在美國專利第5,629,384號和第5,631,322號中有所描述，在此將其全文引用作為參考。
8.2.3生物附著性聚陰離子部分某些親水性聚合物可具有特別有用的生物附著性質(zhì)。這些聚合物的示例可在，例如，Mathiowitz等人的美國專利第6,197,346號中找到。那些含有羧基(例如，聚(丙烯酸))的聚合物表現(xiàn)出了生物附著性，并很容易與本說明書中的促尿鈉排泄化合物進行軛合。在降解過程中將羧基基團暴露出來的快速生物侵蝕聚合物，例如丙交酯-乙交酯共聚物，聚酐，和聚正酯，都可以是生物附著聚合物。這些聚合物都可被用于將促尿鈉排泄化合物遞送至胃腸道。當所述聚合物降解時，其可將羧酸基團暴露出來從而使得該羧酸基團能夠與胃腸道強烈結(jié)合，并且協(xié)助促尿鈉排泄化合物軛合物的遞送。
8.2.4親脂性部分在一些實施方案中，所述修飾部分包含親脂性部分。正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所理解的那樣，所述親脂性部分可以是多種親脂性部分，包括，但不限于，烷基部分，烯基部分，炔基部分，芳基部分，芳基烷基部分，烷基芳基部分，脂肪酸部分，金剛烷基，和膽甾烯基，以及親脂性聚合物和/或寡聚物。
所述烷基部分可以是飽和或不飽和的，直鏈，支鏈或環(huán)碳鏈。在一些實施方案中，所述烷基部分具有至少1，2，3或更多碳原子。在其他實施方案中，所述烷基部分是直鏈的，飽和或不飽和烷基部分，其具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個碳原子。示例包括飽和的，直鏈烷基部分，例如甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十八烷基，十九烷基和二十烷基；飽和的，支鏈烷基部分，例如異丙基，仲丁基，叔丁基，2-甲基丁基，叔戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2-乙基己基，2-丙基戊基；以及從上述飽和烷基部分衍生而來的不飽和烷基部分，包括，但不限于，乙烯基，烯丙基，1-丁烯基，2-丁烯基，乙炔基，1-丙炔基，和2-丙炔基。在其他實施方案中，所述烷基部分是低級烷基部分。在其他實施方案中，所述烷基部分是C1-C3的低級烷基部分。在一些實施方案中，所述修飾部分特異性地不由烷基部分組成，或特異性地不由低級烷基部分組成，或特異性地不由烷部分組成，或特異性地不由低級烷部分組成。
所述烷基基團既可以是未取代的，也可以被一個或多個取代基所取代，且這些取代基優(yōu)選地既不會干擾所述軛合物的合成方法，也不會去除所述軛合物的生物學活性?？墒褂帽Ｗo基團適當?shù)胤忾]潛在的干擾官能團從而使得所述官能團不具有干擾性。每個取代基都可任意地為其他非干擾性取代基所取代。術(shù)語“非干擾的”是指所述取代基不會不利地地影響如本發(fā)明所述方法所進行的任意反應。
所述脂肪酸部分可以是多種脂肪酸部分，包括天然或合成，飽和或不飽和，直鏈或支鏈的脂肪酸部分。在一些實施方案中，所述脂肪酸部分具有至少2，3，4或更多個碳原子。在其他實施方案中，所述脂肪酸部分具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24個碳原子。
當所述修飾部分是芳環(huán)時，可采用定位的親核官能團(例如OH，SH，或NHR′)對所述環(huán)進行官能化，從而使得其可以分子內(nèi)方式與氨基甲酸鹽部分反應并且協(xié)助其水解。在一些實施方案中，可采用能被水解或在體內(nèi)能降解的保護基團對所述親核基團進行保護，其結(jié)果是，當所述保護基團脫保護時，所述軛合物水解，并可協(xié)助母體促尿鈉排泄化合物的釋放。
8.2.5兩性分子的部分在一些實施方案中，所述修飾部分包括兩性分子的部分。許多聚合物和寡聚物都具有兩性分子的性質(zhì)。這些分子通常是含有親水部分和親脂部分的嵌段共聚物，支共聚物或接枝共聚物，可以是寡聚物和/或聚合物的形式，例如直鏈，支鏈或接枝聚合物或共聚物。
所述親水性聚合物或寡聚物可包括在此所述任意親脂性和親水性部分的組合。這些聚合物或寡聚物通常包括至少一個反應性官能團，例如，鹵素，羥基，酰胺，巰基，磺酸，羧酸，異氰酸鹽，環(huán)氧化物，酯等，其通常位于所述聚合物的末端。這些反應性官能團可用于連接親脂性直鏈或支鏈烷基，烯基，炔基，芳基烷基，或烷基芳基基團，或親脂性的聚合物或寡聚物，從而增加所述親水性聚合物或寡聚物的親脂性(并由此使其具有一般性的兩性分子性質(zhì))。
親脂性基團可以，例如，從單-或二羧酸衍生得到，或者，當適合時，從羧酸的反應等價物，例如酐或?；妊苌玫健＿m用于親脂基團的適當前體示例有乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，異丁酸，三甲基乙酸，己酸，辛酸，庚酸，癸酸，壬酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸，辣木子油酸，木蠟酸，ceratic酸，montanoic酸，異硬脂酸，異壬酸，2-乙基己酸，油酸，蓖麻油酸，亞油酸，亞麻酸，芥子酸，大豆脂肪酸，亞麻籽脂肪酸，脫水蓖麻脂肪酸，塔羅油脂肪酸，桐油脂肪酸，向日葵脂肪酸，紅花脂肪酸，丙烯酸，甲基丙烯酸，馬來酸酐，正鄰苯二甲酸酐，對苯二酸，異酞酸，己二酸，壬二酸，癸二酸，四氫鄰苯二甲酸酐，六氫鄰苯二甲酸酐，琥珀酸和聚烯烴羧酸。
末端親脂性基團不需要相同，即所得的共聚物可包括相同或不同的末端親脂性基團。所述親脂性基團可從不止一種上述的單-或雙官能烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，芳基烷基或烷基芳基基團衍生得到。
8.2.5.1 PEG/烷基修飾部分所述修飾部分可以是直鏈或支鏈的聚合部分，其含有一個或多個直鏈或支鏈的聚烷撐二醇部分和/或一個或多個直鏈或支鏈的取代或未取代的烷基部分。然而，在某些實施方案中，所述修飾部分特異性地不由烷基部分組成，而在其他實施方案中，所述修飾部分特異性地不由烷部分組成。在一些實施方案中，所述聚烷撐二醇部分包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25個PAG亞單位，優(yōu)選為PEG或PPG亞單位或其組合。所述烷基部分是飽和或不飽和的，并優(yōu)選具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個碳原子。所述烷基部分優(yōu)選為烷部分。
所述修飾部分可以，例如，具有如下通式 (通式I)其中每個C都是獨立選擇的并且是含有m個碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且每個PAG都是獨立選擇的并且是含有n個亞單位的聚烷撐二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每個X都是獨立選擇的并且是將PAG結(jié)合于C的連接部分，且優(yōu)選地為-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-或-C(O)NH-。在一些實施方案中，缺乏Cm-X部分，且所述PAGn部分用加帽基團，例如-OH部分或-OCH3部分所終止。例如，所述PAG可以是含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個PEG亞單位的甲氧基終止或羥基終止的PEG。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述修飾部分具有如下通式
(通式1A)其中，C，m，X和n如通式I所述。優(yōu)選n為2，3，4，5，6，7，8，9或10。X優(yōu)選為0，而m優(yōu)選為1。
在其他優(yōu)選實施方案中，所述修飾部分具有如下通式 (通式1B)其中n如通式I所述。優(yōu)選n為2，3，4，5，6，7，8，9或10。
在另一方面，所述修飾部分可具有如下通式 (通式II)其中PAG是具有n個亞單位的聚烷撐二醇部分，且n為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；X為-O-，或-NH-；每一個o都是獨立選擇的且為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15。
在另一方面，所述修飾部分可具有如下通式
(通式III)其中，每一個C都是獨立選擇的并且是含有m個碳原子的烷基部分，且m為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；而每個PAG都是獨立選擇的并且是含有n個亞單位的聚烷撐二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每一個X都是獨立選擇的，并且是將PAG和C軛合的連接部分，且優(yōu)選為-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-，或-C(O)NH-；o為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15。所述Cm-X部分可以不存在，且可以使用-OH部分或-OCH3部分來終止所述PAGn部分。例如，，所述PAG可以是含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個PEG亞單位的甲氧基終止或羥基終止的PEG。
在另一方面，所述修飾部分可具有通式 (通式IV)其中每個C都是獨立選擇的并且是含有m個碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且每個PAG都是獨立選擇的并且是含有n個亞單位的聚烷撐二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每個X都是獨立選擇的并且是將PAG結(jié)合于C的連接部分，且優(yōu)選地為-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-或-C(O)NH-。
應該理解通式I，IA，IB，II，III和IV的寡聚物都是本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容。所述寡聚物可作為，例如，伯醇或活化的寡聚物(參見8.7.1部分的實施例)，并可被用來與除了BNP之外的具有生物學活性化合物，例如胰島素，降鈣素，干擾素，生長激素等軛合。
在另一方面，所述修飾部分可具有如下通式 (通式V)其中每個R都是獨立選擇的并且為上述通式I，II，III或IV中的任意一種。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述修飾部分選自 或 (當這一最后的修飾部分作為單軛合物結(jié)合于人BNP的Lys3時，所得的部分稱為BN-054)。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述修飾部分具有如下通式 (通式IA)其中，C，m，X和n如通式I所述。
在其他優(yōu)選實施方案中，所述修飾部分具有如下通式 (通式1B)其中n如通式I所述。
所述軛合物的藥物特征，例如親水性/親脂性都可以通過調(diào)節(jié)PEG單體的數(shù)量，烷基鏈的類型和長度，PEG-肽鍵的特性，以及軛合位點的數(shù)量來進行改變?？蓪EG-肽鍵的確切特性進行改變，從而使其能夠在血漿中在生理pH條件下對水解穩(wěn)定和/或敏感。
8.2.6形成鹽的部分在一些實施方案中，所述修飾部分包括形成鹽的部分。正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的那樣，所述形成鹽的部分可以是多種適合形成鹽的部分，包括，但不限于，羧酸鹽和銨。在一些實施方案中，所述修飾部分包括形成鹽的部分，所述促尿鈉排泄化合物軛合物是以鹽形式提供的。在這些實施方案中，正如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的那樣，所述促尿鈉排泄化合物軛合物可以與適當?shù)乃幬锟山邮芷胶怆x子相連，其包括，但不限于，諸如氯，溴，碘，磷酸鹽，乙酸鹽，碳酸鹽，硫酸鹽，甲苯磺酸鹽和甲磺酸鹽的陰離子，或者諸如鈉，鉀，鈣，鋰和銨的陽離子。
所述修飾部分可以包括任意的親水性部分，親脂性部分，兩性部分，形成鹽的部分，及其組合。在優(yōu)選實施方案中，所述修飾部分選自(CH2CH2O)PCH3基團，其中p為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；(CH2)qCH3，其中q為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；CH2CH2(OCH2CH2)rOH，其中r為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；C(CH2OH)3；CH(CH2OH)2；C(CH3)3；CH(CH3)2；CH2CH2(OCH2CH2)sC(O)(CH2)tCH3，其中s為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20且t為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；以及(CH2CH2O)yC(O)(CH2)zCH3其中y為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20，且z為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
出于具體描述的目的的前述修飾部分的示例旨在對本發(fā)明進行說明，而非以任何形式對其進行限制。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應該理解，在本公開及其權(quán)利要求所主張的化學軛合機理范圍之內(nèi)，可以獲得具有特定官能性軛合的適當部分。因此，如本說明書所述，可以根據(jù)本發(fā)明的原理對其他部分進行選擇和使用。
8.3軛合策略與對應的未軛合促尿鈉排泄化合物軛合物相比，本發(fā)明的促尿鈉排泄化合物軛合物具有不同水平的生物學活性。在一些實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物保留了一些或全部未修飾形式的活性，但是由于諸如與修飾部分的軛合程度，在分子上對軛合位點的選擇以及對修飾部分的選擇等因素的存在，所述促尿鈉排泄化合物對體內(nèi)降解較不敏感，因此具有增加的血漿半衰期。例如，可對本發(fā)明的促尿鈉排泄化合物進行修飾，從而在適于促進與修飾部分相連的適當連接位點(即修飾部分軛合)上，在所述促尿鈉排泄化合物結(jié)構(gòu)的一個，兩個，三個，四個，五個或更多位點上具有修飾部分。例如，這些適合的軛合位置可以包括有氨基酸殘基，例如Lys氨基酸殘基。
在多個實施方案中，例如，所述具有生物學活性的制劑，可以通過結(jié)合于受體的活化位置來部分地發(fā)揮功能。通常，當對官能團，例如氨基酸殘基進行修飾時，該制劑不再結(jié)合于所述活化位置。在BNP的情況下，例如，所述肽對與NRP-A的結(jié)合具有特別的親和力。根據(jù)所述促尿鈉排泄分子被修飾成包含有修飾部分的位點，所述BNP對受體的親和力可以相同，或者有所降低。在一些實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物軛合物的活性比天然的未軛合促尿鈉排泄化合物軛合物的活性要低，但卻保留了比未軛合促尿鈉排泄化合物軛合物更好的特性，例如增強的對蛋白水解的抗性和增加的血漿半衰期或增強的穿過細胞膜的能力。可以想見，當需要進行所述促尿鈉排泄化合物的長期釋放時，所希望的是其活性有所降低。
在一些實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。在其他實施方案中，所述促尿鈉排泄化合物軛合物是多軛合物，例如二軛合物，三軛合物，四軛合物，五軛合物等。所述促尿鈉排泄化合物修飾部分的數(shù)量僅受限于該促尿鈉排泄化合物上的軛合位點數(shù)量。在其他實施方案中，本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物是單-，二-，三-，四-，和/或五修飾部分軛合物的混合物。例如，在一些實施方案中，具有生物學活性的促尿鈉排泄化合物是hBNP，在其32個天然氨基酸的序列中包括了4個優(yōu)選的軛合位點，包括N-末端，Lys3，Lys14和Lys27。本發(fā)明人的工作旨在N-末端，Lys3，Lys14和Lys27軛合的單軛合物，以及在對BNP和相關(guān)促尿鈉排泄肽以及類似物的較高優(yōu)選策略存在時，在Lys3/Lys14和Lys3/Lys27的二軛合物。
優(yōu)選地，所述修飾部分與所述促尿鈉排泄化合物共價結(jié)合。在所述修飾部分上不止一個部分可與所述促尿鈉排泄化合物共價結(jié)合。結(jié)合可以采用可水解鍵或非水解鍵或二者的混合物(即，在不同的軛合位點采用不同的鍵)。
在一些實施方案中，可采用可水解的鍵(例如，酯，碳酸酯或氨基甲酸酯鍵)將所述促尿鈉排泄化合物與所述修飾部分結(jié)合。采用可水解的結(jié)合可以使所述促尿鈉排泄化合物軛合物象原藥那樣發(fā)揮作用。當所述促尿鈉排泄化合物-修飾部分軛合物是非活化(即，所述軛合物缺乏通過促尿鈉排泄化合物的初級作用機理來影響機體的能力)時，原藥的方法是所希望的，例如，當所述修飾部分軛合位點位于促尿鈉排泄化合物的結(jié)合區(qū)域之內(nèi)時。使用可水解的結(jié)合還可以提供隨時間釋放或控制釋放的效果，在給定時間段內(nèi)給藥所述促尿鈉排泄化合物，當一種或多個修飾部分被從其分別的促尿鈉排泄化合物-修飾部分軛合物上剪切下來時，可以提供具有活性的原藥。
在其他實施方案中，可使用非水解鍵(例如，氨基甲酸酯，酰胺或醚鍵)將所述修飾部分結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物。當希望所述促尿鈉排泄化合物-修飾部分軛合物在血流中循環(huán)更長的時間，優(yōu)選為至少2小時時，可優(yōu)選地使用非水解性鍵。以非水解形式將所述修飾部分共價結(jié)合于促尿鈉排泄化合物的鍵通常選自共價鍵，醚部分，碳酸酯部分，氨基甲酸酯部分，酰胺部分和仲胺部分。
在其他實施方案中，可以采用部分原藥方法，其中部分所述修飾部分被水解。例如，美國專利第6,309,633號(在此將其全文引用作為參考)中描述了修飾部分，其含有親水性和親脂性成分，其中所述親脂性成分可在體內(nèi)水解從而產(chǎn)生微PAG化的軛合物。
