高效篩選dna斷鏈損傷保護性藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥學方法領(lǐng)域，特別涉及藥物篩選，具體是指一種高效篩選DNA斷鏈 損傷保護性藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生命科學的迅速發(fā)展，人們不僅關(guān)注一些常見疾病的治療，更開始挖掘遺傳 疾病和衰老的秘密，期待從根本上排除隱患，抵抗衰老。DNA作為攜帶及傳遞遺傳信息的重 要生物分子，其完整性的保持成為生物科學的重點研宄領(lǐng)域，各種評價DNA損傷的技術(shù)不 斷進化，尋找高效安全的DNA保護性藥物的報道也日益增多。
[0003] 傳統(tǒng)的DNA評價技術(shù)如放射元素標記法，高效液相色譜-電化學測量法，氣質(zhì)聯(lián) 用法或高效毛細管電泳法等雖然靈敏度高，但是都存在儀器大型貴重，且需要專業(yè)人員護 理以及操作過程繁瑣的特點；早期被用來定量檢測細胞內(nèi)DNA單鏈斷裂的快速沉降技術(shù)、 堿性解旋和洗脫技術(shù)也因為檢測靈敏度低、安全性差和實驗周期長等原因難用于高效篩選 DNA保護性藥物；傳統(tǒng)的DNA保護藥物的研宄往往是在活體或細胞水平上，實驗周期較長、 對實驗設(shè)備有較高要求，體外的研宄排除雜質(zhì)對檢測的干擾并不簡便，因此每項研宄一般 只能考察少數(shù)幾種藥物的效果。
[0004] 現(xiàn)有專利中存在一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法，該方法如圖1、 2所示以鳥嗓呤被氧化后產(chǎn)生的8-輕基脫氧鳥苷（8-hydroxy-deoxyguanosine, 8-OH-dG) 為DNA氧化損傷標志物評價藥物保護作用，主要包括以下的步驟：1.共價鍵固定DNA在磁 性微球表面；2.加入中草藥溶液；體外染毒固定化的DNA;3.磁性分離氧化組分，保留氧化 損傷的DNA;4.加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產(chǎn)生的8-OH-dG發(fā)生免疫反應；5.加入酶標 第二抗體，與上述得到的產(chǎn)物反應；6.加入發(fā)光底物，高靈敏度化學發(fā)光法檢測DNA損傷產(chǎn) 生的8-OH-dG;7.檢測結(jié)果與對照組的檢測結(jié)果進行分析，若信號較對照組低則認為中草 藥具有抑制8-OH-dG產(chǎn)生的功能。其工作原理如圖1所示：
[0005] 由于此技術(shù)是以DNA的一種堿基損傷作為檢測指標的，故存在以下不足：第一點， 據(jù)文獻報道DNA受到氧自由基攻擊不僅產(chǎn)生包括8-OH-dG在內(nèi)的堿基損傷，其鏈狀結(jié)構(gòu)也 會發(fā)生斷裂，即斷鏈損傷。這即意味著在上述技術(shù)體系中實際是存在如下圖所示的反應情 況的，圖中所示的兩種情況實際產(chǎn)生的8-OH-dG是同樣多的，但由于同時發(fā)生了DNA斷鏈， 而照上述技術(shù)第3步，洗滌磁性微球?qū)⒈Ａ舻拇龣z測8-OH-dG與中草藥等雜質(zhì)分離，同時也 與已斷下來的部分DNA鏈分離，產(chǎn)生的8-OH-dG不確定是集中在斷掉部分還是保留部分，于 是即使是DNA上產(chǎn)生同樣多的8-OHdG，檢測到的信號卻可能相差很大，圖1中添加的中草藥 實際沒有抑制8-OH-dG的作用，信號卻顯示比對照組低很多，于是容易產(chǎn)生"假陽性"的結(jié) 果。第二點，此技術(shù)對DNA損傷的檢測需要兩步免疫反應，不夠簡便。
[0006] 所以一種降低假陽性結(jié)果的發(fā)生率的，簡便靈敏高效的篩選DNA斷鏈損傷保護性 藥物的方法是十分具有實用價值的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種可以降低假陽性結(jié) 果的發(fā)生率的，簡便靈敏高效的篩選DNA斷鏈損傷保護性藥物的方法。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種高效篩選DNA斷鏈損傷保護性藥物的方 法，其特征在于，包括以下步驟：
[0009] 步驟（1):將一端用熒光素FAM修飾另一端用氨基修飾的DNA通過共價鍵與磁性 微球表面固定，得到固定化DNA;
[0010] 步驟（2):向所述的固定化DNA中加入藥物的溶液，得到具有藥物的DNA;
[0011] 步驟⑶：將所述的具有藥物的DNA進行體外染毒，得到染毒DNA;
[0012] 步驟（4):將所述的染毒DNA進行磁性分離，分離掉染毒成分和反應雜質(zhì)，保留未 斷鏈DNA;
[0013] 步驟（5):向所述的未斷鏈DNA中加入酶標FAM抗體，所述的酶標FAM抗體與未斷 鏈DNA自由端的FAM發(fā)生免疫反應，得到免疫反應后的DNA;
[0014] 步驟（6):向所述的免疫反應后的DNA中加入發(fā)光底物后，采用高靈敏度化學發(fā)光 法檢測所述的免疫反應后的DNA，得到檢測信號；
[0015] 步驟（7):將所述的檢測信號與對照組信號進行對比，判斷所述的藥物是否保護 DNA〇
