識別釋放包含活性劑的納米多孔基材、它們的制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及多孔基材，包括它們的制備方法以及其在安全有效施用活性劑和診斷 中的用途，所述多孔基材在孔內(nèi)嵌入至少一種活性劑，所述孔被用能夠在與分析物締合并 形成易于切割的構象后控制所述試劑的釋放的核苷酸序列加帽。 現(xiàn)有技術
[0002] 作為背景被視為本發(fā)明公開的主題相關的參考文獻列出如下：
[0003]1.Zhang等人ACSNano, 7 (10)，8455-8468 (2〇13)
[0004] 2.Zhang等人J.Am.Chem.Soc. 135, 1934-1940 (2013)
[0005] 3.Yang,Q. ；ffang,S. ；Fan,P. ；ffang,L. ；Di,Y. ；Lin,K. ；Xiao,F. -S.Chem. Mater. 2005, 17, 5999-6003.
[0006] 4.Gao,Q. ;Xu，Y. ;Wu，D. ;Shen，W. ;Deng，F(xiàn).Langmuir2010, 26, 17133-17138.
[0007] 5.Zheng，H. ;Wang，Y. ;Che，S.J.Phys.Chem.C2011，115, 16803-16813.
[0008] 6.Liu,N. ；Dunphy,D.R. ；Atanassov,P. ；Bunge,S.D. ；Chen,Z. ；Lopez,G.P.； Boyle,T.J. ；Brinker,C.J.NanoLett. 2004, 4, 551-554.
[0009] 7 .Aznar,E. ；Casasus,R.；Garcia-Acosta,B. ；Marcos,M.D.； Mar-tinez-Manez，R. ;Sancenon，F(xiàn). ;Soto,J. ;Amoros，P.Adv.Mater. 2007, 19, 2228-2231.
[0010] 8.Liu,R. ；Zhao,X. ；ffu,T. ；Feng,P.J.Am.Chem.Soc. 2008, 130, 14418-14419.
[0011] 9.Luo,Z. ；Cai,K. ；Hu,Y. ；Zhao,L. ；Liu,P. ；Duan,L. ；Yang,ff.Angew.Chem.Int. Ed. 2011，50, 640-643.
[0012] 10.Wan,X. ；ffang,D. ；Liu,S.Langmuir2010, 26, 15574-15579.
[0013] 11.Yu,A. ；ffang,Y. ；Barlow,E. ；Caruso,F.Adv.Mater. 2005, 17, 1737-1741.
[0014] 12.Park，C. ;Kim，H. ;Kim，S. ;Kim，C.J.AmChem.Soc. 2009, 131，16614-16615.
[0015] 13.Lei,C. ；Shin,Y. ；Liu,J. ；Ackerman,E.J.J.Am.Chem. Soc. 2002, 124, 11242-11243.
[0016] 14.Takahashi,H. ；Li,B. ；Sasaki,T. ；Miyazaki,C. ；Kajino,T. ；Inagaki,S. Chem.Mater. 2000, 12, 3301-3305.
[0017] 15.Nguyen，T.D. ;Tseng，H.-R. ;Celestre，P.C. ;Flood，A.H. ;Liu，Y.; Stoddart,J.F. ；Zink,J.I.Proc.Natl.Acad.Sci.C2005, 102, 10029-10034.
[0018] 16.Nguyen,T.D. ；Liu,Y. ；Saha,S. ；Leung,K.C.-F. ；Stoddart,J.F. ；Zink,J. I.J.Am.Chem.Soc. 2007, 129, 626-634.
[0019] 17.Li,D. ；ffieckowska,A. ；ffillner,I.Angew.Chem.Int.Ed. 2008, 47, 3927-3931.
[0020] 18.Miyake,Y. ；Togashi,H. ；Tashiro,M. ；Yamaguchi,H. ；0da,S. ；Kudo,M.； Tanaka,Y. ；Kondo,Y. ；Sawa,R. ；Fujimoto,T. ;Machina_mi，T. ；0no,A.J.Am.Chem. Soc. 2006, 128, 2172-2173.
[0021] 19.Ono,A. ;Togashi，H.Angew.Chem.Int.Ed. 2004, 43, 4300-4302.
[0022] 20.Freeman,R. ；Finder,T. ；ffillner,I.Angew.Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7818-7821.
