外周血exosome來源的肝癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及人類外周血exosome來源的肝癌診斷和預(yù)后標(biāo)志 物及其應(yīng)用；具體涉及人類血液exosome來源的Rab27A/B蛋白作為肝癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物 及其在制備診斷肝癌和判斷肝癌預(yù)后試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌（HCC)是世界范圍內(nèi)前十名常見腫瘤，有非常高的死亡率，每年大約 有一百萬人死于這種疾病。找到與原發(fā)性肝癌進(jìn)展有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)而指導(dǎo)臨床對肝 癌患者來說將有非常重要的意義。
[0003] exosome是多種細(xì)胞分泌的一種30-100nm大小的膜性囊狀結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞較正 常細(xì)胞能分泌更多的exosome，分泌到細(xì)胞外的exosome攜帶有大量腫瘤特異的抗原蛋 白、抗原伴侶分子和核酸，通過exosome中的蛋白質(zhì)和核酸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間信息交流， 產(chǎn)生旁路效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Rabinowits等發(fā)現(xiàn)肺癌病人外周血中exosome平 均蛋白濃度達(dá)到2.8511^/1111(95%(：1 1.94-3.76)，而非腫瘤病人只有0.7711^/1111(95%(：1 0.68-0. 86)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肺癌病人（P〈0. 001);從exosome蛋白濃度95%的區(qū)間來看，肺癌病 人和非肺癌病人的區(qū)間無重疊。因此，外周血中exosome蛋白濃度有可能作為肺癌診斷的 標(biāo)志物。申請人所在課題組前期研宄也發(fā)現(xiàn)從卵巢癌腹水中分離得到的exosome含有大量 腫瘤-睪丸抗原和免疫分子，國內(nèi)外學(xué)者利用exosome中的腫瘤抗原蛋白制作exosome亞 細(xì)胞瘤苗，在體外和動物實(shí)驗(yàn)以及部分人體實(shí)驗(yàn)都取得了好的效果。腫瘤分泌的exosome 較腫瘤細(xì)胞更易進(jìn)入外周血，即使在腦膠母細(xì)胞腫瘤，納米級的exosome也能透過致密的 血腦屏障進(jìn)入外周血，并通過外周血exosome中EGFRvIII基因突變的檢測來明確膠母細(xì)胞 腫瘤的診斷和治療；此外，腫瘤細(xì)胞分泌exosome的能力較正常細(xì)胞更強(qiáng)，exosome中的核 酸和蛋白質(zhì)受到雙層脂質(zhì)膜的保護(hù)不易被血中的蛋白酶和核酸酶降解；所有上述因素都是 利用外周血exosome作為腫瘤早期診斷的最佳理由。在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌，國外 學(xué)者利用外周血exosome中存在較高的腫瘤相關(guān)抗原蛋白來進(jìn)行早期診斷。
[0004] Rab家族屬Ras超家族的小GTP酶，目前有近70個家族成員，是參與囊泡融合及運(yùn) 輸相關(guān)的一類膜相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞的分泌、胞吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，是細(xì)胞內(nèi)外信息交流的重 要調(diào)控蛋白。1^匕274和1^匕278組成了1^匕27亞家族，并具有71%同源性。上述兩種蛋白在 exosome運(yùn)輸（Trafficking)、與細(xì)胞膜對接（docking)、融合（fuse)和胞吐（exocytosis) 上所起作用最突出。Rab27A蛋白在肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的高表達(dá)與這些腫瘤侵襲 和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。但，有關(guān)Rab27B的研宄較少，Hendrix等的研宄表明： 人體胚胎各個器官細(xì)胞均無Rab27B表達(dá)，而成熟的器官各個細(xì)胞均有表達(dá)。申請人所在課 題組前期對正常肝組織、肝炎組織、肝硬化組織的、正常胃和大腸組織Rab27B蛋白表達(dá)進(jìn) 行了檢測，發(fā)現(xiàn)上述組織均存在Rab27B蛋白表達(dá)，然而，其對應(yīng)的腫瘤組織卻不同程度的 丟失。因此，Rab27B蛋白可能是一種與細(xì)胞分化相關(guān)的蛋白，由于腫瘤細(xì)胞的去分化而發(fā) 生丟失。
[0005] 目前，肝癌的診斷主要依賴于影像學(xué)上發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)腫物，包括超聲、CT、核磁共振 (MRI)等，同時結(jié)合血清中的腫瘤標(biāo)志物如AFP等。但是，這兩種方法的敏感性及特異性都 不是十分令人滿意。因此開發(fā)一種高敏感性和特異性的肝癌診斷方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種外周血exosome來源的肝 癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物，所述標(biāo)志物是exosome來源的Rab27A和/或Rab27B。本發(fā)明提供的 標(biāo)志物來源于人類外周血exosome，由于exosome具有選擇性富集癌蛋白的作用，且受細(xì)胞 膜的保護(hù)，在細(xì)胞間隙和外周血中不易被降解，因此本發(fā)明的標(biāo)志物用于肝癌的診斷和預(yù) 后敏感性更強(qiáng)。同時由于Rab27A和Rab27B在不同組織的表達(dá)模式存在明顯的差異，反映 了其組織特異性，因此本發(fā)明的標(biāo)志物用于肝癌的診斷和預(yù)后特異性更強(qiáng)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種外周血exosome來源的肝癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物，所述標(biāo)志物 是exsome來源的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白。Rab27A和Rab27B兩蛋白在肝癌患者血 液exosome中表達(dá)相反的特點(diǎn)，將Rab27A/Rab27B比值作為肝癌早期診斷的指標(biāo)比單獨(dú)使 用一種蛋白作為診斷指標(biāo)的診斷率更高。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述標(biāo)志物的檢測試劑。所述試劑包括Rab27A蛋白的單克隆抗 體和/或Rab27B蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述Rab27A蛋白的單克隆抗體購自Abeam 公司，貨號為ab55667 ;所述Rab27B蛋白的單克隆抗體購自ProteintechGroup，貨號為 13412-1-AP。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述標(biāo)志物在制備診斷人類肝癌的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑 盒包括Rab27A蛋白的單克隆抗體和Rab27A蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27A蛋白含量來判斷受試者是否患有肝癌?？蛇x地，所述診斷試劑盒 還可包括Rab27B蛋白的單克隆抗體和Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血 exosome來源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的含量來判斷受試者是否患有肝癌。