可有超過一種修飾部分(即多種修飾部分)結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物。優(yōu)選地，所述多種修飾部分是相同的。然而，應該理解這些多種修飾部分可以是相互不同的，或者，這些修飾部分中有一些是相同的，而另一些是不同的。當多個修飾部分結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物時，優(yōu)選地，可采用可水解鍵將一種或多種修飾部分結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物，并采用非水解鍵將一種或多種修飾部分結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物。或者，全部結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物的多個修飾部分的鍵都是可水解的，但卻具有不同的水解度，因此，例如，在機體內(nèi)可以通過水解將一種或多個修飾部分從所述促尿鈉排泄化合物上快速地去除，而在機體內(nèi)可以通過水解將一或多個修飾部分從所述促尿鈉排泄化合物上緩慢地去除。
所述修飾部分可以在藥物的多個親核殘基，包括，但不限于，親核羥基官能團和/或氨基官能團上結(jié)合于所述促尿鈉排泄化合物。親核羥基官能團可以在，例如，絲氨酸和/或酪氨酸殘基上存在，而親核氨基官能團則可在，例如，組氨酸和/或賴氨酸殘基，和/或所述肽的一個或多個N末端上存在。當修飾部分結(jié)合于所述促尿鈉排泄肽的N-末端時，所述結(jié)合優(yōu)選形成了仲銨。
8.4軛合物的合成以下將在實施例中對示例性的合成酶進行描述。根據(jù)公知的原理可對反應條件(例如，選定的摩爾比，溶劑混合物和/或pH)進行控制。例如，可以通過將反應溶液的pH維持在低于Lys的pKa的條件下，抑制在Lys的氨基官能團上進行軛合。
可以采用例如，HPLC來對促尿鈉排泄化合物軛合物的混合物進行區(qū)別和分離，從而提供促尿鈉排泄化合物軛合物，例如，單-二-或三-軛合物。可以采用多種本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的技術(shù)，包括，但不限于，質(zhì)譜來確定和/或驗證特定分離軛合物的軛合程度(例如，所分離的分子是單-，二-或三軛合物)?？梢圆捎枚喾N本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的技術(shù)，包括，但不限于，序列分析，肽作圖，選擇性酶切，和/或內(nèi)肽酶剪切來確定和/或驗證特定軛合物的結(jié)構(gòu)(例如，hBNP單軛合物的Lys3，Lys14，Lys27或N末端)。
可以通過，例如，用適當?shù)姆忾]試劑，例如N-叔-丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴甲氧羰基)(N-FMOC)與所述促尿鈉排泄化合物反應來封閉所述促尿鈉排泄化合物上的一個或多個反應位點。當需要形成在所述多肽的一個或多個N末端上具有修飾部分的不飽和促尿鈉排泄化合物軛合物(即并非其中的所有親核殘基都被軛合的軛合物)時，這種方法是優(yōu)選的。在這樣的封閉之后，幾乎全部單分散的被封閉的促尿鈉排泄化合物的混合物可以與活化修飾部分的幾乎全部單分散混合物反應，從而提供促尿鈉排泄化合物軛合物的混合物，該混合物具有結(jié)合于一個或多個親核殘基的修飾部分，以及結(jié)合于其他親核殘基的封閉部分。在完成所述軛合反應之后，如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的那樣，所述促尿鈉排泄化合物-修飾部分軛合物可以被去封閉。如果需要的話，可將促尿鈉排泄化合物軛合物的混合物進行如上所述的分離，從而提供促尿鈉排泄化合物軛合物的混合物。或者，可以在去封閉之前對促尿鈉排泄化合物-修飾部分軛合物進行分離。
在本發(fā)明的一個令人驚奇的方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用PEG-烷基部分和與鄰近促尿鈉排泄化合物(即位于促尿鈉排泄化合物與PEG部分之間)的烷基部分進行hBNP軛合物的合成，產(chǎn)生了在特別理想的Lys3軛合位點上的優(yōu)先軛合。因此，在一方面，本發(fā)明提供了在Lys3優(yōu)先軛合hBNP的方法，該方法包括活化PEG-烷基寡聚物的烷基成分以及將活化的PEG-烷基寡聚物與hBNP結(jié)合。
8.5藥物組合物可以制備含有如本發(fā)明所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物組合物。這樣的組合物通常包括修飾的促尿鈉排泄化合物與可藥用載體的組合或是其二者的混合物。所述載體必須與藥物組合物中的任意其他成分相容，并且不能對患者有害。所述載體可以是固體或液體，或二者皆可，并優(yōu)選與作為單位劑量制劑的原藥配制，例如，含有從約0.01或0.5％-約95％或99％促尿鈉排泄化合物軛合物重量的藥片。可以采用任意公知的制藥技術(shù)，包括，但不限于，混合任選包括一種或多種助劑的成分來制備藥物組合物。
符合本發(fā)明實施方案的藥物組合物包括那些適合口服，直腸，經(jīng)鼻，表皮，吸入(例如，通過氣溶膠)，口腔(例如，舌下)，陰道，胃腸外(例如，皮下，肌肉，皮內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，胸膜內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦內(nèi)，動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))，表皮(即，皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮給藥的組合物，盡管在任何一種情況下，最適合的方案都依賴于擬進行治療的疾病本身和其嚴重程度，并依賴于所使用的特定原藥的性質(zhì)。
適合于口服給藥的藥物組合物可以分離單位形式存在，例如膠囊，扁囊劑(catchet)，錠劑或片劑，每種都含有預定量的所述原藥；作為粉末或顆粒；作為水溶性或非水溶性液體中的溶液或懸液；或作為水包油或油包水的乳劑?？赏ㄟ^包括將原藥和適合的載體(其可以含有一種或多種上述的助劑成分)組合在一起的步驟的任意適當?shù)闹扑幏椒ㄖ苽溥@樣的制劑。一般地，可通過將原藥與液體或精細分散的固體載體，或其二者均勻地和密切地混合，然后，如果有必要的話，將所得混合物成型來制備符合本發(fā)明實施方案的藥物組合物。例如，可將含有所述原藥，并任意具有一種或多種助劑成分的粉末或顆粒壓縮或成型來制備片劑?？赏ㄟ^在適當?shù)臋C器中，對無流動形式的混合物，例如任意混合有粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，和/或表面活性/分散劑的粉末或顆粒進行壓縮來制備壓縮片劑。可通過在適當?shù)臋C器中，將用惰性液體粘合劑濕潤的粉末狀化合物成型來制備成型的片劑。
適合于口腔(舌下)給藥的藥物組合物包括錠劑，其含有存在于調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖、阿拉伯樹膠或黃芪膠中的原藥；以及錠劑，其含有存在于惰性基質(zhì)，例如明膠、甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中的原藥。
適合于腸胃外給藥的符合本發(fā)明實施方案的藥物組合物包括所述原藥的滅菌水溶性和非水溶性注射溶液，這樣的制劑對預期患者的血液而言是優(yōu)選等滲的。這些制劑可以含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和溶質(zhì)，其能夠使所述組合物與預期患者的血液等滲。水溶性和非水溶性的無菌懸液可以包括助懸劑和增稠劑。所述組合物可以單位/劑量或多劑量包裝物的形式存在，例如，密封的安瓿或小管，并可儲存于冷凍干燥(凍干)的條件下，只需要加入滅菌的液體載體即可，例如，在使用之前加入鹽水或用于注射的水?？梢詮那笆龅母鞣N滅菌粉末，顆粒和片劑中制備臨時的注射溶液和懸液。例如，可以提供在封閉容器中以單位劑量形式存在的含有原藥的可注射的、穩(wěn)定的、滅菌組合物。原藥可以冷凍干產(chǎn)物的形式提供，其能夠與適當?shù)目伤幱幂d體重組從而形成適合注射入患者體內(nèi)的液體組合物。其單位劑量形式通常包括約10mg-約10g的原藥。當所述原藥是基本上水不溶性時，可施加足量的生理可接受的乳化劑，從而在水溶性載體中乳化所述原藥。其中一種有用的乳化劑是膽堿磷脂。
適于對皮膚進行局部施用的適合藥物組合物優(yōu)選采用膏劑、乳劑、洗液、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑的形式?？墒褂玫妮d體包括石油凝膠、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮增強劑，及其兩種或更多種的組合。
適用于透皮給藥的藥物組合物可以分離的糊劑存在，該存在方式可適于與接受者的皮膚保持緊密接觸更長的時間階段。還可以通過離子透入法(參見，例如，Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))并通常采用所述原藥的任選緩沖水性溶液的形式來遞送適合于透皮給藥的組合物。適合的制劑包括檸檬酸鹽或bis/tris緩沖液(pH6)或乙醇/水并含有0.1-0.2M的活性成分。
8.6給藥和治療的方法與未修飾(未軛合)的生物學活性的促尿鈉排泄化合物相比，本發(fā)明的促尿鈉排泄化合物軛合物和藥物制劑表現(xiàn)出一種或多種改進的特征，所述修飾部分的添加可以保護所述生物學活性促尿鈉排泄化合物免于在各種環(huán)境(例如胃腸道(GI道))中被降解，從而與缺乏修飾部分情況下被降解的程度相比，以未修飾形式存在的部分在這樣的環(huán)境中被降解的更少。尤其是，本發(fā)明的某些修飾形式可以最終在系統(tǒng)循環(huán)中提供藥物可接受量所述生物學活性促尿鈉排泄化合物的劑量進行口服給藥。換言之，可有足量的促尿鈉排泄化合物存在于GI道中并進入到血流中，從而使得所述生物學活性的促尿鈉排泄化合物能夠以足以引發(fā)cGMP產(chǎn)生的藥理學活性量系統(tǒng)性存在。優(yōu)選地，在口服給藥后，與口服給藥未軛合的促尿鈉排泄化合物向血流中的遞送相比，所述修飾部分的加入可以改善口服給藥未軛合促尿鈉排泄化合物向血流中的遞送。更優(yōu)選地，對口服給藥促尿鈉排泄化合物軛合物而言，活性化合物遞送進入血流的改善效果是口服給藥具有生物學活性的未軛合母體促尿鈉排泄化合物遞送進入血流效果的至少2倍。更優(yōu)選地，對口服給藥促尿鈉排泄化合物軛合物而言，活性化合物遞送進入血流的改善效果是口服給藥具有生物學活性的未修飾(未軛合)促尿鈉排泄化合物遞送進入血流效果的至少3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，300，400或500倍。因此，與具有生物學活性未修飾的促尿鈉排泄化合物給藥相比，本發(fā)明所述促尿鈉排泄化合物軛合物的給藥可提供該具有生物學活性促尿鈉排泄化合物的更高的生物利用率?？诜绞降慕o藥(而不是在醫(yī)院環(huán)境中成天的連續(xù)靜脈灌注)可以降低與其他CHF治療相關(guān)的醫(yī)院費用和/或?qū)BNP的治療用途擴展至包括了早期階段和慢性CHF，以及急性CHF。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了對治療敏感的疾病進行治療的方法，該方法通過使用促尿鈉排泄肽化合物向需要接受治療的患者給藥治療有效量的本發(fā)明促尿鈉排泄化合物軛合物。可通過適當?shù)?，包括，例如，非腸道的和腸道的途徑的多種給藥途徑給藥所述促尿鈉排泄化合物軛合物。優(yōu)選的途徑包括口服，皮下，舌下，口腔，鼻內(nèi)，靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)。
已經(jīng)有幾種方法被用于治療心力衰竭的本發(fā)明促尿鈉排泄化合物軛合物的應用中。例如，可以預期所述促尿鈉排泄化合物軛合物可作為單治療形式出現(xiàn)，優(yōu)選為單獨的口服劑量形式?；蛘?，所述促尿鈉排泄化合物軛合物可以與多種作為組合治療部分的常規(guī)治療制劑一起使用。目前所采用藥物的主要種類包括利尿劑-其能夠緩解液體積累以及所產(chǎn)生的與CHF相關(guān)的心臟收縮。
血管擴張劑-其能擴張動脈和靜脈，從而使血流增加。
收縮劑-其能夠增加心肌的收縮力。
洋地黃藥物-其能夠增加心臟的收縮力并降低心律。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑-其能夠在血管收縮藥血管緊張素II合成的最后階段抑制其產(chǎn)生。
血管緊張素受體阻抑劑(ARB′s)-允許血管緊張素的產(chǎn)生，但卻抑制其動脈活性。
鈣通道抑制劑-抑制鈣流，從而導致血管和平滑肌松弛。
硝酸鹽類-松弛平滑肌和擴大靜脈和動脈。
β-阻抑劑-阻抑兒茶酚胺的作用，從而導致心臟的壓力降低并且降低收縮的力量和頻率。
與治療CHF的其他方法相比，以及進行連續(xù)灌注的未修飾形式促尿鈉排泄肽的當前應用相比，首先可以考慮所述促尿鈉排泄化合物軛合物具有某些優(yōu)勢。本發(fā)明的口服促尿鈉排泄化合物軛合物具有促尿鈉排泄和利尿的性質(zhì)，可預期該性質(zhì)能夠通過消除鈉和過量水緩解充血。這樣的功能目前是通過利尿補充劑和鉀補充劑來實現(xiàn)的?？梢灶A期本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物軛合物具有血管和心肌弛緩藥的性質(zhì)，這一性質(zhì)目前是采用血管擴張劑，鈣通道阻抑劑和硝酸鹽類進行影響的。可以預期本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物軛合物能夠抑制目前使用ACE抑制劑和ARB’s影響的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)。此外，可以預期所述促尿鈉排泄化合物軛合物缺乏與影響肌肉收縮的和洋地黃藥物關(guān)聯(lián)的負效應和猝死風險。所述促尿鈉排泄化合物軛合物具有諸多，即使不是全部的，若干類型心血管藥物的益處，與此同時具有降低的常規(guī)治療劑量或沒有常規(guī)治療的負效應。
本發(fā)明的所述促尿鈉排泄化合物同樣具有比NATRECOR_(奈西立肽，由Scios Inc.，生產(chǎn)，桑尼維爾，加利福亞州)更具優(yōu)勢。有些益處是源于如本發(fā)明實施方案的兩性寡聚物所提供的改進的藥代動力學分布。例如，與未軛合肽相比，對蛋白酶(例如NEP)降解的抗性可以導致更長的循環(huán)半衰期。其明顯的優(yōu)勢是因為BNP或ANP與口服遞送的這些寡聚物具有軛合能力。例如，可通過連續(xù)灌注48小時以上劑量給藥NATRECOR_，且具有較高的每劑量成本還要加上醫(yī)院的開銷。如本發(fā)明實施方案所述的口服hBNP化合物軛合物可以普遍來說更低的成本來進行劑量給藥，并可以為門診病人獲得并可以自我給藥。不是局限于患有急性CHF病例住院病人的應用，如本發(fā)明實施方案所述的口服軛合物可應用于那些遭受慢性CHF逐漸發(fā)病的患者。給藥的方便，減少了對醫(yī)院資源的需求，和/或較低的費用支持了促尿鈉排泄化合物軛合物作為預防性治療自我給藥(例如，在家)給具有高風險心臟衰竭的患者的應用。因此，可期待如本發(fā)明實施方案所述的hBNP化合物軛合物口服制劑具有諸多，即使不是全部的Natrecor_的益處，這些益處包括改善的藥代動力學分布，更方便的給藥，降低的住院開銷，將適應癥擴展至包括慢性CHF，和/或在早期心血管疾病中的應用。
使用或傾向于使用母體促尿鈉排泄化合物的患者還可以選擇性(或額外)地使用本說明書所述的促尿鈉排泄化合物制劑。例如，患有使用腸胃外給藥促尿鈉排泄化合物，例如NATRECOR_進行常規(guī)治療病癥的患者，可以使用有效量的本說明書所述制劑的修飾形式來進行治療。有利的是，當這些制劑之前只能通過注射或靜脈內(nèi)給藥方式進行給藥時，所述促尿鈉排泄化合物可以通過吸入，或更優(yōu)選地口服給藥的方式進行給藥。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了向患者遞送生物學活性制劑的方法，其中該生物學活性的制劑是作為本發(fā)明的修飾促尿鈉排泄化合物成分進行口服給藥的，部分所述口服給藥的促尿鈉排泄化合物能夠在胃腸道中完好無損地存在并穿過腸壁進入到血流中，在離開胃腸道之后，一些或全部的促尿鈉排泄化合物會在體內(nèi)水解并產(chǎn)生藥物可接受量的生物學活性的制劑。所述水解，例如，可以在血流或肝臟中發(fā)生。在這一方法中，與對應的口服給藥的未軛合生物學活性制劑的口服生物利用率相比，促尿鈉排泄化合物的修飾形式能夠增強口服給藥生物學活性制劑的口服生物利用率。
所使用的任意促尿鈉排泄有效量都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其會隨制劑，患者的不同而不同，還會隨諸如患者年齡和疾病以及遞送方式等因素的不同而不同?？赏ㄟ^本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的常規(guī)藥理學方法確定這樣的劑量。作為一般性的建議，約0.1-約50mg/kg的劑量是具有治療效力的，而總重量是基于患者的體重進行計算的。在較高水平涉及到的毒性會將靜脈劑量限制到較低的水平，例如最高至約10mg/kg，而總重量是基于活性基質(zhì)的重量進行計算的。約10mg/kg-約50mg/kg的劑量可用于口服給藥。通常，0.5mg/kg-約5mg/kg的劑量可用于肌肉內(nèi)注射。給藥的頻率通常為每天一次，兩次或三次，或根據(jù)控制病情的需要。治療的持續(xù)取決于擬進行治療的疾病類型且有可能對患者而言是終身給藥。
適于接受本發(fā)明治療的患者包括，但不限于，禽類和哺乳動物患者，優(yōu)選為哺乳動物。如本發(fā)明所述的哺乳動物包括，但不限于，犬，貓，牛，山羊，馬，綿羊，豬，嚙齒類(例如，大鼠和小鼠)，兔類，靈長類，人等，并包括了子宮內(nèi)的哺乳動物。任意需要進行如本發(fā)明所述治療的哺乳動物患者都是適合的。人類患者是優(yōu)選的。兩種性別和處于任意發(fā)育階段(即，新生兒，嬰兒，青少年，青年，成人)的人類患者都可以進行如本發(fā)明所述的治療。
如本發(fā)明所述的說明性禽類包括雞，鴨，火雞，鵝，鵪鶉，雉，走鳥類動物(例如，鴕鳥)和家養(yǎng)鳥(例如，鸚鵡和金絲雀)，還包括在卵中的鳥。
8.7分析本發(fā)明的促尿鈉排泄肽類似物可以誘導與天然肽相關(guān)的心血管，腎，和/或內(nèi)分泌效果。基于細胞的分析可用來描述哪種軛合物是導致適當產(chǎn)生cGMP的人促尿鈉排泄肽受體A的最佳激動劑?？梢允褂蒙锘瘜W分析來顯示哪種軛合物提供了抗蛋白水解酶的合適的保護。體內(nèi)實驗可用來顯示哪種軛合物提供了所希望的生物利用率。主要的軛合物可以在已建立的狗模型中進行檢測。可將所希望的候選物在大鼠和狗中進行詳細的藥代動力學，藥效和毒性研究。如本發(fā)明實施方案所述的BNP軛合物可用于治療早期，慢性和急性充血性心力衰竭。
可在體外測定本發(fā)明的新肽和新軛合物對于人促尿鈉排泄肽受體A(NPR-A)的激動劑活性。BNP的血管舒張，促尿鈉排泄和利尿性質(zhì)歸因于第二信使，環(huán)GMP(cGMP)。cGMP的產(chǎn)生是由鳥苷酸環(huán)化酶完成的，其是一種能夠在BNP結(jié)合于NPR-A時被活化的酶。cGMP的產(chǎn)生可以在內(nèi)源性表達NPR-A的人動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物中進行測定。因此，可以通過這些細胞中cGMP的產(chǎn)生水平來測定本發(fā)明促尿鈉排泄化合物軛合物和促尿鈉排泄肽類似物的相對活性。