[0016] 較佳地，所述的步驟（1)具體包括以下步驟：
[0017] 步驟（1. 1):將磁性微球采用羧基修飾，取羧基修飾后的磁性微球用咪唑緩沖液 磁性分離法洗滌3次后，分散在溶有EDC的咪唑緩沖液中，37 °C恒溫振蕩20min，得到帶有磁 性微球的溶液；
[0018] 步驟（1. 2):向所述的帶有磁性微球的溶液中加入一端用熒光素FAM修飾另一 端用氨基修飾的DNA，繼續(xù)37°C恒溫振蕩60min后得到固定化DNA，用洗滌液洗滌三次后 使所述的固定化DNA分散在洗滌液中。每個篩選樣品占用羧基磁性微球的用量為lOOug， FAM-DNA的投料量為 1. 25-20pmol。
[0019] 較佳地，所述的藥物溶液通過濃度為lmg/ml的藥物儲備液采用含有0. 1 %吐溫的 PBS反應液溶液稀釋20倍后得到。
[0020] 較佳地，所述的體外染毒通過采用Fenton型產(chǎn)輕自由基體系、黃嗓呤/黃嗓呤酶 產(chǎn)超氧陰離子體系、次氯酸鈉/過氧化氫產(chǎn)單線態(tài)氧體系、體外模擬吸煙、石棉、氧化不飽 和脂肪酸、PM2. 5、化學致癌物或N-亞硝基-乙胺進行。
[0021] 更佳地，當體外染毒通過采用所述的Fenton型產(chǎn)羥自由基體系時，F(xiàn)e2+的濃度為 0.225 ?L8mM，F(xiàn)e2+/EDTA/H202的摩爾比為 1:3:60。
[0022] 更佳地，當體外染毒通過采用體外模擬吸煙時，為將含有所述的具有藥物的DNA 的氣體捕集器與自動吸煙機的煙道串聯(lián)，所述的自動吸煙機按聯(lián)邦貿(mào)易委員會協(xié)議標準吸 煙。吸煙主流煙霧即通過氣體捕集器擴散入捕集液（即固定化DNA分散液，含有0. 5%吐溫 的PBS)中，使得壽命更短的R0S也被捕獲。
[0023] 較佳地，所述的步驟（4)中，磁性分離掉染毒成分和反應雜質(zhì)后，在未斷鏈DNA中 加入0. 02%BSA封閉液封閉，所述的封閉液用PBS配置。
[0024] 較佳地，所述的酶標FAM抗體為HRP標記的兔抗體。
[0025] 更佳地，所述的HRP標記的兔抗體的稀釋倍數(shù)為10000倍。
[0026] 較佳地，所述的步驟5具體包括以下步驟：
[0027] 步驟（5. 1):向所述的未斷鏈DNA中加入酶標FAM抗體后在37°C時置于恒溫振蕩 器中反應，反應后使用洗滌液洗滌。恒溫振蕩器中反應與FAM-DNA特異性結(jié)合，通過HRR 催化的魯米諾與過氧化氫反應產(chǎn)生的發(fā)光信號強度表征結(jié)合在磁性微球表面未斷鏈的 FAM-DNA的量，間接檢測DNA斷鏈的量。
[0028] 采用了本發(fā)明的高效篩選DNA斷鏈損傷保護性藥物的方法，將DNA保護性藥物的 篩選過程大大簡化，并可應用于復雜化合物的篩選，意味著可以從我國豐富的藥物來源如 中草藥、植物提取物等資源中篩選高效安全的藥物制劑。技術(shù)的實施對環(huán)境污染物的遺傳 毒性評價、新藥研發(fā)以及遺傳疾病的早期診治提供有力支撐。
【附圖說明】
[0029] 圖1是現(xiàn)有發(fā)明的檢測流程圖。
[0030] 圖2是現(xiàn)有發(fā)明的檢測原理圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明的實施例的檢測原理圖。
[0032] 圖4是本發(fā)明的實施例的DNA投料量對表征未斷鏈DNA的化學發(fā)光強度的影響圖 表。
[0033] 圖5為本發(fā)明的實施例的Fenton試劑的濃度對表征未斷鏈DNA的化學發(fā)光強度 的影響圖表。
[0034] 圖6為本發(fā)明的實施例的10種藥物篩選例圖。
【具體實施方式】
[0035] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方 法作進一步說明。
[0036] 實施例1Fenton試劑致DNA斷鏈損傷的檢測
[0037]1. 1試劑與儀器
[0038] 所有試劑均為分析純。N-(3_二甲基氨丙基）_N'_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)購 于Sigma公司；HRP標記的兔抗FAM來自Invitrogen.Molecularprobe;HRPCL試劑盒購自 Milipore公司；BioMag?Plus羧基化磁性微球（MB，1. 5ym，20mg/mL)購于Polyscience 公司；BSA購自華美生物技術(shù)公司；DNA(5' -FAM-AAAGGGGAAA-NH2-3')購自上海生工生 物技術(shù)有限公司；Fenton試劑：(NH4)2Fe(S04) 2與EDTA每日按1:3摩爾比配成新鮮水溶液 原液，用前稀釋，30%的H202溶液儲存于冰箱冷藏層避光，用前稀釋。
[0039] 試驗用超純水由Milli-XQ儀器制備，所有溶液由超純水配制。0. 1M的咪唑緩沖 液，pH 6.0 ;0. 1M的PBS溶液，pH7.4;洗滌液的為含有0. 1 %吐溫20的PBS，也用于DNA染 毒及藥物篩選步驟；封閉液為含0. 02%BSA的PBS。
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