miR-30c-5p在制備藥物性肝損傷生物標(biāo)志物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種微小RNA(microRNA)在制備藥物性肝 損傷生物標(biāo)志物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于藥物及其代謝產(chǎn)物的毒性作用或機(jī)體對(duì)藥物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)從而對(duì)肝臟造成 損傷，即為藥物性肝損傷化rug-induced 1 iver in jury，DILI)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，藥物 性肝損傷已上升至全球死亡原因的第5位。近年來(lái)隨著中草藥廣泛被全世界所認(rèn)識(shí)，由中草 藥誘導(dǎo)肝損傷的報(bào)道日益增多，引起了全世界的廣泛關(guān)注。
[0003] 黃藥子為馨葫科植物黃獨(dú)(Dioscorea bu化ifera L.)的塊莖，為臨床常用中藥。 其藥用歷史悠久，歷代本草均有記載，具有散結(jié)消瘦、清熱解毒、涼血降火之功效。黃藥子在 臨床上主要用于治療甲狀腺腫、胃癌、甲狀腺瘤、肺癌、乳腺癌、子宮肌瘤、惡性淋己瘤等多 種癌癥，具有良好的抗腫瘤活性。然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)黃藥子存在明顯的藥物不良反應(yīng)，對(duì)肝、 腎等都有一定的損害，尤其是肝損傷報(bào)道較多，從而大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。黃藥子 的主要有效成分為其所含的二祗內(nèi)醋類和醬體皂巧類化合物，現(xiàn)代毒理研究證明，黃藥子 的二祗內(nèi)醋類成分黃藥子甲素、乙素、丙素，為主要肝毒性成分，其中二祗內(nèi)醋類成分黃獨(dú) 素郵P黃獨(dú)素乙素已被發(fā)現(xiàn)是其所含的主要肝毒性成分。
[0004] 生物標(biāo)志物(Biomarker)是指可W標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功 能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標(biāo)，具有非常廣泛的用途。生物標(biāo)志物可用于疾病診 斷、判斷疾病分期或者用來(lái)評(píng)價(jià)新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性及有效性。盡管與肝 臟毒性相關(guān)的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等 已經(jīng)應(yīng)用近50年之久，但是由于其在靈敏度和特異性方面存諸多局限，已無(wú)法滿足當(dāng)前對(duì) 藥物誘導(dǎo)肝毒性的評(píng)價(jià)要求。因此，尋找和驗(yàn)證新的高靈敏度和高特異性的肝毒性生物標(biāo) 志物已成為國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，也是藥物性肝損傷研究領(lǐng)域亟待解決的難點(diǎn)之 〇
[000引 miRNA(microRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼單鏈小分子RNA，約22個(gè)核巧酸長(zhǎng)度，通 過(guò)識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA，與勒ImRNA的3'非翻譯區(qū)（3' -unhanslated region，3' -UTR)互補(bǔ) 配對(duì)，進(jìn)行蛋白翻譯抑制或降解mRNA"miRNA廣泛參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的代謝、增殖、 分化和調(diào)亡，參與了肝損傷、腫瘤形成、屯、血管疾病等多種病理過(guò)程。因此，正常機(jī)體內(nèi) miRNA的變化也指示著機(jī)體正常生理功能的改變，乃至病變的發(fā)生。已有700多種miRNA被發(fā) 現(xiàn)，收載于miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，目前miRNA已成為生命科學(xué)界研究的熱點(diǎn)。已有研究人員對(duì)腫 瘤、屯、腦血管疾病等多種病癥進(jìn)行了 WmiRNA為診斷指標(biāo)和治療祀點(diǎn)為目的的研究，并取得 了一些進(jìn)展。由于血漿、組織等生物樣本中的miRNA在室溫、高溫、不同pH、多次凍融后仍能 檢測(cè)到，并且含量變化不大，而此時(shí)大多數(shù)RNA、蛋白質(zhì)、酶都會(huì)降解、失活，因此miRNA的穩(wěn) 定性;快速、高通量的miRNA忍片檢測(cè)技術(shù);miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)的日益完善，為其作為肝毒性生 物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)提供了可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在提供一種微小RNA在制備藥物性肝損傷生物標(biāo)志物中的用途。
[0007] 如本發(fā)明所用，小鼠的miR-30c-5p是一段成熟的微小RNA(miRNA，microRNA)序列， 其堿基序列為:UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(沈Q ID No. 1)。
[0008] 具體地說(shuō)，本發(fā)明的第一方面是提供了 miR-30c-5p在制備檢測(cè)黃藥子導(dǎo)致的肝損 傷的生物標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述miR-30c-5p的堿基序列如SEQ ID No.l所示。
[0009] 在一優(yōu)選例中，所述黃藥子的用量不會(huì)引起血清ALT或AST活性的增強(qiáng)。
[0010] 本發(fā)明的第二方面是提供了 miR-30c-5p在制備檢測(cè)黃獨(dú)素 B導(dǎo)致的肝損傷的生物 標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述miR-30c-5p的堿基序列如SEQ ID No.l所示。