[0023] 21.Huang,ff.T.；Shi,Y. ；Xie,ff.Y. ；Luo,H.Q.；Li,N.B.Chem. Commun. 2011，47, 7800-7802.
[0024] 22.Wang,Z. -G. ；Elbaz,J. ；Remacle,F. ；Levine,R.D. ；ffillner,I.Proc.Natl. Acad.Sci.USA2010, 107, 21996-22001.
[0025] 23.Liu,J. ；Cao,Z. ；Lu,Y.Chem.Rev. 2009, 109, 1948-1998.
[0026] 24.Tombelli,S. ；Minunni,M. ；Mascini,M.Biosens. Bioelectron. 2005, 20, 2424-2434.
[0027] 25.ffillner,I. ；Zayats,M.Angew.Chem.Int.Ed. 2007, 46, 6408-6418.
[0028] 26 .Li,D. ；Shlyahovsky,B. ；E1baz,J. ；ffillner,I.J.Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5804-5805.
[0029] 27.Niazov,T. ；Pav1ov,V. ；Xiao,Y. ；Gi11,R. ；ffillner,I.Nano Lett. 2004, 4, 1683-1687.
[0030] 28. Liu，J. ;Lu，Y. J.Am.Chem.Soc. 2004, 126, 12298-12305.
[0031] 29. Liu，J. ;Lu，Y. J.Am.Chem.Soc. 2007, 129, 9838-9839.
[0032] 30.Dittmer,ff.U.；Reuter,A. ；Simmel,F.C.Angew.Chem.Int. Ed. 2004, 43, 3550-3553.
[0033] 31.Shlyahovsky,B. ；Li,D. ；ffeizmann,Y. ；Nowarski,R. ；Kotler,M. ；ffillner,I. J.Am.Chem.Soc. 2007, 129, 3814-3815.
[0034] 32.Liu，Y. ;Lin，C. ;Li，H. ;Yan，H.Angew.Chem.Int.Ed. 2005, 44, 4333-4338.
[0035] 3 3.Kang,H. ;0'Donoghue，M.B. ；Liu,H. ；Tan,ff.Chem. Com-mun. 2010, 46, 249-251.
[0036] 34. Liu, J. ；Lee,J.H. ；Lu,Y.Anal.Chem. 2007, 79, 4120-4125.
[0037] 35. Seelig,G. ；So1oveichik,D. ；Zhang,D.Y. ；ffinfree,E.Science 2006, 314, 1585-1588.
[0038] 36.Elbaz,J. ；Lioubashevski, 0. ；ffang,F. ；Remacle,F. ；Levine,R.D.； Willner，I.NatureNanotech. 2010, 5, 417-422.
[0039] 37.Winfree，E.Qian，L.Science2011，332, 1196-1201.
[0040] 38.Chen，C. ;Pu，F(xiàn). ;Huang，Z. ;Liu，Z. ;Ren，J. ;Qu，X.NucleicAcids Res. 2011，39, 1638-1644.
[0041] 3 9.He,D. ；He,X. ；ffang,K. ；Cao,J. ；Zhao,Y.Adv.Funct. Mater. 2012,D01:10. 1002/adfm. 201201343
[0042] 40.Zhang,Y. ；Yuan,Q. ；Chen,T. ；Zhang,X. ；Chen,Y. ；Tan,ff.Anal. Chem. 2012, 84, 1956-1962