[0011] 作為一種可替代的實(shí)施方案，所述診斷試劑盒包括Rab27B蛋白的單克隆抗體和 Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27B蛋白含量來判 斷受試者是否患有肝癌。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述標(biāo)志物在制備判斷肝癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑 盒包括Rab27A蛋白的單克隆抗體和Rab27A蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血 exosome來源的Rab27A蛋白含量來判斷肝癌患者的預(yù)后效果?？蛇x地，所述試劑盒還可包 括Rab27B蛋白的單克隆抗體和Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome 來源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量來判斷肝癌患者的預(yù)后效果。
[0013] 作為一種可替代的實(shí)施方案，所述試劑盒包括Rab27B蛋白的單克隆抗體和 Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27B蛋白含量來判 斷肝癌患者的預(yù)后效果。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種診斷人類肝癌的試劑盒，所述試劑盒包括Rab27A蛋白的單 克隆抗體和Rab27A蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27A蛋 白含量來判斷受試者是否患有肝癌?？蛇x地，所述試劑盒還可包括Rab27B蛋白的單克隆 抗體和Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量來判斷受試者是否患有肝癌。
[0015] 作為一種可替代的實(shí)施方案，所述診斷試劑盒包括Rab27B蛋白的單克隆抗體和 Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27B蛋白含量來判 斷受試者是否患有肝癌。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種判斷肝癌患者預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包括Rab27A蛋白 的單克隆抗體和Rab27A蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27A 蛋白含量來判斷肝癌患者的預(yù)后效果?？蛇x地，所述試劑盒還可包括Rab27B蛋白的單克隆 抗體和Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27A蛋白和 Rab27B蛋白含量來判斷肝癌患者的預(yù)后效果。
[0017] 作為一種可替代的實(shí)施方案，所述試劑盒包括Rab27B蛋白的單克隆抗體和 Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。該試劑盒通過檢測人類外周血exosome來源的Rab27B蛋白含量來判 斷肝癌患者的預(yù)后效果。
[0018] 優(yōu)選地，診斷試劑盒和判斷預(yù)后試劑盒中Rab27A蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和Rab27B蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。
[0019] 優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑盒和判斷預(yù)后試劑盒還包括ELISA實(shí)驗(yàn)中常用的試 劑。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種診斷人類肝癌的方法，所述方法的具體操作步驟如下：
[0021] (1)分離并純化人類外周血中的exosome;
[0022] ⑵提取exosome中的蛋白；
[0023] (3)檢測Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量；
[0024] (4)將步驟（3)獲得的受試者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量與大部 分正常人相應(yīng)蛋白的含量相比，如果受試者Rab27A蛋白顯著升高，則診斷受試者為肝癌患 者；如果Rab27B蛋白顯著降低或無表達(dá)，則診斷受試者為肝癌患者。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種判斷肝癌患者預(yù)后的方法，所述方法的具體操作步驟如下：
[0026] (1)分離并純化人類外周血中的exosome;
[0027] ⑵提取exosome中的蛋白；
[0028] (3)檢測Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量；
[0029] (4)將步驟（3)獲得的受試者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量與大部分 正常人相應(yīng)蛋白的含量相比，如果受試者Rab27A蛋白顯著升高，則該肝癌患者的預(yù)后差； 如果Rab27B蛋白顯著降低或無表達(dá)，則該肝癌患者的預(yù)后差。
[0030] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，分離并純化人類外周血中的exosome的具體操作步 驟是：
[0031] (1)全血3000*g離心15min，移去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；
[0032] (2)取上層液體移入離心管，加入適量Exoquick試劑，4°C下反應(yīng)30min;優(yōu)選 250u1血清中加入63u1Exoquick試劑；
[0033] (3) 1500*g離心混合液 30min(exosome沉于管下）；
[0034] (4)吸出上清，離心1500*g5min吸出所有上清（不能震動離心管）；
[0035] (5)用250y1PBS溶解全部沉淀，-20 °C保存。
[0036] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，采用德國ExoQick試劑盒提取exosome蛋白，具體操 作步驟參見試劑盒說明書。
[0037] 可以用于本發(fā)明以檢測Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白含量的方法包括流式細(xì)胞 儀檢測法、ELISA檢測法、Westernblot法。
[0038] 使用流式細(xì)胞儀檢測Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量的具體操作步驟是： 取