[0011] 本發(fā)明的第Ξ方面是提供了 miR-30c-5p在制備排除對(duì)乙酷氨基酪導(dǎo)致的肝損傷 的生物標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述miR-30c-5p的堿基序列如SEQ ID No.l所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了 miR-30c-5p在制備排除野百合堿導(dǎo)致的肝損傷的生物標(biāo)志物中 的應(yīng)用，所述miR-30c-5p的堿基序列如沈Q ID No.l所示。
[0013] 本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得W詳盡描述。通過(guò)下文W及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1不同劑量的黃藥子乙酸乙醋提取物巧F)對(duì)各組動(dòng)物血清ALT、AST水平的影響。 (T ±SE)，與正常組比較，沖<〇.〇5。
[001引圖2黃獨(dú)素 B(DB) (350mg/kg)對(duì)各組動(dòng)物血清ALT、AST水平的影響。（Γ ±化)，與正 常組比較，林沖<0.001。
[0016] 圖3 APAP(350mg/kg)對(duì)各組動(dòng)物血清ALT、AST水平的影響。（Γ ±SE)，與正常組比 較，林沖<0.001。
[0017]圖4 MCT(360mg/kg)對(duì)各組動(dòng)物血清ALT、AST水平的影響。（Γ ± SE)，與正常組比 較，林沖<0.001。
[0018] 圖5不同劑量的黃藥子乙酸乙醋提取物化F)和黃獨(dú)素 B對(duì)各組動(dòng)物血清miR-30c- 5p水平的影響。（Γ ±化)，與正常組比較，*沖<0.01，**沖<0.001。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中所使用的試劑和原料均可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買獲 得。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議 的條件。
[0020] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中 所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0021] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺蒞任意組合。本專利說(shuō)明書(shū)所掲 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所掲示的各個(gè)特征，可w任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所掲示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0022]實(shí)施例1黃藥子乙酸乙醋提取物和黃獨(dú)素 B誘導(dǎo)小鼠肝毒性 [002引 1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0024] 1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[002引ICR小鼠，方，體重18~22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證 號(hào)：SCXK(滬）2012-0002。小鼠飼養(yǎng)溫度（22 ± 1)°C，相對(duì)濕度（65 ± 10) %，照明時(shí)間每天 12h。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)4天，自由取食、飲水。
[0026] 1.1.2受試藥物及其制備
[0027] 黃藥子乙酸乙醋提取物化F):稱取黃藥子粗粉4000g，加10倍體積80%乙醇回流提 取化，提取4次，合并提取液，再用等體積乙酸乙醋萃取8次，合并萃取液，轉(zhuǎn)移至玻璃容器， 減壓濃縮，即得黃藥子乙酸乙醋提取物化巧。
[002引 1.1.3儀器酶標(biāo)儀（公司：美國(guó)Bio-Tech,型號(hào)：SynergyH4)
[0029] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0030] 1.2.1高效液相色譜測(cè)定EF中黃獨(dú)素 B的含量
[0031 ]色譜柱為ultimate TM XB-C18column(4.6X250mm,5皿）；流動(dòng)相條件為乙臘-水 =25 : 75 (v/v)，流速為1. OmL/min，等度洗脫；進(jìn)樣體積為10化;柱溫為25°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為 210皿。首先取黃獨(dú)素 B(DB)適量，精密稱定，加甲醇配成Img/ml的溶液，混勻，即得對(duì)照品溶 液。DB(1000yg/血）用甲醇稀釋至一系列濃度：7.81，15.63,31.25,62.5，125,250yg/血，混 勻，用0.45μπι有機(jī)相濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，按照上述液相條件運(yùn)行，積分求得峰面積值， 結(jié)果W濃度(yg/mU對(duì)峰面積值進(jìn)行回歸分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。其次，取黃藥子乙 酸乙醋提取物化F)適量，精密稱定，置25ml容量瓶中，加70 %乙醇超聲使之溶解，冷卻后定 容至刻度，用0.45μπι有機(jī)相濾膜濾過(guò)。取制得的供試品溶液按照上述液相條件運(yùn)行，所得的 峰面積值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DB含量。
[0032] 1.2.2肝毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0033] EF致肝毒性分析:動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、EF(450mg/kg)給藥組、EF(375mg/kg) 給藥組、EF(300mg/kg)給藥組。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食不禁水12h，除C0NT組（給予等體積生理鹽 水)外，其余各組小鼠〇.2ml/10g灌胃給藥各劑量EF，給藥后2地處死動(dòng)物，取血分析。
[0034] 黃獨(dú)素 B(DB)致肝毒性分析:動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、DB給藥組。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁 食不禁水12h，除C0NT組（給予等體積生理鹽水）外，其余各組小鼠0.2ml/lOg灌胃給藥DB (300mg/kg)