[0043] 本文中上述參考文獻的承認不應被推斷為意指這些以任何方式與本發(fā)明公開的 主題的專利性相關。
[0044] 背景
[0045] 介孔二氧化硅（Si-MP)是允許在孔中包封底物的多孔結構，且它的表面可進行化 學修飾。應用這些性質(zhì)使用Si-MP作為用于催化、藥物遞送和成像的多用途的混合材料。此 外，Si-MP的化學修飾使得能夠設計用于從基質(zhì)的孔控釋底物的信號響應基質(zhì)。
[0046] 實施不同的刺激，諸如pH[2_5]光子信號[6, 7]、氧化還原試劑[8-10]或酶 [11-14]觸發(fā)孔的開口，導致包封的底物的控釋。因此，Si-MP的孔加帽了閘門單元，該閘門 單元將底物鎖定在孔中，并允許響應刺激解鎖閘門和釋放底物。例如，實施半輪烷孔加帽的 納米結構的光子拆解（dethreading)以打開孔并釋放存儲的底物[15, 16]。
[0047] 在核酸的堿基序列中編碼的信息提供了發(fā)展DNA納米技術領域的機會的豐富的 舞臺。實施序列引導的和pH刺激的單鏈DNA向i-基序（i-motif)的組裝或經(jīng)由金屬離 子（例如通過T-Hg2+-T橋）的DNA雙鏈體的協(xié)同結合以發(fā)展不同的DNA機器[17-19]并發(fā) 展邏輯閘門[20, 21]和有限狀態(tài)邏輯機器[22]。類似地，序列特異性核酸鏈揭示對低分子 量底物或高分子底物（適體）的特異性結合特性[23-25]或表現(xiàn)出催化性能（DNA核酶） [26-29]。適體已被實施以開發(fā)DNA機器[30, 31]或組裝程控的納米結構，[32-34]且催化 的核酸被用于開發(fā)邏輯閘門和邏輯閘門級聯(lián)[35-37]。
[0048] 核酸至介孔Si02的綴合使得能夠實現(xiàn)DNA"鎖定"和"解鎖"SiO2的孔的信號觸 發(fā)的功能。例如，孔負載了染料底物，并通過i_基序、C-四重體、加帽單元被"鎖定"，且隨 后通過在中性pH值下分離龐大的i-基序結構為隨機單鏈而被"解鎖"，從而允許釋放底物 [38]。在相關的系統(tǒng)中，pH的變化和孔的打開通過光化學過程來刺激[39]。可選擇地，介 孔Si02的孔用雙鏈體DNA單元加帽，且加帽鏈通過在Hg2+離子的存在下的鏈置換過程被分 離，以產(chǎn)生增強的穩(wěn)定性的T-Hg2+-T橋接雙鏈體結構?？捉亓舻牡孜锏尼尫牛篃晒鈾z測 Hg2+離子成為可能[40]。
[0049] 如果任何人可設計其中生物催化過程由特別感興趣的分析物或生物標志物的主 感應（primarysensing)或識別事件激活以確保至特定位點的安全并有效的藥物遞送的門 控系統(tǒng)將是重大的進步。
[0050] 概述
[0051] 在它的第一個方面，本發(fā)明提供了多孔基材，所述多孔基材包含被截留在所述基 材的所述孔內(nèi)的至少一種活性劑；其中當所述至少一種活性劑被截留在所述孔中時，所述 孔（即孔開口）被具有鎖定構象的至少一種核酸序列加帽；所述加帽核酸序列能夠在與至 少一種第一分析物締合后形成易于切割的構象；從而使所述加帽核酸序列能夠被切割并允 許釋放所述嵌入的至少一種活性劑。
[0052] 當提及多孔基材時，應該理解為包括支撐常規(guī)多孔結構的任何納米多孔材料（是 有機的、金屬、半金屬或無機的，天然的或人工的）框架?？椎某叽缤ǔ?〇〇納米或更小。 所述基材可呈任何可用的形式，包括納米顆粒、薄膜、膜等等。多孔基材的非限制性實例包 括活性炭、沸石、二氧化硅、氧化鋯、氧化鋁及其任何組合。所述多孔基材可為微孔材料（具 有介于約0. 2-2nm之間的孔徑）、介孔材料（具有介于約2-50nm之間的孔徑）或大孔材料 (具有介于約50-1000nm之間的孔徑）或其任何組合。
[0053] 所述基材的孔在它們內(nèi)截留至少一種活性劑，從而在所述孔內(nèi)嵌入所述至少一種 活性劑。為了在所述孔內(nèi)截留并鎖定（即維持和保持）所述至少一種活性劑，所述孔開口 (即，所述孔外部暴露于周圍環(huán)境的一部分）被至少一種核酸序列加帽。所述加帽通過孔開 口的化學修飾而促成，即在孔開口處將所述至少一種核酸序列化學鍵合至所述多孔材料。