可測定出本發(fā)明軛合物對蛋白酶具有增加的抗性。一般地，口服遞送的藥物都容易受到諸如胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或糜蛋白酶等消化酶的攻擊。在肽藥物的情況下，這些酶是特別成問題的。然而，肽軛合物則對這些酶具有增強的抗性。消化酶混合物可用來測定本發(fā)明的hBNP軛合物和其他軛合物對消化道中蛋白酶的抗性有所升高。與對應的未軛合促尿鈉排泄化合物相比，促尿鈉排泄化合物軛合物優(yōu)選地對蛋白水解分解更不敏感，即與對應的未軛合化合物相比，所述軛合物分解地更慢。
可以測定所述軛合物的口服生物利用率。例如，可以在大鼠中測定所述軛合物的口服生物利用率。可通過口服強飼向胃腸道給藥軛合物，并使用可獲得的放射免疫分析方法分析血流中存在的hBNP軛合物。如本發(fā)明實施方案所述的軛合物可優(yōu)選地是口服和/或經(jīng)口的，即可通過口服或經(jīng)口方式遞送治療顯著量的所述軛合物。
所述軛合物可保留一些或全部天然促尿鈉排泄肽(例如，hBNP)的活性，還具有口服給藥的其他益處。這樣的化合物可降低與治療急性CHF相關(guān)的費用，和/或?qū)⑦@種治療的應用擴展至包括早期和慢性CHF。
在一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生數(shù)據(jù)的方法，該方法包括分析促尿鈉排泄化合物，分析本發(fā)明的促尿鈉排泄化合物軛合物，或一些這樣的促尿鈉排泄化合物軛合物，并從這樣的分析中得出數(shù)據(jù)結(jié)果。數(shù)據(jù)本身因此被理解為構(gòu)成了本發(fā)明的另一個實施方案，這些數(shù)據(jù)的用途也是。
8.8支鏈寡聚修飾部分本發(fā)明還提供了若干PEG直鏈或支鏈，胺，微PAG化和烷基-PEG修飾部分。
8.8.1支鏈寡聚修飾部分通式s
本發(fā)明提供了具有如下通式的化合物 (通式VI)其中R是-H，-C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′(其中X′是鹵化物(例如，Cl，Br)或?qū)?硝基苯酚)，或 且C，m，X，PAG和n如通式I所述。
本發(fā)明提供了具有如下通式的化合物 (通式VII)其中R是H(應該理解在PAG中軛合于R的原子是O，因此終止部分是OH)，C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′(where X′是鹵化物(例如，Cl，Br)或?qū)?硝基苯酚)，或 且PAG，n，X和o如通式II所述。
在又一個實施方案中，提供了具有如下通式的化合物
(通式VIII)其中R是-H，-OH，-C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′或OC(O)X′(其中X′是鹵化物(例如，Cl，Br)或?qū)ο趸椒?，或 或 且C，m，X，PAG，n和o如通式III所述。
在另一方面，所述修飾部分可具有通式 (通式IX)其中R是H，C(O)OH或活化部分，例如C(O)X″(其中X″是鹵化物(例如，Cl，Br)或?qū)?硝基苯酚)，或 且X’是 且C，m，PAG，n，和X如通式IV所述。
在另一方面，所述修飾部分可具有通式 (通式X)其中R3是-OH，-C(O)OH或活化部分，例如 且R1和R2都是獨立選擇的并且是上述通式I，II，III或IV中的任意一種。
8.8.2制備寡聚修飾部分的方法本發(fā)明還提供了若干制備在此所公開所述修飾部分的方法。提供了制備具有如下通式的化合物的方法 (通式XI)其中C，m，X，PAG，和n如通式I所述。這一方法可被描述成在堿和溶劑存在的條件下，將通式為Cm-X-PAGn-OH的化合物與通式為 的化合物(需要注意可以用其他的離去基團，例如其他的鹵化物來替代Cl)發(fā)生反應從而產(chǎn)生如下通式的化合物的步驟 將所述產(chǎn)物與通式為Cm-X-PAGn-OH的化合物在Lewis酸和溶劑存在的條件下反應產(chǎn)生了 其中C，m，X，PAG和n如通式I所定義。Cl可以被其他鹵素代替，例如Br。例如，所述堿可進一步被限定為NaH，而所述溶劑被進一步限定為四氫呋喃。用于本發(fā)明中的Lewis酸可進一步被限定為BF3OEt2。
本發(fā)明的其他方法同樣公開了制備通式為 (通式XII)的化合物的方法，其中C，m，X，PAG和n如通式I所定義。這一方法還可進一步限定為包括將如下產(chǎn)物與對硝基氯甲酸酯或二琥珀酰亞胺基碳酸酯發(fā)生反應的步驟 其中C，m，X，PAG和n如上所定義。
本發(fā)明的又一實施方案提供了制備通式為
化合物的方法，其中PAG，n，X和o如通式II定義。本方法還可進一步被描述為在溶劑中將通式為 的化合物(需要注意可以用其他的離去基團，例如其他的鹵化物來替代Cl)，其中o如通式I定義，與通式為HO-PAGn-X的化合物反應，其中X是-NH或-OH，從而生成通式為 化合物的步驟，其中PAG，n，X和o如通式II所述。
本發(fā)明還提供了制備通式為 (通式XIII)化合物的方法，其中PAG，n，X和o如通式II所述。本發(fā)明還可被描述為包含活化通式為
產(chǎn)物的步驟，其中PAG，n，X和o如通式II定義，使用了活化制劑，例如二琥珀酰亞胺基碳酸酯，對硝基氯甲酸酯，碳酰氯和N-羥基琥珀酰亞胺。
本發(fā)明的又一實施方案提供了制備通式為 (通式XIV)化合物的方法，其中C，m，X，PAG，n和o如通式III定義。本方法還可被描述為在存在堿和溶劑的條件下，將在此鑒定的如通式III的所述產(chǎn)物與通式為 的化合物發(fā)生反應的步驟，其中o如通式III定義。在本方法的優(yōu)選實施方案中，所述堿是K2CO3，而所述溶劑是水溶性和/或有機溶劑。
此外，本發(fā)明還提供了制備通式為
(通式XV)化合物的方法，其中C，m，PAG，n和o如通式III定義。本方法一般還包括將如上述制備通式XIV方法制備的化合物，與諸如N-羥基琥珀酰亞胺的活化劑發(fā)生反應。
9.實施例以下實施例都包括于本發(fā)明的說明性示例中?？墒褂帽蛔C實能夠以最佳實施方式實施本發(fā)明的技術(shù)和方法術(shù)語來描述以下實施例的某些方面。根據(jù)本公開和在本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普通技術(shù)水平，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應該理解以下實施例僅旨在進行說明，且可在不偏離本發(fā)明范圍的條件下對其進行多種變化，修飾和改變。
9.1 PEG-烷基修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-{2-[2-(2-十六烷氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯(II))的活化將六乙二醇單十六烷基醚，I(0.202g，0.4mmol)溶解于乙腈(5mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，0.157g，0.6mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.12g，1.2mmol)，10分鐘之后所述反應混合物變澄清。室溫下將反應攪拌過夜。在攪拌約16小時之后，將粗反應物蒸干，然后溶解于飽和NaHCO3(10mL)中，經(jīng)乙酸乙酯(2×20mL)洗滌，MgSO4干燥，然后蒸干。通過柱層析(二氧化硅，EtOAc/甲醇，10∶1)對粗反應混合物進行純化，從而產(chǎn)生0.258g(81％)的油狀題述化合物II。ESI MSm/e 648.84(M+H)+。
9.2支鏈PEG胺修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-己基-癸酰氨基)-乙氧基]-乙基酯(IV))的合成在30分鐘內(nèi)將亞硫酰氯(5.5gm，46.6mmol)逐滴加入2-己基-癸酸I(10gm，38.9mmol)的在100mL四氯化碳溶液中。在加入完成之后，將所述反應混合物回流3小時。反應完成后，通過蒸餾將四氯化碳去除并將所述反應混合物濃縮得到粗酰氯。通過分餾對粗酰氯進行純化得到澄清的液體II(10.1gm，91％)。ESI MSm/e 275.87(M+H)+。
在30分鐘內(nèi)，向冷卻的2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇(575g，5.47mmol)的10ml二氯甲烷溶液中，逐滴加入2-己基-癸酰氯II(750mg，2.74mmol)。加入完成之后，將反應混合物的溫度升高至25℃。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌約20小時后，用1N HCl酸化粗反應物并用10ml H2O稀釋。然后用二氯甲烷提取所述反應混合物。然后用1N HCl，水洗滌有機相，MgSO4干燥，過濾和濃縮。用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫2-5％甲醇的CHCl3溶液)純化粗產(chǎn)物，得到902mg(96％)的米色固體的單分散化合物III。ESI MSm/e 344.54(M+H)+。
將單分散的支鏈C16-PEG2 III(200mg，0.58mmol)溶解于乙腈(5mL)和二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，0.224g，0.87mmol)中。然后逐滴加入三乙胺(0.118g，1.17mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16小時，將粗反應物蒸干并溶解于飽和NaHCO3(10mL)中，乙酸乙酯洗滌(2×20mL)，MgSO4干燥并和蒸干。通過柱層析(二氧化硅，EtOAc/甲醇，10∶1)純化殘留物得到0.206g(74％)油狀的IV(0.206g，74％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 485.63(M+H)+。
9.3 PEG-烷基修飾部分(16-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十六烷酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的合成與活化向單分散16-溴-十六酸(15.3g，45mmol)的乙醇溶液(300mL)中加入H2SO4(1.5mL，31.25mmol)并將所述反應攪拌48小時。用水洗滌促反應混合物并用二氯甲烷(2×300mL)進行提取。用H2O(300mL)，飽和NaHCO3(2×300mL)，H2O(300mL)洗滌有機相，MgSO4干燥并蒸干，得到米色的固體II(16.03g，98％產(chǎn)率)。
向單分散七乙二醇單甲基醚(8.51g，25mmol)的THF(250mL)溶液中加入叔丁氧鉀(3.1g，27.5mmol，少量加入約30分鐘)。然后將反應混合物攪拌1小時，然后逐滴加入溶解于THF(90mL)中的II(10g，27.5mol)，將反應混合物攪拌過夜。將粗反應混合物過濾通過硅藻土(用CH2Cl2洗滌，～200mL)并蒸干得到油。用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫2-5％溶于CHCl3的甲醇)純化粗油得到澄清的黃色油IV，2.48g(16％)。
向單分散化合物IV(2.22g，3.56mmol)的油中加入IN NaOH(50.0mL)，25mL甲醇，25mL乙醇并將所述反應混合物攪拌24小時。將所得粗反應混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和并用CH2Cl2(3×75mL)洗滌。合并有機相，用飽和NaCl洗滌，MgSO4干燥并蒸干，得到白色固體的單分散化合物V。采用快速色譜法(二氧化硅，乙酸乙酯)純化所述粗固體得到V，858mg(40％)。
將單分散mPEG7-C16-酸V(324mg，544mmol)溶解于15ml無水二氯甲烷，然后加入溶解于無水二氯甲烷的N-羥基琥珀酰亞胺(94mg，816mmol)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl(EDCI HCl，156mg，816mmol)。將反應攪拌24小時，然后用1N HCl，水洗滌，MgSO4干燥，過濾并濃縮。采用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫2-5％甲醇的CHCl3溶液)純化粗產(chǎn)物，得到單分散活化的澄清的油，MPEG7-C16 VI(290mg，77％)。
9.4 PEG-烷基修飾部分(12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十二酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的活化將單分散mPEG7-C12-酸I(500mg，0.78mmol)溶解于20ml無水二氯甲烷，然后加入和溶解于無水二氯甲烷的N-羥基琥珀酰亞胺(160mg，1.39mmol)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl(EDCI HCl，233mg，1.390mmol)。將反應攪拌24小時，然后用1N HCl，水洗，MgSO4干燥，過濾并濃縮。使用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫2-5％甲醇的CHCl3溶液)純化粗產(chǎn)物得到單分散活化的澄清油，MPEG7-C16 VI(370mg，62％)。
9.5 PEG修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-甲氧基-乙基酯)的合成將單分散的支鏈MPEG1 I(200mg，2.63mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，1.00g，3.94mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.399g，3.94mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干并隨后溶解于飽和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到了固體III(0.346g，60％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 218.09(M+H)+。
9.6可水解微PAG化修飾部分(己酸2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙基酯)的合成將單分散的支鏈C6-PEG1 I(100mg，0.625mmol)溶解于乙腈(10mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，0.240g，0.936mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.095g，0.936mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到米色固體III(0.146g，78％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 302.29(M+H)+。
9.7直鏈mPEG修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基酯)的合成將單分散的支鏈MPEG2 I(470mg，3.91mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，1.50g，5.87mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.594g，5.87mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到了固體III(0..632g，62％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 262.23(M+H)+。
9.8可水解微PAG化修飾部分(十二酸2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙基酯)的合成將單分散的支鏈C12-PEG2 I(200mg，0.69mmol)溶解于乙腈(10mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，0.265g，1.035mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.104g，1.035mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到油III(0.247g，83％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 430.50(M+H)+。
9.9直鏈PEG修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯)的合成將單分散的支鏈MPEG3 I(200mg，1.21mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，0.468g，1.82mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.184g，1.82mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到固體III(0.206g，55％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 306.11(M+H)+。
9.10可水解微PAG化修飾部分(己酸2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基酯)的合成將單分散的支鏈C6-PEG3 I(200mg，0.80mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，II，0.309g，1.209mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.122g，1.209mmol)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌后約16h，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到油III(0.203g，64％產(chǎn)率)。ESI MSm/e 390.40(M+H)+。
9.11芐基消除可水解寡聚物(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸4-(4-硝基-苯氧羰基氧基甲基)-苯基酯)的合成將叔丁氧鉀(3.64g，32.4mmol)溶解于250mL THF。加入溶解于10mL THF的MPEG6醇(9.58g，32.3mmol)。將所述溶液攪拌2小時。將從商業(yè)可獲得乙基6-羥基-己酸酯制備的甲磺酸鹽(7.0g，29.4mmol)溶解于15mL THF并加入到PEG溶液。在室溫將反應攪拌過夜。用25mLMeOH對所述反應進行淬滅并通過短襯墊硅藻土進行過濾。將濾液真空濃縮并通過快速色譜法(EtOAc/2％MeOH)純化殘渣得到3.19g(25％)I。ESI MSm/e 461.07(M+Na)+。
為了水解所述乙基酯，用35mL 1N NaOH處理1.1g(2.51mmol)I。6小時后，原來渾濁的混合物變?yōu)槌吻澹S色的溶液。用NaCl飽和所述混合物并用濃縮的HCl酸化直至pH為2。用100mL CH2Cl2對溶液進行提取。用Na2SO4干燥有機相，過濾并真空濃縮得到0.80g(78％)羧酸II。ESI MSm/e 411.07(M+H)+，433.10(M+Na)+。
將羧酸III(0.80g，1.95mmol)溶解于16mL CH2Cl2并放置于N2中。像所述溶液中加入0.486g(2.5mmol)EDC和0.288g(2.5mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。5小時后，再加入0.2g EDC和0.12g NHS驅(qū)動反應完成。當TLC指示沒有未反應羧酸殘留時，用60mL CH2Cl2稀釋所述混合物并用冷的1N HCl(1×100mL)，冷水(2×100mL)和鹽水(3×100mL)進行洗滌。用Na2SO4干燥有機相，過濾并真空濃縮得到0.71g(71％)III。ESI MSm/e 508.17(M+H)+，530.07(M+Na)+。
將4-羥基苯甲醇(2.93g，3.6mmol)和2.98g(24.4mmol)DMAP溶解于120mL干燥的CH2Cl2中。將化合物III(1.2g，(2.37mmol)溶解于另外40mL CH2Cl2中并加入。在室溫將反應攪拌過夜。用1N HCl(2×200mL)和鹽水(2×200mL)洗滌所述混合物。用Na2SO4干燥有機相，過濾并蒸干。通過快速色譜法(二氧化硅，EtOAc/10％MeOH)純化所述殘渣得到0.701g(58％)寡聚物IV。ESI MS539.10 m/e(M+Na)+。
將寡聚物IV(0.562g，1.09mmol)溶解于15mL干燥的CH2Cl2中。向所述溶液中加入0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)對-硝基-苯基氯甲酸酯。在室溫下將所述反應攪拌過夜。然后再用15mL CH2Cl2稀釋所述混合物，用15mL 1N HCl洗滌然后再用15mL水洗滌。MgSO4干燥有機相，過濾并濃縮至干燥。使用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫3/1 EtOAc/己烷-EtOAc)純化粗產(chǎn)物得到504mg(74％)活化的寡聚物。ESI MSm/e 682.72(M+H)+，704.72(M+Na)+。
9.12芳基氨基甲酸酯可水解修飾部分(碳酸4-(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己氧基)-苯基酯4-硝基-苯基酯)的合成將MPEG6醇(10.0g，33.7mmol)溶解于40mL干燥的CH2Cl2并在冰浴中將所得溶液冷卻至0℃。加入TEA(5.64mL，40.5mmol)，然后逐滴加入3.13mL(40.5mmol)甲基磺酰氯。在0℃將所述反應攪拌30分鐘，然后從冰浴移開，使其升至室溫且攪拌過夜。用更多CH2Cl2稀釋所述反應混合物并用飽和NaHCO3和水洗滌。MgSO4干燥有機相，過濾并真空濃縮得到12.4g(98％)MPEG6甲磺酸鹽，I。
從6.311g二醇(53.41mmol)和180mL干燥的THF制備了1，6-己二醇溶液。將所述溶液冷卻至0℃并放置于N2氣氛下。向該溶液中加入叔丁氧鉀(5.996g，53.41mmol)并將所得混合物攪拌1小時。向該混合物中加入溶于30mL THF的I(10.0g，26.7mmol)。將全部溶液在0℃攪拌30分鐘，然后升至室溫并攪拌過夜。將反應混合物過濾通過硅藻土。用CH2Cl2洗滌所述硅藻土并將合并的濾液真空濃縮。將殘渣重新溶解于CH2Cl2并用水洗滌，用Na2SO4干燥有機相，過濾并蒸干。通過快速色譜法(二氧化硅，CHCl3/10％MeOH)純化。通過制備TLC(EtOAc/10％MeOH)進一步純化某些產(chǎn)物。合并的產(chǎn)量是3.923g(37％)II。
將II(3.923g，9.89mmol)溶解于16mL干燥的CH2Cl2并將所得溶液冷卻至0℃并置于N2氣氛下。加入三乙胺(1.65mL，11.9mmol)然后逐滴加入0.92mL(11.9mmol)甲基磺酰氯。在0℃將所述反應再攪拌30分鐘，然后升至室溫并攪拌過夜。用更多CH2Cl2稀釋所述反應混合物并用飽和NaHCO3和水進行洗滌。用Mg2SO4干燥有機相，過濾并真空濃縮得到4.25g(91％)甲磺酸鹽III。
在含有50mL干燥的THF的燒瓶中，溶解5.001g(24.97mmol)4-芐氧基苯酚。加入叔丁氧鉀(1.202g，9.989mmol)，將所得混合物在室溫和惰性氣體條件下攪拌1小時。加入溶于20mL THF中的3.950g(8.324mmol)III。18小時后，用10mL MeOH淬滅整個混合物，并通過短襯墊硅藻土進行過濾。將濾液真空濃縮并通過快速色譜法(二氧化硅，EtOAc/MeOH 20∶1)純化殘渣得到1.584g(33％)化合物IV。ESIMSm/e 579.16(M+H)+，601.14(M+Na)+。
將化合物IV(0.683g，1.18mmol)溶解于20mL MeOH中。向所述溶液中加入溶于MeOH的136mg 5％Pd/C漿液。將整個混合物放置于H2的條件下并攪拌至TLC確認全部起始材料都已被消耗。然后將混合物過濾通過硅藻土并將所述濾液蒸干得到412mg(71％)V。ESI MSm/e511.09(M+Na)+。
將寡聚物V(0.605g，1.09mmol)溶解于15mL干燥的CH2Cl2。向所述溶液中加入0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)對硝基-苯基氯甲酸酯。在室溫下將所述反應攪拌過夜。然后再用15mLCH2Cl2稀釋所述混合物并用15mL 1N HCl洗滌然后再用15mL水洗滌。MgSO4干燥所述有機相，過濾并濃縮至干燥。通過快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫3/1 EtOAc/己烷-EtOAc)純化粗產(chǎn)物得到491mg(75％)活化的寡聚物。ESI MSm/e 654.71(M+H)+，675.71(M+Na)+。
9.13活化寡聚部分的方法本實施例描述了如下的方法，通過該方法可以活化寡聚部分。
9.13.1方法I-使用DSC進行活化將烷基-PEG-OH，I(0.4mmol，1eq.)溶解于乙腈(5mL)并加入二琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC，0.6mmol，1.5eq.)。然后逐滴加入三乙胺(1.2mmol，1.5eq.)，10分鐘后反應混合物變?yōu)槌吻?。在室溫將反應攪拌過夜。攪拌約16h后，將粗反應物蒸干然后溶解于飽和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗滌(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到活化的寡聚物II。
9.13.2方法II使用NHS進行活化將MPEG-烷基酸I(0.544mmol，1.0eq.)溶解于15mL無水二氯甲烷，然后加入溶解于無水二氯甲烷的N-羥基琥珀酰亞胺(0.816mmol，1.5eq.)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl(EDCI·HCl，0.816mmol，1.5eq.)。將反應攪拌數(shù)小時，然后用1N HCl，水洗滌，MgSO4干燥，過濾并濃縮。采用快速色譜法(二氧化硅，梯度洗脫2-5％甲醇的CHCl3溶液)純化粗產(chǎn)物獲得活化的MPEG-烷基酸II。
9.14具有支鏈(6-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)修飾部分的合成
1.將四乙二醇單甲基醚(14.0g，67mmol)溶解于四氫呋喃(90mL)，逐部分地加入NaH(1.77g，74mmol)并將所述反應攪拌2小時。然后逐滴加入表氯醇(26.3mL，0.34mol)并在室溫將所述反應攪拌48小時。將粗反應混合物過濾通過硅藻土并用CH2Cl2洗滌(250mL)。用H2O(2×250mL)洗滌濾液，MgSO4干燥，蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油1(10.15g，57％產(chǎn)率)。
2.將四乙二醇單甲基醚(7.96g，0.038mol)和1(10.1，0.038mol)溶解于CH2Cl2(100mL)并加入BF3OEt2(0.48mL，0.0038mol)。在室溫將反應攪拌過夜。用CH2Cl2(200mL)稀釋粗產(chǎn)物，用飽和NaHCO3(300mL)，H2O(300mL)洗滌，MgSO4干燥，蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油2(4.5g，25％產(chǎn)率)。
3.將4-硝基氯甲酸酯(2.87g，14.3mmol)和2(4.5g，9.5mmol)溶解于CH2Cl2(45mL)中。攪拌10分鐘后，加入TEA(2.1mL，15mmol)并在室溫將反應攪拌過夜。用CH2Cl2(130mL)稀釋粗反應物，用1MHCl(175mL)，H2O(175mL)洗滌，MgSO4干燥，蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到黃色的油3(2.38g，40％產(chǎn)率)。
4.將6-氨基己酸(0.126g，0.96mmol)和K2CO3(0.221g，1.6mmol)溶解于H2O(DI，5mL)。然后將3(0.5g，0.8mmol)溶解于THF(0.7mL)并逐滴加入。在室溫將反應攪拌過夜。用H2O(20mL)稀釋粗反應物，用HCl酸化至pH～1，用CH2Cl2洗滌(2×25mL)，MgSO4干燥有機相，并蒸干。柱層析(二氧化硅，CHCl3/MeOH，15∶1)得到澄清的油4(0.428g，85％產(chǎn)率)。
5.使用方法II進行活化4(0.40g，0.64mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.088g，0.77mmol)，EDCI(0.160g，0.83mmol)和CH2Cl2(5mL)。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油5(0.320g，69％產(chǎn)率)。
9.15直鏈PEG-烷基修飾部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-{2-[2-(2-{2-[2～(2-己氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基酯)的合成 1.將三乙二醇(30g，0.2mol)溶解于NaOH(8g溶于8mL H2O)溶液并攪拌10分鐘。加入芐基氯(7mL，0.062mol)并將所述反應混合物加熱至100℃并攪拌過夜。用飽和NaCl(500mL)稀釋粗反應物用CH2Cl2洗滌(2×400mL)，MgSO4干燥有機相，并蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯與乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到黃色油1(9.87g，67％產(chǎn)率)。
2.向1(9.87g，0.041mol)的CH2Cl2(50mL)溶液中加入TEA(7.1mL，0.054mol)。然后將所述溶液在冰浴中冷卻至0℃，然后逐滴加入溶解于CH2Cl2(10mL)中的甲磺酰氯(3.9mL，0.049mol)。將所述反應在0℃攪拌0.5小時，然后室溫攪拌4小時。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌(100mL)，用飽和NaHCO3(150mL)，H2O(150mL)洗滌濾液，MgSO4干燥，蒸干得到黃色油2(11.06g，85％產(chǎn)率)。
3.將四乙二醇(7.32g，0.038mol)溶解于四氫呋喃(140mL)，并在0.5小時內(nèi)逐部分加入NaH，再將所述反應攪拌1小時。然后將2(6.0g，0.019mol)溶解于CH2Cl2(20mL)并逐滴加入且在室溫將反應物攪拌過夜。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌并蒸干。將所得油溶解于CH2Cl2(150mL)，用H2O(150mL)，飽和NaHCO3(150mL)，H2O(150mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到黃色的油3(3.83g，49％產(chǎn)率)。

4.以制備2相同的方式己醇(6.2mL，0.05mol)，甲磺酰氯(4.6mL，0.058mol)，TEA(8.6mL，0.065mol)和CH2Cl2(60mL)得到了黃色的油4(7.8g，86％產(chǎn)率)。
5.向3(5.45g，0.13mol)的四氫呋喃(160mL)溶液中加入叔丁氧鉀(1.60g，0.0144mol)并將所述反應攪拌1.5小時。然后逐滴加入溶解于四氫呋喃(20mL)的4(2.59g，0.0144mol)，并將反應攪拌過夜。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌(100mL)，并蒸干。將所得油溶解于乙酸乙酯(150mL)，H2O(2×150mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黃色油5(2.40g，36％產(chǎn)率)。
6.向5(2.4g，4.8mmol)的乙酸乙酯(16mL)溶液中加入以10wt％(1.0g)存在于活性炭上的鈀，并用隔膜將反應容器封閉。然后通過針向所述隔膜中插入含有H2的氣球，并將反應物在室溫攪拌過夜。將粗反應混合物過濾通過硅藻土，乙酸乙酯洗滌并蒸干得到澄清的油6(1.61g，82％產(chǎn)率)。
7.將光氣(phoshene)溶液(15mL，20％光氣溶于甲苯)冷卻至-10℃并逐滴加入溶解于甲苯(5mL)的6(1.60g，3.9mmol)。將反應在-10℃攪拌0.5小時，然后在室溫攪拌4小時。光氣和甲苯隨后被餾出，將所得油真空干燥得到黃色油7。
8.使用方法II進行活化7(1.65g，0.79mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.437g，3.8mmol)，TEA(2.7mL，3.8mmol)和CH2Cl2(10mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油8(1.06g，57％產(chǎn)率)。
9.16支鏈烷基-PEG-烷基(6-[2-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的合成 1.以實施例9.15相同的方式進行制備己醇(18mL，0.15mol)，甲磺酰氯(12.3mL，0.16mol)，TEA(25mL，0.18mol)和CH2Cl2(180mL)得到了黃色的油1(23.1g，85％產(chǎn)率)。
2.將四乙二醇(50.5g，0.26mol)溶解于四氫呋喃(350mL)，在0.5小時內(nèi)逐部分加入叔丁氧鉀(29.2g，0.26mol)。將反應再攪拌1小時，然后加入溶解于THF(50mL)的1(23.0g，0.13mol)。在室溫將反應攪拌過夜。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌并蒸干。將所得油溶解于CH2Cl2(300mL)，H2O(2×300mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(18.51g，51％產(chǎn)率)。
3.向2(10.0g，36mmol)的四氫呋喃(60mL)溶液中逐部分加入NaH(0.95g，40mmol)，并將反應攪拌0.5小時。逐滴加入表氯醇(14.1mL，0.34mol)，將反應在室溫攪拌48小時。將粗反應混合物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌并蒸干。將所得油溶解于CH2Cl2(200mL)，用飽和NaCl(200mL)，飽和NaHCO3(200mL)，H2O(200mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷，10∶1)得到澄清的油3(5.46g，45％產(chǎn)率)。
4.向2(4.54g，16mmol)和3(5.46，16mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中加入BF3OEt2(0.48mL，0.0038mol)。在室溫將反應攪拌過夜。用CH2Cl2(50mL)稀釋粗反應物，飽和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯與乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油4(2.40g，24％產(chǎn)率)。

5.將4-硝基氯甲酸酯(1.18g，5.8mmol)和4(2.4g，3.9mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)。攪拌10分鐘后，加入TEA(0.89mL，6.4mmol)，并將反應在室溫攪拌過夜。用CH2Cl2(75mL)稀釋粗反應物，用1MHCl(100mL)，H2O(100mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黃色的油5(1.04g，34％產(chǎn)率)。
6.將6-氨基己酸(0.157g，1.2mmol)和K2CO3(0.276g，2.0mmol)溶解于H2O(DI，8mL)。然后將5(0.80g，1.0mmol)溶解于THF(1.0mL)并逐滴加入。當3加入和乙醇(2mL)加入時產(chǎn)生油滴并在室溫將反應攪拌過夜。用H2O(30mL)稀釋粗反應產(chǎn)物，用HCl酸化至pH～1，用CH2Cl2洗滌(2×35mL)，MgSO4干燥有機相，并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油6(0.720g，46％yield)。
7.使用方法II進行活化6(0.356g，0.46mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.063g，0.55mmol)，EDCI(0.115g，0.6mmol)和CH2Cl2(3mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油7(0.180g，45％產(chǎn)率)。
9.17己酸2-[2-(2-{2-[2-[6-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-己基氨甲酰氧基]-3-(2-{2-[2-(2-己酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯
1.以實施例9.15相同的方式制備四乙二醇(58.27g，0.3mol)，NaOH溶液(12g溶于12mL H2O中)，芐基氯(10.6mL，0.092mol)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黃色的油1(16.8g，64％產(chǎn)率)。
2.以實施例9.14相同的方式制備1(9.6g，34mmol)，NaH(0.898g，37mmol)，四氫呋喃(50mL)，表氯醇(13.2mL，0.17mol)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(6.78g，58％產(chǎn)率)。
3.以實施例9.14相同的方式制備四乙二醇(4.85g，20mmol)，2(6.78g，25mmol)，BF3OEt(0.25mL，2.0mmol)，CH2Cl2(75mL)。柱層析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，20∶1)得到澄清的油3(2.85g，27％產(chǎn)率)。
4.向3(2.80g，5.2mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液中加入TEA(0.8mL，5.7mmol)并將溶液冷卻至0℃。然后逐滴加入己酰氯(0.73mL，5.2mmol)。將反應在0℃攪拌0.5小時，然后室溫攪拌過夜。用CH2Cl2(80mL)稀釋粗反應物，用H2O(100mL)，飽和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到黃色油4(1.95g，59％產(chǎn)率)。
5.向4(1.94g，3.1mmol)的乙酸乙酯(20mL)中加入鈀(1.60g，5wt％在活性炭上)。將所述反應封閉并在H2中攪拌過夜。將粗反應混合物過濾通過硅藻土，乙酸乙酯洗滌，蒸干得到澄清的油6(1.09g，65％產(chǎn)率)。

6.向5(1.09g，2.0mmol)的CH2Cl2(14mL)溶液中加入TEA(0.31mL，2.2mmol)，并將溶液冷卻至0℃。然后逐滴加入己酰氯(0.28mL，2.0mmol)。將反應在0℃攪拌0.5小時，然后室溫攪拌過夜。用CH2Cl2(86mL)稀釋粗反應物，用H2O(100mL)，飽和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到微黃色油6(0.698g，55％產(chǎn)率)。
7.以實施例9.14相同的方式制備4-硝基氯甲酸酯(0.332g，1.65mmol)，6(0.698g，1.1mmol)，TEA(0.28mL，2.0mmol)，CH2Cl2(7mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黃色油7(0.688g，78％產(chǎn)率)。
8.以實施例9.14相同的方式制備6-氨基-1-己醇(0.142g，1.2mmol)，7(0.488g，0.6mmol)，TEA(0.12mL，0.9mmol)，CH2Cl2(5mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油8(0.30g，65％產(chǎn)率)。
9.使用方法I進行活化N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(0.118g，0.46mmol)，8(0.30g，0.38mmol)，TEA(80μL，0.57mmol)，乙腈(4mL)。洗滌得到澄清的油9(0.344g，90％產(chǎn)率)。
9.18 6-{2-(2-{2-[2-(2-己氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-[6-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己氧基甲基]-乙氧基羰基氨基}-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯 1.以實施例9.15相同的方式制備四乙二醇單甲基醚(25g，0.12mol)，TEA(19.5mL，0.14mol)，甲磺酰氯(10.0mL，0.13mol)，CH2Cl2(100mL)得到黃色油1(31.35g，91％產(chǎn)率)。
2.將1，6-己二醇(7.93g，0.084mol)溶解于四氫呋喃(200mL)。在0.5小時內(nèi)逐部分地加入叔丁氧鉀(10.37g，0.092mol)，再攪拌1小時。然后將1(12.0g，0.042mol)溶解于四氫呋喃(40mL)并通過滴加漏斗逐滴加入并在室溫下將反應攪拌過夜。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌并蒸干。將所得油溶解于CH2Cl2(300mL)，H2O(2×300mL)洗滌，MgSO4干燥，蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(5.09g，39％產(chǎn)率)。
3.向2(5.0g，16mmol)的四氫呋喃(35mL)溶液中逐部分地加入NaH(0.422g，17.6mmol)并將反應攪拌2小時。然后逐滴加入表氯醇(6.3mL，8.0mmol)，并將反應在室溫攪拌48小時。將粗反應混合物過濾通過硅藻土并用CH2Cl2洗滌。將所得油溶解于CH2Cl2(125mL)，用H2O(125mL)，飽和NaHCO3(125mL)，H2O(125mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油3(2.00g，34％產(chǎn)率)。
4.以實施例9.14相同的方式制備2(1.34g，4.8mmol)，3(1.75g，4.8mmol)，BF3OEt2(0.06mL，0.48mmol)，CH2Cl2(30mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油4(1.05g，34％產(chǎn)率)。
5.以實施例9.14相同的方式制備4-硝基氯甲酸酯(0.464g，2.3mmol)，4(1.0g，9.5mmol)，TEA(2.1mL，1.55mmol)，CH2Cl2(10mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯與乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到黃色油(0.663g，53％產(chǎn)率)。
6.以實施例9.14相同的方式制備6-氨基己酸(0.054g，0.41mmol)，5(0.277g，0.34mmol)，K2CO3(0.094g，0.068mmol)，H2O(DI，5mL)得到澄清的油6(0.268g，96％產(chǎn)率)。
7.使用方法II進行活化6(0.268g，0.34mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.047g，0.41mmol)，EDCI(0.084g，0.44mmol)和CH2Cl2(4mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油7(0.178g，58％產(chǎn)率)。
9.19多支鏈寡聚物的合成
1.如實施例9.14進行制備。
2.將二鹽酸L-賴氨酸乙基酯(0.32g，1.3mmol)和1(1.71g，2.7mmol)溶解于DMF(30mL)中并加入TEA(0.90mL，6.5mmol)。在室溫將反應混合物攪拌過夜。將粗反應物蒸干，溶解于CH2Cl2(30mL)，用1MHCl(30mL)，H2O(30mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，25∶1)得到澄清的油2(1.O1g，66％產(chǎn)率)。
3.將溶解于1M NaOH(10mL)的2(1.0g，0.85mmol)在室溫攪拌6小時。用飽和NaCl(50mL)稀釋粗反應物，酸化至pH～2，用CH2Cl2洗滌(2×50mL)，MgSO4干燥，蒸干得到澄清的油3(0.724g，74％產(chǎn)率)。
4.使用方法II進行活化3(0.070g，0.61mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.091g，0.79mmol)，EDCI(0.182g，0.95mmol)和CH2Cl2(7mL)。柱層析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，20∶1)得到澄清的油4(0.480g，63％產(chǎn)率)。
9.20糖-PEG-烷基修飾部分2，2-二甲基-丙酸4，5-二-(2，2-二甲基-丙酰氧基)-6-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-3-{6-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-己酰氨基}-四氫-吡喃-2-基酯)的制備 1.以實施例9.15相同的方式制備乙基6-羥基己酸酯(8.0g，0.05mol)，甲磺酰氯(4.6mL，0.06mol)，TEA(10mL，0.072mol)和CH2Cl2(32mL)得到了黃色油1(11.15g，93％產(chǎn)率)。
2.將四乙二醇(19.1g，0.098mol)溶解于四氫呋喃(190mL)并在0.5小時內(nèi)逐部分加入NaH(1.69g，0.071mol)。將反應再攪拌1小時，然后加入溶解于四氫呋喃(10mL)的1(23.0g，0.13mol)。在室溫將反應攪拌過夜。將粗反應物過濾通過硅藻土，用CH2Cl2洗滌并蒸干。將所得油溶解于CH2Cl2(200mL)，用飽和NaCl(200mL)，H2O(200mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，25∶1)得到澄清的油2(1.60g，10％產(chǎn)率)。
3.將溶解于1M NaOH(6mL)的2(1.60g，4.7mmol)溶液在室溫攪拌2小時。用飽和NaCl(24mL)稀釋粗反應物，酸化至pH～2，用CH2Cl2洗滌(2×30mL)，MgSO4干燥，蒸干得到澄清的油3(1.08g，73％產(chǎn)率)。
4.將2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-半乳糖苷吡喃糖苷胺(galactospyranosylamine)(0.836g，1.6mmol)和3(0.50g，1.6mmol)溶解于CH2Cl2(8mL)。然后加入EDCI(0.368g，1.92mmol)并在室溫將反應攪拌過夜。攪拌過夜后，反應并不完全，因此加入EDCI(0.368g，1.92mmol)并在室溫將反應攪拌過夜。用CH2Cl2(22mL)稀釋粗反應物，用1M HCl(30mL)，H2O(30mL)，飽和NaCl(30mL)洗滌，MgSO4干燥并蒸干。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH)得到粘油4(0.397g，31％產(chǎn)率)。
5.使用方法I進行活化4(0.397g，0.50mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(0.063g，0.60mmol)，TEA(0.10mL，0.75mmol)和乙腈(4mL)。柱層析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到粘油5(0.256g，56％產(chǎn)率)。
9.21可水解，非水解和PEG化的促尿鈉排泄軛合物本實施例旨在證明本發(fā)明提供可采用包括幾乎各種寡聚部分，尤其是非水解性寡聚物、微PAG化寡聚物和可水解寡聚物的部分進行修飾的促尿鈉排泄化合物軛合物的應用。
可以在所述肽的不同位置利用不同的寡聚物合成本發(fā)明的hBNP。具有多種性狀(對受體的激動劑活性，對蛋白水解的抗性，和口服生物利用率)組合的所述軛合物可成為更深入體內(nèi)檢測中的首選候選物。
從簽訂了肽合成合同的公司獲得了天然hBNP。用于軛合的兩性寡聚物來自于某一批寡聚物和來自于特別針對與hBNP的軛合而設(shè)計和合成的寡聚物。所述軛合遵循于如圖2所示的三層次軛合策略。首選對1類化合物進行檢測。因為與1類寡聚物的廣泛軛合減弱了活性，因此測定具有2類寡聚物的三-和四-軛合物。因為2類寡聚物并非同樣高效，因此可對兩種原藥軛合物(3類寡聚物)進行評定。
第一類軛合物是非水解的。對于這類軛合物，所劑量給藥的藥物物質(zhì)(即，所述軛合物)是作為受體發(fā)揮作用的物質(zhì)。換言之，所述寡聚物及其與所述肽的連接從給藥時間直到清除時間都保持完整。這些寡聚物一般都由烷基部分和PEG部分構(gòu)成。為了使得所述寡聚物將所述軛合物變?yōu)榭煽诜蛯Φ鞍姿饩哂锌剐缘男Ч畲蠡梢詫λ鐾榛蚉EG部分部分的長度進行改變并對其順序進行調(diào)換。也可對軛合程度進行處理。屬于該第一類的有一些能夠提供軛合物的寡聚物，以及在Ekwuribe的美國專利第5,359,030號；Ekwuribe的美國專利第5,438,040號；Ekwuribe的美國專利第5,681,811號；Ekwuribe的美國專利第6,191,105號；申請日為1999年12月31日的的美國申請第09/474,915號；申請日為1999年12月13日的的美國申請第09/459,443號；以及申請日為2001年6月4日的美國申請第09/873,797號中所描述的提供了這些軛合物的方法，在此將其全文引入作為參考。
第二類軛合物是微PAG化的。對這類軛合位而言，一旦所述軛合物處于血流中，所述寡聚物的烷基部分就被剪切掉。當軛合是在與受體，NPR-A發(fā)生結(jié)合所必需的促尿鈉排泄肽區(qū)域內(nèi)進行時，這些軛合物是尤其有用的。在這種情況下，第一類寡聚物對穩(wěn)定性和遞送是有益的，但對活性卻是有害的。第二類軛合物降低或消除了這一問題。所述兩性寡聚物在通過了消化道之后依然保持完整，并增強了在上十二指腸的吸收。一旦進入循環(huán)，所述烷基部分就被剪切掉。因此，當其到達所述受體時，較小的寡聚物與循環(huán)肽連接。在一些實施方案中，空間位阻的減少引起受體活性的加強。屬于這種第二類的一些能夠提供軛合物的寡聚物，以及提供這種軛合物的方法描述在Ekwuribe的美國專利第6,309,633號以及申請日為2001年12月19日的美國申請第10/018,879號中，在此將其全文引入作為參考。
第三類軛合物是完全可水解的。對這類軛合物而言，一旦所述軛合物被吸收，整個寡聚物就被剪切掉。與第二類軛合物相類似，當軛合發(fā)生在結(jié)合所必需的區(qū)域內(nèi)時，這些軛合物是尤其有用的。然而，在所述微PAG化軛合物依然不能保留足夠活性的情況時，第三類軛合物可以完全地避免所述寡聚物干擾與受體結(jié)合的可能性。在這種情況下，所述軛合物在通過消化道之后依然保持完整。一旦所述軛合物被吸收，所述寡聚物就被剪切，然后將天然肽釋放至循環(huán)中。
hBNP的軛合?？梢允褂肗-羥基琥珀酰亞胺，一種肽化學中的常用活化基團來活化兩性寡聚物(C6PEG7)的羧基。一旦活化之后，所述寡聚物就可在水溶性或DMSO溶液中與所述肽相連接。hBNP有四個軛合位點3個Lys殘基和其N末端。根據(jù)改變反應的化學計量學，可以對軛合程度(單軛合，二軛合等)進行控制。通過改變反應條件也可以改變產(chǎn)物分布情況。通過活性分析發(fā)現(xiàn)了軛合的優(yōu)選位點，也可通過改變化學計量學和反應條件獲得所希望軛合物的優(yōu)選合成。
PEG-烷基寡聚物的選擇。通過改變烷烴(疏水性)和PEG(親水性)成分的相對長度，可以改善所述軛合物的兩親性和溶液結(jié)構(gòu)。PEG部分在溶液中具有很強的撓性并且對酶的抗性具有重要作用。所述烷基部分可增強在消化道中的吸收和/或影響與細胞膜的相互作用。當所述靶位是細胞表面的膜結(jié)合蛋白，例如NPR-A時，后一個特征是特別重要的。因此，對寡聚物的選擇可以確定軛合物在酶穩(wěn)定性和口服生物利用率方面的有效性。
hBNP軛合物的純化?？墒褂糜僧惐?水(0.1％三氟乙酸)制成的溶劑梯度系統(tǒng)在制備HPLC柱(C-18)上純化所述反應混合物。將溶劑蒸發(fā)并冷凍干燥得到干燥的產(chǎn)物。通過反相HPLC和質(zhì)譜來確定軛合物的純度。
9.21.1 1類寡聚物非水解的已合成了超過30種采用非水解寡聚物(1類)的軛合物。對這類軛合物而言，所給藥的藥物物質(zhì)是作為受體發(fā)揮作用的物質(zhì)。換言之，所述寡聚物及其與所述肽的連接從給藥時間直到清除時間都保持完整。肽作圖實驗說明了在hBNP上與所述寡聚物結(jié)合的位點。通過改變加入至所述反應中的寡聚物量，可將產(chǎn)物分布變得不對稱。所形成的主要單軛合物是在Lys3軛合的；主要的二軛合物具有在Lys3和Lys4連接的寡聚物。改變反應條件，可形成單獨產(chǎn)物的三軛合物和/或四軛合物。三軛合物的特征是在Lys3，Lys14和Lys27具有寡聚物連接。四軛合物在N末端加上了第四個連接。最開始可將全部獲得的單-，二-，三-和四軛合物進行分離，在體外測定活性。根據(jù)活性數(shù)據(jù)，當使用1類寡聚物時，就集中在Lys3單軛合物。
9.2 1.2 2類寡聚物微PEG化的因為Lys14和Lys27位于(或鄰近)BNP的結(jié)合部分，這些位點的微PEG軛合能夠使所述肽更加完全地軛合并依然保持活性，根據(jù)這一理論，合成了采用微PEG化(2類)的8種軛合物。所述兩性寡聚物在通過消化道后依然保持完整，并增強了在十二指腸的吸收。一旦進入循環(huán)，所述烷基部分就被剪切掉。因此，當其到達所述受體時，較小的寡聚物與循環(huán)肽連接?？梢栽诩羟兴鐾榛鶊F之前和之后合成這類三-和四-軛合物。即使當所述烷基被剪切之后，在三個或四個位點上與BNP連接的小PEG單位對活性依然是有害的(數(shù)據(jù)在下一部分中顯示)，盡管這些軛合物保持了治療顯著的活性程度。
9.21.3 3類寡聚物可水解的寡聚物合成了8種采用完全可水解寡聚物(3類)的軛合物。對這類軛合物而言，其在通過消化道之后依然保持完整。一旦所述軛合物被吸收，所述寡聚物就被剪切掉，在循環(huán)中釋放出了天然肽。與第二類寡聚物相類似，當軛合發(fā)生在結(jié)合所必需的區(qū)域內(nèi)時，這些軛合物是尤其有用的。然而，在所述微PEG化軛合物未能保持其活性的情況下，第三類軛合物完全避免了所述寡聚物干擾受體結(jié)合的可能性。從這類寡聚物可制備單-，二-，三-和四-軛合物。三-和四-軛合物是更不穩(wěn)定的。對這兩種軛合物進行了測定。
可使用由異丙醇/水(0.1％三氟乙酸)制成的溶劑梯度系統(tǒng)在制備HPLC柱(C-18)上純化所述反應混合物。將溶劑蒸發(fā)并冷凍干燥從而提供了呈干燥粉末的所述軛合物。通過反相HPLC和質(zhì)譜來確定軛合物的純度。
在所述分析中對天然BNP進行測定，從而提供了針對于天然和野生型hBNP肽的活性的測定。所采用的天然hBNP是1-32氨基酸序列的肽SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH，(SEQ ID NO98)，其中C10和C26由二硫鍵相連成鍵。在表1中提供了29種所述構(gòu)建體的結(jié)果和結(jié)構(gòu)。測定了BNP軛合物的EC50和Emax，并將這些值與在相同實驗條件下獲得的天然肽測定值進行比較。這些數(shù)據(jù)與沒有寡聚部分天然BNP(1-32氨基酸)的比較如表1所示。其結(jié)果說明包括有1類修飾部分Lys3(BNP-002)的BNP單軛合物，以及在Lys14或Lys27包括有2類修飾部分的BNP單軛合物是優(yōu)選的。
單-1，單-2，單-3和單-4是BNP的單軛合物，并以其從HPLC中洗脫出來的順序進行標記。在下表中，單-1 BNP是如下的BNP肽軛合物其包括了在Lys-3 BNP殘基上顯示的修飾部分(寡聚物結(jié)構(gòu))。單-2和單-3共同從HPLC中洗脫出來，其是Lys-14和Lys-27的混合物。二軛合物通常是從HPLC一起洗脫出來的混合物。主要的二軛合物是Lys3/Lys14和Lys3/Lys27。主要的三軛合物是在Lys3，Lys14和Lys27軛合的。鑒定為“單-4”的產(chǎn)物包括在所述BNP肽N末端的修飾部分(寡聚物)?！皢?1”包括在所述BNP肽Lys3的修飾部分。“單-2”產(chǎn)物包括在所述BNP肽Lys14上，或在所述BNP肽Lys27上軛合的修飾部分(寡聚物)。結(jié)果參見圖6a-d所示的表。
9.22促尿鈉排泄肽候選物-尿擴張素，樹眼鏡蛇促尿鈉排泄肽(DNP)和犬促尿鈉排泄肽可以預期本發(fā)明的軛合技術(shù)可被應用于多種不同的促尿鈉排泄肽和這些肽的類似物，從而構(gòu)建出任意數(shù)量具有生物學活性的不同促尿鈉排泄肽軛合物實施方案，在這些實施方案中，所述軛合物保留了藥理學活性，增強了細胞膜滲透性，和/或蛋白酶抗性。除了本說明書中幾個實施例所描述的hBNP，這些候選肽還包括了部分列舉如下的從以下生物等價肽/蛋白質(zhì)組合中制備和/或分離出來的肽，肽片段和全肽，以及多種構(gòu)建體肽。本發(fā)明的范圍還包括了在本發(fā)明實施方案制劑中的這些構(gòu)建體及其保守性取代構(gòu)建體，以及如本發(fā)明所述在治療充血性心力衰竭中具有至少一個修飾部分以軛合形式存在的含有這些構(gòu)建體的藥物制劑。這些肽具有適合修飾軛合部分的結(jié)構(gòu)1.尿擴張素(在N末端具有4個額外殘基的hANP)TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFX1Y(SEQ ID NO99)氨基酸T限定了修飾部分軛合位點。在上述序列中，X1是賴氨酸或者是除精氨酸之外的氨基酸。當X1是賴氨酸時，可以提供另一個修飾部分軛合位點。
2.犬促尿鈉排泄肽(犬NP)犬促尿鈉排泄肽具有生產(chǎn)軛合物的天然優(yōu)勢。在其環(huán)結(jié)構(gòu)上不存在軛合位點。軛合位點僅存在于N-和C-末端。這些特征使得軛合能夠不喪失活性。其還導致了產(chǎn)物的更小分布，具有更高的產(chǎn)量且更容易純化。
SPX1MMHX2GGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y(SEQ.ID.NO100)X1，X2和X3的氨基酸位點是修飾部分軛合位點。在這種中性肽中，全部3種肽可用于具有修飾部分的軛合。其環(huán)區(qū)域定義為氨基酸10(C)-氨基酸26(C)?？梢灶A期，在位點3，14或27上的任意2種或全部3種氨基酸都可以被除Lys之外的殘基，如Arg所取代。
3.樹眼鏡蛇促尿鈉排泄肽(DNP)EVX1YDPCFGHX2IDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO.101)X1和X2的氨基酸位點是修飾部分軛合位點。在本實施例中，X1和X2都是氨基酸Lys。在一些實施方案中，X1是Arg或X2是Arg。N末端同樣也是軛合位點。優(yōu)選地，當X1是精氨酸時，X2是Arg(或除賴氨酸之外的氨基酸)。任意地，所述肽可在N末端包括另一個軛合位點。
4.C-型促尿鈉排泄肽(CNP)GLSK1GCFGLK2LDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO.)K1和K2的氨基酸位點是修飾部分軛合位點。在本實施例中，K1和K2都是氨基酸Lys。然而，所述肽的類似物可包括在該肽這些位點的任意一個或兩個上用Arg(R)代替Lys。任意地，所述肽可在N末端包括另一個軛合位點。
5.ANP(人)(大鼠)(豬)SLRRSSCFGGRXDRIGAQSGLGCNSFRY(SEQ ID NO.103)在這個實施例中，X是Met(M)或Ile(I)，且其中在所述N末端有一個修飾部分軛合位點，或R變?yōu)镵從而提供了一個修飾部分位點。
9.23對人促尿鈉排泄肽受體A(NPR-A)的激動劑活性BNP的血管舒張，促尿鈉排泄和利尿性質(zhì)歸因于第二信使，環(huán)GMP(cGMP)。cGMP的產(chǎn)生是由鳥苷酸環(huán)化酶完成的，鳥苷酸環(huán)化酶是當BNP結(jié)合于內(nèi)皮細胞表面的促尿鈉排泄肽受體A(NPR-A)時活化的。還對具有非水解(1類)或微PEG化(2類)寡聚物的軛合物在人動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)中刺激cGMP產(chǎn)生的能力進行了測定。對微PEG化基團而言，可對具有和不具有烷基部分連接的軛合物進行檢測。在本分析中未對具有完全可水解的寡聚物(3類)的軛合物進行測定，因為所述化合物在循環(huán)中最終釋放的是天然肽。
采用非水解(1類)寡聚物的三-和四-軛合物活性較低。因此，制備病測定了采用微PEG化的(2類)寡聚物的三-和四-軛合物。從這些2類寡聚物產(chǎn)生的體外數(shù)據(jù)如表2所示。
表2采用2類寡聚物的hBNP軛合物體外活性
圖3所示為使用1類寡聚物的多種Lys-3軛合物的活性曲線。表2中的4種軛合物具有與以BNP肽的天然形式所得活性最接近的平均Emax和平均EC50(表3)并采用其他分析對其進行進一步分析。
表3hBNP軛合物的體外活性
從Clonetics購買初級HAEC進行cGMP篩選。在實驗前一天將細胞接種入12孔板內(nèi)。在實驗當天，用0.5mM IBMX在37℃對細胞預孵育10分鐘從而抑制磷酸二酯酶。向所述細胞中加入測試化合物，在37℃再保持1小時，通過裂解細胞中止孵育來測定cGMP。使用基于ELISA的cGMP試劑盒測定cGMP產(chǎn)生(CatchPoint-cyclic GMPFluorescent Assay Kit，catalog #R8074，Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)。該試劑盒通過在96孔模式中的競爭性免疫分析來測定cGMP。向包被的微孔板中加入細胞裂解物，然后再建如抗-cGMP抗體和辣根過氧化酶(HPR)-cGMP軛合物。將微孔板在室溫孵育2小時，然后洗滌4次。加入底物溶液并對每個小孔的熒光強度進行定量。熒光信號的強度隨著cGMP水平的增高而降低。在每個實驗中將天然hBNP作為陽性對照。
9.24 BNP軛合物及其升高的對蛋白酶的抗性在存在多種蛋白酶，例如胰蛋白酶和糜蛋白酶的情況下對在體外具有活性的促尿鈉排泄化合物進行活性測定?？赏ㄟ^在存在胰蛋白酶和糜蛋白酶情況下，所述化合物軛合物的半衰期來測定軛合于蛋白酶的這些化合物的穩(wěn)定性。因此，在這些分析中的若干軛合物都具有比天然hBNP更長的半衰期。例如，參見圖4。
在37℃將軛合物與酶孵育2-120分鐘。通過加入1∶1的1％三氟乙酸(TFA)∶異丙醇淬滅溶液中止消化。在每個實驗中都將hBNP軛合物的消化與天然hBNP的消化進行比較。通過HPLC對每個樣本中殘留的母體化合物量進行定量。
9.25 BNP軛合物及其口服生物利用率在大鼠中，對在體外具有活性的軛合物測定了其口服生物利用率。通過強飼向胃腸道給藥所述軛合物，并使用可獲得的放射免疫分析方法測定了血流中hBNP軛合物的存在。用于hBNP檢測的抗體是特異性的；與大鼠BNP的交叉反應活性低于1％。因此，由內(nèi)源大鼠BNP引起的交叉反應性和干擾不在考慮范圍之內(nèi)。
使用體重約250g的成年，雄性大鼠來測定hBNP和hBNP軛合物的口服生物利用率。將大鼠固定過夜并隨意提供飲水(除了在給藥前2小時至給藥后1小時之間不給水)。
給藥前，將大鼠稱重并通過體重分為給藥組，使得每個給藥組的重量大約相同。每個時間點使用5只大鼠。以2.5mg/kg劑量以液體脂肪酸制劑的形式給藥軛合物。在給藥后5，15，30和60分鐘采集血液樣本。收集所有給藥實驗的中樞靜脈血并離心。將血漿樣本冷凍于-80℃進行分析。
使用特異性針對于血漿中人BNP定量測定的商業(yè)化免疫放射計量分析(IRMA)(SHIONORIATMBNP，Catalog # 127024，Shionogi & Co.，Ltd，Osaka，Japan)來測定hBNP軛合物的血漿濃度。從給藥的大鼠中抽取血液放入EDTA包被的塑料聚乙烯對苯二甲酸鹽，(PET)血液收集管中，并在冷凍(2-8℃)離心機中1600-2000x離心5分鐘。將樣本保存于塑料管保存于-80℃的無霜冰箱中直至使用。用500μL樣本進行IRMA。向具有200μL125I-BNP試劑和一個抗-BNP抗體包被珠子的管中加入100μL所述樣本。將每個管進行漩渦振蕩并在孵育時停止振蕩，在2-8℃條件下保持18-22小時。然后對所述管進行吹吸并用2.0mL洗滌溶液(緩沖溶液+0.05％NaN3)洗滌然后再次吹吸。重復洗滌過程并吸出管中的內(nèi)容。通過γ計數(shù)器測定每個管中剩余的放射活性。放射活性與樣本中hBNP和hBNP軛合物的濃度成正比。為了正確定量hBNP軛合物樣本并允許在hBNP軛合物與天然分子之間存在抗體識別差異，濃度是根據(jù)從適當hBNP軛合物得到的標準曲線進行測定的。
在給藥5分鐘之后，在大鼠中給藥的四種軛合物在循環(huán)中全部可以檢測到(圖5)。這四種軛合物是BNP-002，BN-021，BN-022和BN-024。
9.26在肽結(jié)構(gòu)上二軛合物，單軛合物和三軛合物聚合物修飾的制備本實施例旨在證明本發(fā)明在構(gòu)建選擇的多軛合形式生物活性肽中的應用。例如，本說明書描述了人促尿鈉排泄肽，hBNP的單軛合物，二軛合物和三軛合物形式。
軛合于hBNP的方法通過用于與hBNP軛合的相同方法對寡聚物進行連接。區(qū)別在于可以加入更多的活化寡聚物(1-10種等價物；優(yōu)選為3-5種等價物)。
賴氨酸存在于序列的末端。在蛋白酶存在的條件下，假定多個軛合位點會提供更高的穩(wěn)定性。環(huán)內(nèi)缺乏軛合位點對于在NPR-A結(jié)合基序上進行結(jié)合是有利的。
9.27hBNP兩性聚合物軛合物的合成通過使用不同尺寸和化學組成的兩性寡聚物，可以改變肽軛合物，例如hBNP軛合物的吸收和分配性質(zhì)。軛合物篩選可用來確定哪一種軛合物保留了天然肽的活性并表現(xiàn)出對酶的抗性。具有所希望性狀組合(例如，對受體的激動劑活性，對蛋白水解的抗性和口服生物利用率)的軛合物可稱為更廣泛體內(nèi)檢測的首要候選物。
9.27.1軛合于BNP的一般程序單軛合物hBNP使用的位點是Lys3或Lys14，或Lys27，或所述肽的N末端。
方法I單軛合物的制備將hBNP(1當量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。將活化的寡聚物(1.1當量)溶解于最小量的THF中，并加入h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC監(jiān)測所述反應。通過取50μL所述反應并將其稀釋入500μL含有0.1％TFA的H2O中，制備適于HPLC監(jiān)測的樣本。反應進行45分鐘。如果反應沒有立即純化，則將其冷凍直至再次進行純化之時。
方法II多軛合物的制備將hBNP(1當量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。一旦h-BNP溶解，加入TEA(120當量)并將溶液攪拌5分鐘。然后將活化寡聚物(對二軛合物而言為2.2當量，對三軛合物而言為4當量，對四軛合物而言為5當量)溶解于最少量THF中，并加入至h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC監(jiān)測所述反應。通過取50μL所述反應并將其稀釋入500μL含有0.1％TFA的H2O中，制備適于HPLC監(jiān)測的樣本。反應進行45分鐘。如果反應沒有立即純化，則將其冷凍直至再次進行純化之時。
二軛合物hBNP使用的位點是hBNP上的Lys3，和Lys14，或Lys3和Lys27。
二軛合物hBNP使用的位點是Lys3，Lys14和Lys27。
9.28促尿鈉排泄化合物類似物本實施例旨在證明本發(fā)明所提供多種具有生物活性的BNP-類肽及其肽片段在實施本發(fā)明時的應用。這些變體形式，或類似物的特征在于存在一個或多個突變的氨基酸替代了對應天然肽/蛋白的天然存在的氨基酸。
1.hBNP-環(huán)區(qū)域單獨的類似物CFGRXMDRISSSSGLGC-(SEQ ID NO.1)其中X是除了Lys的氨基酸，或X為Arg或Gly。
2.hBNP-3Arg的類似物或除了Lys的氨基酸-SPRMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-X2-(SEQ ID NO.104)其中X2是長度為1-10的氨基酸，優(yōu)選為1-6氨基酸。在一些實施方案中，X2是KVLRRH(SEQ ID NO.105)，KVLRR(SEQ ID NO.1045，KVLR(SEQ ID NO.106)，KVL，KV，K，RVLRRH(SEQ ID NO.16)，RVLRR(SEQ ID NO.16)，RVLR(SEQ ID NO.17)，RVL，RV或R。
3.hBNP-3突變位點的類似物；3Arg，14Arg，27ArgSPX1MVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH(SEQ ID NO.107)其中X1是Lys或除了Lys的其他氨基酸，X2是除了Lys的其他氨基酸，X3是Lys或除了Lys的其他氨基酸。在一些實施方案中，X1，X2和X3是獨立的Arg或Gly。在其他實施方案中，X1是Lys，X2和X3是獨立的Arg或Gly。在優(yōu)選實施方案中，X1，X2和X3中的至少一個是Lys。
4.hBNP-14和27Arg的類似物，具有一個末端修飾位點，X1。
X1SPKMVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH-(SEQ ID NO.108)其中X1是C末端修飾位點(Ser)；且其中X2和X3是除了Lys之外的其他氨基酸。在一些實施方案中，X2和X3是獨立的Arg或Gly。在其他實施方案中，X2是Arg且X3是Lys。
5.hBNP-14Arg的類似物
(在全部片段中，其中一個或兩個末端都縮短至環(huán))X1---CFGRRMDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.109)其中X1的長度為1-10個氨基酸，優(yōu)選為1-9個氨基酸，且其中X2的長度為1-10個氨基酸，優(yōu)選為1-6個氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC(SEQ ID NO.110)，PKMVQGSGC(SEQ ID NO.111)，KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)，MVQGSGC(SEQ ID NO.113)，VQGSGC(SEQ ID NO.114)，QGSGC(SEQ ID NO.115)，GSGC(SEQ IDNO.116)，SGC，GC，C，SPK，SPKM(SEQ ID NO.117)，SPKMV(SEQID NO.118)，SPKMVQ(SEQ ID NO.119)，SPKMVQ(SEQ ID NO.119)，KMVQ(SEQ ID NO.120)，KMV，KMVQG(SEQ ID NO.121)，KMVQGS(SEQ ID NO.122)，KMVQGSG(SEQ ID NO.123)或KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)。X2可包括KVLRRH(SEQ ID NO.105)，KVLRR(SEQ ID NO.105)，KVLR(SEQ ID NO.106)，KVL，KV，K，RVLRRH(SEQ ID NO.16)，RVLRR(SEQ ID NO.16)，RVLR(SEQ ID NO.17)，RVL，RV或R。
6.hBNP-1-29-3Arg的類似物或除了Lys的其他氨基酸SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVL(SEQ ID NO.124)其中X1是Arg，或除了Lys的其他氨基酸。
7.hBNP-1-26-3Arg的類似物或除了Lys的其他氨基酸SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO.125)其中X1是Arg，Gly，或除了Lys的其他氨基酸。
8.hBNP-縮短的C-末端Lys14Arg，27Arg，或除了Lys的其他氨基酸的類似物X1-CFGRRMDRISSSSGLGC-RVLRRH(SEQ ID NO126)其中X1的長度為1-10個氨基酸，優(yōu)選為1-9個氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC(SEQ ID NO.110)，PKMVQGSGC(SEQ ID NO.111)，KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)，MVQGSGC(SEQ ID NO.113)，VQGSGC(SEQ ID NO.114)，QGSGC(SEQ ID NO.115)，GSGC(SEQ IDNO.116)，SGC，GC或C。
9.hBNP-Lys14Arg的類似物或除了Lys的其他氨基酸-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ.ID.NO.127)其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸，且X2的長度為1-4個氨基酸。在一些實施方案中，X2是SSSS(SEQ ID NO.3)，SSS，SS，S，KSSS(SEQ ID NO.4)，KSS或KS。
1O.hBNP-Arg30Lys類似物或類似電荷的其他等價氨基酸SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVRX1RH(SEQ ID NO.128)其中，X1是Lys或除了Arg之外的其他氨基酸。
11.hBNP-27Arg或除了Lys的其他氨基酸的類似物SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCX1VLRRH(SEQ ID NO.129)其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸。
12.hBNP的延伸形式-SPKMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVLRRH-X2(SEQ IDNO.130)X2是Lys，Cys，或Lys+Xaan，其中n為1-100，1-50或1-10，且Xaan是獨立選擇的任意氨基酸，或氨基酸組，或未知的氨基酸。
13.hBNP突變體類似物的缺失-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ ID NO.131)其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸，且其中X2的長度為1-4個氨基酸，例如SSSS(SEQ ID NO.13)，SSS，SS，S，KSSS(SEQID NO.4)，KSS或KS。
14.hBNP類似物-受體特異性SPZ1MVQGSG-CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C(SEQ ID NO.132)其中，Z1是精氨酸或除了賴氨酸之外的其他氨基酸，且其中Z2是精氨酸或除了賴氨酸之外的其他氨基酸，其中X1是Gly Met Leu，Phe，Ile或其保守的取代物，其中X2是Leu，Trp，Tyr或Phe或其保守的取代物，且其中X3是Gly，Arg或其保守的取代物。在這種類似物的其他實施方案中，Z1是賴氨酸且Z2是精氨酸或除了賴氨酸之外的其他氨基酸。
15.ANP類似物KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C-NSFKY(SEQ ID NO.133)其中X1是T，a，R，H，P，E；其中X2是K，N-甲基，Arg，S，D或P；其中X3是Arg，K，Y，F(xiàn)，S，P，Orn，Har，Har，對脒基苯基Ala，I，除了Gly或Try的具有正電荷的其他氨基酸。
9.26為生產(chǎn)BNP軛合物的天然BNP和BNP原肽和原肽的重組生產(chǎn)方法口服給藥方式需要大量的BNP肽供給。由于與供給BNP相關(guān)的合成方法成本較高且供給量有限，對于制備所述軛合BNP肽而言重組技術(shù)是優(yōu)選的。在此描述了為生產(chǎn)所述軛合物而供給肽的重組技術(shù)。
9.26.1重組技術(shù)的選擇目的在于選擇一種高表達的重組技術(shù)，其能夠表達無需糖基化的小蛋白(＞10,000K)，且具有容易分離的以可溶形式分泌的肽。
使用了基于E-coli的表達系統(tǒng)(Seilhamer等人的美國專利第5,114,923號，在此將其全文引用作為參考)，來生產(chǎn)適用于核準藥物Natrecor_的大量BNP。E-coli細菌系統(tǒng)的使用是公知的，且在過去多年中被廣泛地應用于單鏈蛋白的重組生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)中。E-coli系統(tǒng)是用于實驗室的較簡單的系統(tǒng)?，F(xiàn)已開發(fā)了許多新的E-coli系統(tǒng)，其具有較高的細胞密度來提供較高的蛋白表達產(chǎn)量。然而，一般而言，基于E-coli系統(tǒng)的使用存在有局限，因為其具有以不溶形式將蛋白分泌成為包含體的趨勢，并且可被不適當?shù)卣郫B(在半胱氨酸氨基酸殘基之間的不適當二硫鍵)。這些局限通常導致了高成本較好的，和昂貴的下游處理步驟將所述蛋白從包含體中分離出來，并將不適當折疊的蛋白重新折疊成其天然狀態(tài)。
9.27原蛋白(原-BNP)序列的構(gòu)建體所述促尿鈉排泄化合物可以是在序列上具有兩個或更多促尿鈉排泄化合物單位的肽并可在所述促尿鈉排泄化合物單位之間任意地包括間隔物，且所述構(gòu)建體還可任意地在所述促尿鈉排泄化合物的任意一個末端或兩個末端包括引導序列和/或延伸序列。例如，在對肽沒有限制的條件下，對任意特定的構(gòu)建體而言，所述多肽可具有以下結(jié)構(gòu)NP-[NP]n；NP-[間隔物-NP]n；引導物-NP-[NP]n；引導物-NP-[間隔物-NP]n；引導物-[間隔物-NP]n；引導物-[間隔物-NP]n-延長物；引導物-NP-[間隔物-NP]n-延長物；其中，n可以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10；NP是促尿鈉排泄肽或促尿鈉排泄肽類似物9.29原-BNP本發(fā)明還提供了原-X-肽，其中X是促尿鈉排泄肽?？蓪⑦m于BNP的所述原-X-肽設(shè)計成與Pro部分一樣攜帶有引導肽，且其可通過酶切位點連接于BNP序列?？蓪蛐蛄羞M行設(shè)計，使其能夠在選定的重組技術(shù)中編碼如原-BNP肽的肽表達。可對原-部分進行選擇從而使得對來自發(fā)酵的方案進行更有效的純化。原-BNP肽可與寡聚物在表達后軛合，且隨后通過選定的酶對所述原部分進行剪切，動員(mobilized)或固定，從而提供了通過常規(guī)色譜方法更容易純化獲得較高產(chǎn)率的BNP軛合物。在原部分和BNP序列之間可包括特異性的酶切位點，從而使得所述原部分可被酶切從而產(chǎn)生所述BNP序列。
9.29.1原-BNP模式合成可采用具有BNP序列和其他特異性氨基酸的合成原-BNP模型對所述原-BNP構(gòu)建體進行評估。所述合成模型可與寡聚物軛合并容易受到特異性酶的剪切從而監(jiān)控BNP-寡聚物軛合物的產(chǎn)生。
9.29.2原-BNP模式合成引導序列(原部分)可包括根據(jù)所述合成模型得到的具有特異性酶切序列的小肽?？稍谝龑?間隔序列中插入其他具有功能的氨基酸序列從而允許簡單的原-BNP蛋白純化。引導序列還可作為原-部分在軛合過程中保護N-末端不受到不希望的修飾，并在特異性的酶處理過程后被剪切。還可以向所述引導肽序列中引入其他特征從而允許其可作為原-BNP或原-BNP寡聚物軛合物被簡單分離出來。所述引導肽可連接于所述BNP序列的C-末端。所述引導肽可被設(shè)計成允許公知融合蛋白的連接。
9.29.3原-BNP的表達可以在BNP的N-末端或/和C-末端提供具有功能的特異性引導序列，其可適于插入選定重組技術(shù)的表達基因序列或表達盒中。還可以將公知融合蛋白的表達序列(參見Gaken等人，2000，將其全文引用作為教導相關(guān)融合蛋白的參考)插入某個所述構(gòu)建體的表達基因中。使用已經(jīng)建立的技術(shù)，可對所述細胞中成功轉(zhuǎn)化的基因進行監(jiān)測。將陽性的轉(zhuǎn)基因分離物或細胞分離出來并進行生長，以評價所設(shè)計蛋白的表達情況。對所表達的蛋白進行純化和測序。然后對純化的原-BNP構(gòu)建體進行評價。對選定的細胞系進行表征并選擇以用作未來使用。
9.29.4用胰蛋白酶和羧肽酶-B剪切間隔物和His標記的引導肽來構(gòu)建原-五肽BNP-1根據(jù)通式引導物-NP-[間隔物-NP]n，可提供原五肽BNP-1全長的編碼序列，其中間隔物是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.78)，引導物是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.79)，延伸物是(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.80)；NP是hBNP。
在這一實施方案中，可以使用胰蛋白酶和羧肽酶B酶混合物釋放所述NP或NP軛合物。
(a)質(zhì)粒構(gòu)建采用標準的分子生物學技術(shù)，構(gòu)建了表達原-五肽BNP1[(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg.]-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP]氨基酸序列(SEQ ID NO.134)的載體。所述質(zhì)粒對于所使用的宿主細胞(例如，E coli)進行了密碼子優(yōu)化。
可將編碼這一肽序列的DNA片段進行人工拼接，從引導物序列之后開始，并以His標簽的3’端/BNP序列的5’端的順序加入剪接位點?？墒褂脴藴始夹g(shù)從聚丙烯酰胺凝膠中純化出所述序列的cDNA。通過限制性酶分析驗證了質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
(b)表達和細胞回收使用足以生產(chǎn)出所述原-多肽的營養(yǎng)物質(zhì)來培養(yǎng)表達原-五肽BNP-1的E-coli細胞。通過細胞破壞，然后離心，切線過濾(tangentialfiltration)/超濾，勻漿和包含體增溶從細胞中回收(His)6標記的原-五BNP。
(c)通過親和層析從溶解的包含體中分離原-五肽BNP-1
制備HiTrp螯合(Ni2+)HP柱(Amersham Bioscience)，并用10倍柱體積的蒸餾水洗滌柱子，從而去除保留的溶液，并用金屬離子溶液(NiSO4，0.1M)進行裝填，然后用蒸餾水去除未結(jié)合的離子。將包含體溶解之后的濾液上樣至上述柱子中，用10倍體積的結(jié)合緩沖液(20mM磷酸緩沖液，pH7.4，含有0.5M氯化鈉和20mM咪唑)洗滌所述柱子。使用線性梯度的10倍柱體積洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，pH7.4，含有0.5M氯化鈉和0.5M咪唑)對所述柱子進行洗脫，然后再用2倍柱體積的洗脫緩沖液100％地進行洗脫。這個方法可以通過將Ni2+親和性地螯合于所述柱子從細胞回收樣本的其他成分中純化出(His)6標記的五肽。通過RP-HPLC方法分析所述五肽的純度＞30％。
(d)純化和分析然后通過C-18制備性HPLC將所述五肽純化至純度＞75％。通過ES/MS分析對純化的五肽進行分析，并提供了預測原-五肽BNP-1分子量的M+1離子峰。對所述材料的微型序列測定被用來確證所述多肽的氨基酸序列。
9.29.5從原-五肽BNP-1制備多個單位的Lys-3 BNP軛合物(a)五肽的軛合將原-五肽BNP-1(3.20×10-4mmol)溶解于5mL DMSO中。向該溶液中加入45μL三乙胺。在向所述溶液中加入溶解于乙醇的活化PEG7-己基寡聚物(19.6×10-4mmol)之前，將所述溶液攪拌5分鐘。在所述反應進行使得HPLC分析表明所述原-肽已被消耗(或所述原-肽的濃度不再降低)之后，通過加入0.5mL 50％水溶性乙酸溶液猝滅所述反應。然后對所述反應混合物進行處理并交換入100mM Tris-HCl緩沖液，pH7.6中。預期這一混合物中的主要成分會在每個BNP單位的Lys3上與肽軛合。
(b)酶混合物對寡聚物-軛合原-五肽BNP-1和軛合的BNP單位的剪切通過HPLC測定來自于實施例2(a)產(chǎn)物混合物的Tris-HCl溶液等分物來確定其中的肽濃度。在pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中制備胰蛋白酶(TPCK處理的；來自牛胰腺)溶液。在pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中制備羧肽酶B(來自豬胰腺)溶液。
將粗混合物(1摩爾當量)與胰蛋白酶(1.39×10-3摩爾當量)和羧肽酶B(4.56×10-4摩爾當量)反應。30分鐘后，通過加入1％三氟乙酸的乙腈溶液猝滅所述反應。將該反應所得的產(chǎn)物混合物進行處理并通過HPLC進行分析。滯留時間(與參考標準的滯留時間相比)和質(zhì)譜分析可用來確定其一致性。該反應的預期產(chǎn)物是Lys3己基-PEG7-軛合的BNP，Lys14己基-PEG7-寡聚物-軛合的BNP，Lys27己基-PEG7-寡聚物-軛合的BNP，二己基-PEG7-寡聚物軛合的BNP，Des Arg-His BNP和DesArg-His己基-PEG7-寡聚物軛合的(Lys3或Lys14或Lys27)BNP。這一混合物的主要成分是Lys3-己基-PEG7-軛合的BNP。
9.29.6從粗軛合混合物中純化原-五肽BNP-1軛合物使用反相HPLC從實施例2(b)所述的軛合反應中分離得到了各種主要的產(chǎn)物。使用公知用于分離肽和蛋白的商業(yè)可獲得C18固定相裝填柱子(1cm直徑×25cm長度)，隨后將其整合入HPLC系統(tǒng)中。用含有75％流動相A(H2O和0.1％三氟乙酸)和25％流動相B(乙腈和0.1％三氟乙酸)的混合物洗脫緩沖液平衡所述系統(tǒng)。將來自實施例21(a)產(chǎn)物混合物的Tris-HCl溶液上樣至所述柱子，分離出主要的產(chǎn)物，并使用乙腈成分的百分數(shù)從25％增加至55％的梯度洗脫液在120分鐘內(nèi)進行洗脫。收集各個組分并通過HPLC分析來確定所得產(chǎn)物的一致性和純度。將每種產(chǎn)物的共同組分合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。通過HPLC和質(zhì)譜測定每個產(chǎn)物峰的一致性和純度。預期的產(chǎn)物由3種肽單軛合物(在每個BNP單位的Lys3或Lys14或Lys27軛合)，3種肽二軛合物(在Lys3&Lys14或Lys14&Lys27或Lys27&Lys3軛合)，1種肽三軛合物(在Lys3，Lys14和Lys27軛合)，以及一種肽四軛合物(在引導肽N-末端，Lys3，Lys14和Lys27軛合)組成。
9.29.7從原-五肽BNP-1的分離的軛合物的酶混合物剪切物制備Lys3-己基-PEG7-寡聚物軛合的BNP將使用實施例3所述方法得到的軛合物，即單軛合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物原-五肽BNP-1溶解于100mM Tris-HCl緩沖液，pH7.6中，并采用HPLC分析所得溶液從而確定其中的肽濃度。在pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中制備胰蛋白酶(TPCK處理的；來自牛胰腺)溶液。在pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中制備羧肽酶B(來自豬胰腺)溶液。將粗混合物(1摩爾當量)與胰蛋白酶(1.39×10-3摩爾當量)和羧肽酶B(4.56×10-4摩爾當量)反應。30分鐘后，通過加入1％三氟乙酸的乙腈溶液猝滅所述反應。將該反應所得的產(chǎn)物進行處理并通過HPLC進行分析。滯留時間(與參考標準的滯留時間相比)和質(zhì)譜分析可用來確定其一致性。該反應的預期產(chǎn)物分別是各種所使用到的軛合物。例如，單軛合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物-軛合的原-五肽BNP-1旨在提供，Lys3-己基-PEG7-寡聚物-軛合的BNP和Des Arg-His Lys3-己基-PEG7-寡聚物-軛合的BNP。
9.29.8在硼酸鹽緩沖液/有機溶劑中在原-五肽BNP-1的Lys3上的位點選擇性軛合將原-五肽BNP-1(0.0195mmol)溶解于5mL的50mM硼酸中。用4N氫氧化鈉溶液將該溶液調(diào)節(jié)到pH9.3，并加入1mL乙醇，并用氫氧化鈉將其調(diào)節(jié)到pH10.4-10.9。向上述攪拌的溶液中加入溶解于1mL乙醇的活化甲基七乙二醇((PEG7)-己基寡聚物(7.5×0.0195mmol))。通過HPLC監(jiān)測所述軛合(酰化)反應的過程，并使用4N氫氧化鈉將所述pH維持在pH10.5。當反應表現(xiàn)出完成之后20分鐘，通過加入4N鹽酸將pH調(diào)至6.8猝滅所述反應。然后處理所述反應混合物并交換入pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中。所述產(chǎn)物混合物的HPLC譜說明在原-五肽BNP-1每個BNP單位的Lys3上的軛合＞40％。
9.29.9在硼酸鹽緩沖液/有機溶劑中在天然hBNP的Lys3上的位點選擇性軛合將原-五肽BNP-1(0.0195mmol)溶解于5mL的50mM硼酸中。用4N氫氧化鈉溶液將該溶液調(diào)節(jié)到pH9.3，并加入1mL乙醇，并用氫氧化鈉將其調(diào)節(jié)到pH10.4-10.9。向上述攪拌的溶液中加入溶解于1mL乙醇的活化甲基七乙二醇((PEG7)-己基寡聚物(7.5×0.0195mmo1))。通過HPLC監(jiān)測所述軛合(酰化)反應的過程，并使用4N氫氧化鈉將所述pH維持在pH10.5。當反應表現(xiàn)出完成之后20分鐘，通過加入4N鹽酸將pH調(diào)至6.8猝滅所述反應。然后處理所述反應混合物并交換入pH7.6的100mM Tris-HCl緩沖液中。所述產(chǎn)物混合物的HPLC譜說明在所述BNP分子Lys3上的軛合＞40％。
9.30制備性層析在配有Waters 2487雙λ吸收檢測器的Waters Prep-LC系統(tǒng)中進行針對BN-054的反相HPLC分析和純化。用0.1％TFA對含有DMSO和水(16ml)的反應混合物進行進一步稀釋直至終體積為100ml。在制備柱上注射5次，每次20mL。柱子說明Symmetry Prep C18 7μm柱子，19×300mm。洗脫液梯度如下表所示，其中A是溶于水的0.1％TFA(v/v)，而B是溶解于乙腈的0.1％TFA(v/v)。檢測設(shè)定在220nm。
將各組分收集，并在配有996二極管分析檢測器和柱加熱器的Waters2690/5系統(tǒng)上進行分析層析來對BN-54的存在進行分析。在Phenomenex Luna C18(2)分析柱(5□m顆粒尺寸，300_孔徑，150×2mm)上，以1.0mL/分鐘的流速和60℃的柱溫度對軛合物進行分析。在23分鐘的洗脫液梯度是0-80％B，其中A是溶于水的0.1％TFA(v/v)，而B是溶解于乙腈的0.1％TFA(v/v)。檢測設(shè)定在220nm。
收集含有BN-54的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥得到白色粉末的BN-54。對BN-54的蛋白含量和純度進行測定并總結(jié)于如下。
下表所述為不同批次Nobex-BN054的蛋白含量
不同批次BN054，包括相關(guān)BNP標準物的代表性色譜圖都包括在圖8，9和10中。這種純化的方法可方便地適用于本發(fā)明的其他軛合物。
參考書目在此講下列文獻全文引用American Heart Association(2001).2002 Heart and StrokeStatistical Update，Dallas，TX，American Heart Association.
Anderson，W.R.，N.Ekwuribe，A.Ansari，T.M.Harris and D.Surguladze(1999).″Structure activity relationship assessment ofconjugated enkephalins in centrally mediated analgesia.″Soc.forNeuroscience，Abstracts 25((I))180.
Association，A.H.(2001).2002 Heart and stroke statistical update.Dallas，TX，American Heart Association.
Chin，M.H.and L.Goldman(1997).″Correlates of early hospitalreadmission or death in patients with congestive heart failure.″Am JCardiol 79(12)1640-4.
Ekwuribe，N.Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions，delivery and diagnostic formulations comprising the same，and method ofmaking and using the same.US5681811.
Ekwuribe，N.，M.Ramaswamy，H.S.Allaudeen and J.S.Rajagopalan(1999).″Oral insulin deliveryhydrolysable amphiphilicoligomer conjugates prolong glucose reduction.″Proceed.Intl.Symp.Control Release Bioactive Materials，Abstracts240.
Gaken et.al.，(2000)Gene Therapy，71979-1985.
Hussar，D.A.(2002).″New drugs of 2001.″J Am Pharm Assoc(Wash)42(2)227-63；quiz 263-6.
Kawai，K.，K.Hata，H.Takaoka，H.Kawai and M.Yokoyama(2001).″Plasma brain natriuretic peptide as a novel therapeutic indicator inidiopathic dilated cardiomyopathy during beta-blocker therapya potentialof hormone-guided treatment.″Am Heart J 141(6)925-32.
Kayser，S.R.(2002).″The use of nesiritide in the management ofacute decompensated heart failure.″Prog Cardiovasc Nurs 17(2)89-95.
Krishnan，B.R.，M.Ramaswamy，J.S.Rajagopalan，W.R.Anderson，H.S.Allaudeen，S.Myung and N.Ekwuribe(1999).″Oral delivery ofcalcitonin by conjugation with amphiphilic oligomers.″Proceed.Intl.Symp.Control Release Bioactive Materials，Abstracts43.
Krumholz，H.M.，Y.T.Chen，Y.Wang，V.Vaccarino，M.J.Radfordand R.I.Horwitz(2000).″Predictors of readmission among elderlysurvivors of admission with heart failure.″Am Heart J 139(1 Pt 1)72-7.
Krumholz，H.M.，E.M.Parent，N.Tu，V.Vaccarino，Y.Wang，M.J.Radford and J.Hennen(1997).″Readmission after hospitalization forcongestive heart failure among Medicare beneficiaries.″Arch Intern Med157(1)99-104.
Maisel，A.S.，P.Krishnaswamy，R.M.Nowak，J.McCord，J.E.Hollander，P.Due，T.Omland，A.B.Storrow，W.T.Abraham，A.H.Wu，P.Clopton，P.G.Steg，A.Westheim，C.W.Knudsen，A.Perez，R.Kazanegra，H.C.Herrmann and P.A.McCullough(2002).″Rapidmeasurement of B-type natriuretic peptide in the emergency diagnosis ofheart failure.″N Eng1 J Med 347(3)161-7.
Massie，B.M.and N.B.Shah(1997).″Evolving trends in theepidemiologic factors of heart failurerationale for preventive strategiesand comprehensive disease management.″Am Heart J 133(6)703-12.
McDonagh，T.A.，S.D.Robb，D.R.Murdoch，J.J.Morton，I.Ford，C.E.Morrison，H.Tunstall-Pedoe，J.J.McMurray and H.J.Dargie(1998).″Biochemical detection of left-ventricular systolic dysfunction.″Lancet351(9095)9-13.
McNairy，M.，N.Gardetto，P.Clopton，A.Garcia，P.Krishnaswamy，R.Kazanegra，M.Ziegler and A.S.Maisel(2002).″Stability of B-typenatriuretic peptide levels during exercise in patients with congestive heartfailureimplications for outpatient monitoring with B-type natriureticpeptide.″Am Heart J 143(3)406-11.
Nagaya，N.，T.Nishikimi，M.Uematsu，T.Satoh，S.Kyotani，F(xiàn).Sakamaki，M.Kakishita，K.Fukushima，Y.Okano，N.Nakanishi，K.Miyatake and K.Kangawa(2000).″Plasma brain natriuretic peptide as aprognostic indicator in patients with primary pulmonary hypertension.″Circulation 102(8)865-70.
O′Connell，J.B.and M.R.Bristow(1994).″Economic impact ofheart failure in the United Statestime for a different approach.″J HeartLung Transplant 13(4)S107-12.
Packer，M.and H.M.Cohn(1999).″Consensus recommendations forthe management of chronic heart failure.On behalf of the membership ofthe advisory council to improve outcomes nationwide in heart failure.″AmJ Cardiol 83(2A)1A-38A.
Remingtons，The Science and Practice of Pharmacy(9th Edition，1995)Richards，A.M.，M.G.Nicholls，T.G.Yandle，C.Frampton，E.A.Espiner，J.G.Turner，R.C.Buttimore，J.G.Lainchbury，J.M.Elliott，H.Dcram，I.G.Crozier and D.W.Smyth(1998).″Plasma N-terminalpro-brain natriuretic peptide and adrenomedullinnew neurohormonalpredictors of left ventricular function and prognosis after myocardialinfarction.″Circulation 97(19)1921-9.
Stewart，S.，J.E.Marley and J.D.Horowitz(1999).″Effects of amultidisciplinary，home-based intervention on unplanned readmissions andsurvival among patients with chronic congestive heart failurearandomised controlled study.″Lancet 354(9184)1077-83.
Sudoh，T.，K.Kangawa，N.Minamino and H.Matsuo(1988).″A newnatriuretic peptide in poreine brain.″Nature 332(6159)78-81.
Sudoh，T.，et.al.，(1989)，Biophys.Res.Com.，159(3)1427-1433.
Sudoh，T.，et.al.，(2002)，U.S.Patent Application U.S.2002/0086843A，EPO 542,863B1(1997)Tsuchihashi，M.，H.Tsutsui，K.Kodama，F(xiàn).Kasagi，S.Setoguchi，M.Mohr，T.Kubota and A.Takeshita(2001).″Medical andsocioenvironmental predictors of hospital readmission in patients withcongestive heart failure.″Am Heart J 142(4)E7.
Yamamoto，K.，J.C.Burnett，Jr.，M.Jougasaki，R.A.Nishimura，K.R.Bailey，Y.Saito，K.Nakao and M.M.Redfield(1996).″Superiority ofbrain natriuretic peptide as a hormonal marker of ventricular systolic anddiastolic dysfunction and ventricular hypertrophy.″Hypertension 28(6)988-94.
U.S Patent No.5,674,710-Seilhamer et.al.
U.S Patent No 6,034,231-Tanaka，et.al.
U.S Patent No 2003/0069186 A1-Burnett，Jr.，et.al.
U.S Patent No.6,492,560 B2-Wilbur et.al.
U.S Patent No 6,013,630-Shimkets，et.al.
U.S Patent No.6,586,396-Seilhamer，et.al.
U.S.Patent No.6,525,022-Lowe，et.al.
U.S.Patent No.6,028,055-Lowe，et al.
U.S.Patent No 5,114,923-Seilhamer et.al.
PCTIUS021756權(quán)利要求
1.促尿鈉排泄化合物軛合物，包括具有生物學活性的促尿鈉排泄化合物，其包括促尿鈉排泄分子NPR-A結(jié)合位點；以及至少一個修飾部分軛合位點；以及與所述修飾部分軛合位點連接的至少一個修飾部分；其中所述促尿鈉排泄化合物軛合物表現(xiàn)出了選自如下的一或者多種優(yōu)點與對應的未軛合促尿鈉排泄化合物相比對酶降解增強的抗性、延長的循環(huán)半衰期，提高的生物利用率以及延長的持續(xù)藥效。
2.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物含有腦促尿鈉排泄肽，心房促尿鈉排泄肽，C-型促尿鈉排泄肽或樹眼鏡蛇促尿鈉排泄肽的肽或者生物學活性肽片段。
3.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物含有天然hBNP序列，該序列具有選自Lys3Arg，Lys14Arg，Arg30Lys，Lys27Arg和Arg31Lys的一或多處突變。
4.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物含有天然hBNP序列，該序列具有一或多處插入、缺失或延伸。
5.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式 其中每個C都是獨立選擇的并且是具有m個碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且每個PAG都是獨立選擇的并且是具有n個亞單位的聚烷撐二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每個X都是獨立選擇的并且是連接部分。
6.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
7.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
8.治療以細胞外液水平過高為特征的病癥的方法，所述方法包括給需要治療的受試者施用藥物可接受量的權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物。
9.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
10.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
11.權(quán)利要求1的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
12.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式
13.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述修飾部分具有下列通式 且所述促尿鈉排泄化合物是hBNP，且所述修飾部分連接在Lys3位，且所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。
14.權(quán)利要求9的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP。
15.權(quán)利要求10的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP。
16.權(quán)利要求11的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP。
17.權(quán)利要求12的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP。
18.權(quán)利要求9的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP，且所述修飾部分連接在Lys3位，且所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。
19.權(quán)利要求10的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP，且所述修飾部分連接在Lys3位，且所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。
20.權(quán)利要求11的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP，且所述修飾部分連接在Lys3位，且所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。
21.權(quán)利要求12的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中所述促尿鈉排泄化合物是hBNP，且所述修飾部分連接在Lys3位，且所述促尿鈉排泄化合物軛合物是單軛合物。
22.包含權(quán)利要求9的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
23.包含權(quán)利要求10的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
24.包含權(quán)利要求11的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
25.包含權(quán)利要求12的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
26.包含權(quán)利要求14的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
27.包含權(quán)利要求15的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
28.包含權(quán)利要求16的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
29.包含權(quán)利要求17的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
30.包含權(quán)利要求18的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
31.包含權(quán)利要求19的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
32.包含權(quán)利要求20的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
33.包含權(quán)利要求21的促尿鈉排泄化合物軛合物和可藥用載體的藥物組合物。
34.制備權(quán)利要求9所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
35.制備權(quán)利要求10所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
36.制備權(quán)利要求11所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
37.制備權(quán)利要求12所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
38.制備權(quán)利要求14所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
39.制備權(quán)利要求15所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
40.制備權(quán)利要求16所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
41.制備權(quán)利要求17所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
42.制備權(quán)利要求18所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
43.制備權(quán)利要求19所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
44.制備權(quán)利要求20所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
45.制備權(quán)利要求21所述促尿鈉排泄化合物軛合物的方法，該方法包括將所述修飾部分化學連接于所述促尿鈉排泄化合物。
46.權(quán)利要求9所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
47.權(quán)利要求10所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
48.權(quán)利要求11所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
49.權(quán)利要求12所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
50.權(quán)利要求14所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
51.權(quán)利要求15所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
52.權(quán)利要求16所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
53.權(quán)利要求17所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
54.權(quán)利要求18所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
55.權(quán)利要求19所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
56.權(quán)利要求20所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
57.權(quán)利要求21所述促尿鈉排泄化合物軛合物的藥物純組合物。
58.權(quán)利要求5的促尿鈉排泄化合物軛合物，其中m是1，X是-O-，n是4，且C是-CH3。
全文摘要
本發(fā)明公開了修飾的促尿鈉排泄化合物及其軛合物。尤其是，本發(fā)明提供了hBNP的軛合形式，且其包括至少一種與其相連的修飾部分。所述修飾的促尿鈉排泄化合物保留了刺激cGMP產(chǎn)生、結(jié)合于NPR－A受體的活性；在一些實施方案中，與未修飾的對應促尿鈉排泄化合物相比，本發(fā)明所公開的促尿鈉排泄化合物在循環(huán)中具有改善的半衰期?？蓪⑺龌衔锖蛙椇衔锏目诜⒛c胃外、經(jīng)腸、皮下、經(jīng)肺和靜脈內(nèi)形式制備成適于心臟疾病尤其是充血性心力衰竭的治療劑和/或治療方法。本發(fā)明還公開了含有具有不同長度和構(gòu)象的寡聚結(jié)構(gòu)的修飾部分。本發(fā)明還公開了促尿鈉排泄化合物的類似物，其具有不同于天然序列的氨基酸序列。
文檔編號G01N33/574GK101027073SQ200580025222
公開日2007年8月29日 申請日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者肯尼斯·D·詹姆斯, 伯勒辛加姆·拉達克里希南, 納瓦迪普·B·馬爾卡, 馬克·A·米勒, 瑙奇瑞·N·?？宋秩鸩?申請人:比奧孔有限公司