[0054] 加帽核酸序列（本文中還稱為加帽序列或加帽核酸序列）具有這樣的構象（本文 中稱為鎖定構像），所述構象使所述至少一種活性劑截留在所述孔中成為可能，從而允許所 述至少一種活性劑保持在所述孔內(nèi)而不滲漏至所述基材的周圍環(huán)境。所述加帽核酸序列是 包含形成具有以下構象的大分子的至少5個核苷酸的生物抗性序列：在與至少一種第一分 析物締合之前能夠加帽它所附著至的孔洞并且防止所述至少一種活性劑擴散出所述基材 的孔并將所述活性劑鎖定在所述孔內(nèi)的構象。
[0055] 在所述加帽核酸序列與至少一種第一分析物締合后，所述加帽序列能夠形成易 于切割的構象，即不同于鎖定構象的構象，其中所述加帽序列可用于切割（在一些實施方 案中，構象至易于切割構象的所述變化允許所述序列水合、所述序列被生物催化劑切割等 等）。僅當加帽序列形成時，所述易于切割構象是序列可能的會話（例如通過將核苷酸從其 序列暴露于生物催化劑）。加帽序列的切割使所述序列通過由所述生物催化劑破壞加帽序 列中的至少一個化學鍵而從孔開口分離。在切割加帽序列后，被截留在基材的所述孔內(nèi)的 所述至少一種活性劑被釋放至所述基材的直接周圍環(huán)境。
[0056] 在一些實施方案中，所述孔由至少兩種獨立的核酸序列加帽。
[0057] 在其他實施方案中，所述加帽核酸序列是或單鏈的或雙鏈的。
[0058] 在一些另外的實施方案中，所述加帽核酸序列包含DNA核酶序列。DNA核酶序列 (還稱為脫氧核酶、DNA酶或催化的DNA)是具有進行化學反應，諸如由與金屬離子締合觸發(fā) 的催化作用，的能力的DNA分子。因此，在一些實施方案中，所述加帽序列的所述切割由所 述DNA核酶加帽序列本身促成。因此，在切割所述DNA核酶序列后，靶至少一個第一分析物 的再生形成，觸發(fā)所述活性劑的釋放。因此，所述試劑從基材的釋放通過甚至小量的分析物 (生物標志物）的存在來實現(xiàn)，使得本發(fā)明的所述基材對反映所述生物標志物的存在的條 件敏感。
[0059] 在一些另外的實施方案中，所述DNA核酶序列被擴展有異質(zhì)（另外的）核苷酸結 構域（具有至少5個更多個核苷酸），所述異質(zhì)核苷酸結構域具有游離構象（即不包含任何 化合物或不與任何化合物締合的構象）和在所述異質(zhì)區(qū)域與至少一個第二分析物（其可與 第一分析物相同或不同）締合后實現(xiàn)的活性構象；所述異質(zhì)或另外的核苷酸結構域可以是 適體結合序列或離子結合序列，因此在所述另外的結構域與至少一種適體或至少一種離子 締合后，DNA核酶序列的構象變構地改變。僅在達到所述活性構象后，在與所述至少一種第 一分析物締合后，整個所述DNA核酶序列能夠形成易于切割的構象，從而促使切割所述加 帽核酸序列，并允許釋放所述嵌入的至少一種活性劑。
[0060] 在其他實施方案中，所述加帽核酸序列包含RNA核酶序列。
[0061] 在其他實施方案中，所述加帽至少一種核酸序列是發(fā)卡環(huán)序列。所述發(fā)卡環(huán)（或 莖-環(huán)分子內(nèi)堿基配對）是可發(fā)生在單鏈DNA或RNA序列中的模式。當同一鏈的通常以相 反方向閱讀時核苷酸序列互補的兩個區(qū)域堿基配對以形成結束于未配對的環(huán)的雙螺旋時， 發(fā)卡環(huán)結構或構象出現(xiàn)。
[0062] 在一些實施方案中，所述至少兩種獨立的加帽核酸序列是至少兩種獨立的發(fā)卡環(huán) 序列（其可相同或不同）。
[0063] 在一些實施方案中，具有至少一種核酸發(fā)卡環(huán)序列的加帽序列在與至少一種第一 分析物偶聯(lián)締合后形成易于切割的構象，所述至少一種分析物是具有互補序列從而形成雙 鏈的核酸鏈。
[0064] 在一些實施方案中，所述加帽序列選自以下非限制性列表：
[0065] (1) 5 ' -SH(CH2)6CAACAACATrAGGACATAGAAGAAGAAG-3 '（SEQ.NO. 1)
[0066] (4)5, -CTTCTTCTTCTATGTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATGTTGTT