一種n-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法
【專利說明】一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于熒光標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法。
技術(shù)背景
[0003]在生命科學(xué)中，多糖是不可或缺的生物大分子，但因其缺少發(fā)光基團(tuán)，因此不易于檢測，故妨礙了它的研宄。熒光標(biāo)記物可以通過化學(xué)方法將其熒光發(fā)光基團(tuán)結(jié)合到糖鏈分子上，從而使多糖帶有熒光基團(tuán)，便于使用常規(guī)檢測手段可以對多糖進(jìn)行檢測，有利于進(jìn)一步對其作用機(jī)理進(jìn)行研宄。
[0004]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，放射性同位素常用于標(biāo)記多糖，以此來示蹤多糖的生物活性，進(jìn)而研宄其作用機(jī)理。但是，因放射性同位素會(huì)造成實(shí)驗(yàn)生物體產(chǎn)生不良反應(yīng)，不便于應(yīng)用在多糖的活性研宄。然而，熒光標(biāo)記物可以通過化學(xué)方法將其熒光發(fā)光基團(tuán)結(jié)合到糖鏈上，使多糖具有一定的熒光性。結(jié)合到多糖上的熒光基團(tuán)具有激發(fā)和發(fā)射波長的特點(diǎn)，因此使用常規(guī)的熒光檢測器便可以檢測和示蹤多糖。且有文獻(xiàn)報(bào)道，熒光標(biāo)記后的多糖其生物活性與原多糖沒有明顯差異，且還能直接對其進(jìn)行檢測。目前國內(nèi)對于多糖的熒光標(biāo)記物主要為異硫氰酸熒光素(FITC)，F(xiàn)ITC主要標(biāo)記糖胺聚糖和脂多糖，并非所有的多糖都可標(biāo)記。
[0005]基于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明以N-甲基靛紅酸酐為熒光標(biāo)記物，對多糖的羥基特異性進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、標(biāo)記物分離純化簡單。熒光標(biāo)記后的多糖，可以使用常規(guī)的熒光檢測器進(jìn)行檢測，便于對多糖的功能和機(jī)制進(jìn)行研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法。用熒光標(biāo)記物標(biāo)記多糖，使得多糖可以方便的用熒光檢測器進(jìn)行檢測，從而便于對多糖的功能和機(jī)制進(jìn)行研宄。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
(1)樣品處理:用0.lmol/L、PH 8.0的硼酸鹽緩沖液和5~10mL濃度w/v為50%的二甲基亞砜溶液溶解配制成40~80mg/mL多糖溶液；所述多糖溶液為阿拉伯膠溶液或麥芽糊精溶液；
(2)熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液的制備:N-甲基靛紅酸酐用二甲基亞砜溶解配制成20mg/mL溶液；
(3)將步驟(2)得到的熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液加入到步驟(I)得到的多糖溶液中，35°C下孵化15~20min，熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與多糖的質(zhì)量比為1:50_1:60 ；
(4)熒光標(biāo)記多糖的分離:采用有機(jī)溶劑沉淀法，即將步驟(3)反應(yīng)后的溶液加入無水乙醇，利用多糖醇沉的性質(zhì)將多糖分離，熒光標(biāo)記多糖溶液與無水乙醇的體積比為I:4~1:8,醇沉的多糖6000Xg離心10~20min，離心得到的上清液與無水乙醇體積比為1:2~1:4，再次醇沉離心；
(5)熒光標(biāo)記多糖的純化:將兩次得到的沉淀混合，用蒸餾水復(fù)溶，使用砂芯過濾裝置過濾以除去未與多糖反應(yīng)的水不溶性N-甲基靛紅酸酐和雜質(zhì)，濾液凍干，即可得到熒光標(biāo)記多糖。
[0008]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明所選用的熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與其他熒光標(biāo)記物相比(如FITC、尼羅紅等)價(jià)格低廉。
[0009]2、本發(fā)明熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與多糖的反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、熒光標(biāo)記多糖分離純化方法簡單。
[0010]3、熒光標(biāo)記后的多糖，可以使用常規(guī)的熒光檢測器進(jìn)行檢測，便于對多糖的功能和機(jī)制進(jìn)行研宄。
【附圖說明】
[0011]圖1為焚光標(biāo)記阿拉伯膠與阿拉伯膠在360nm處激發(fā)的焚光光譜；
圖2為熒光標(biāo)記麥芽糊精與麥芽糊精在360nm處激發(fā)的熒光光譜；
圖3為激光共聚焦顯微鏡觀察的熒光標(biāo)記麥芽糊精在微膠囊中的分布；
圖4為微膠囊中熒光標(biāo)記麥芽糊精的熒光強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
(I)樣品處理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸鹽緩沖液5~10mL和濃度w/v 50%的二甲基亞砜溶液溶解配制成40~80mg/mL阿拉伯膠溶液。
[0013](2)熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液的制備:N-甲基靛紅酸酐用二甲基亞砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0014](3)將配制好的熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液按照熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與阿拉伯膠的質(zhì)量比1:50的比例加入到阿拉伯膠溶液中35°C下孵化15min。
[0015](4)熒光標(biāo)記多糖的分離:N-甲基靛紅酸酐標(biāo)記的阿拉伯膠用有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行分離，向標(biāo)記后的多糖溶液中加入無水乙醇，利用多糖醇沉的性質(zhì)將多糖分離，熒光標(biāo)記多糖溶液:無水乙醇體積比1:4，醇沉的多糖6000Xg離心10~20min，離心得到的上清液:無水乙醇體積比1:2~1:4,再次醇沉離心。
[0016](5)熒光標(biāo)記多糖的純化:將兩次得到的沉淀混合，用蒸餾水復(fù)溶，使用砂芯過濾裝置過濾以除去未與多糖反應(yīng)的水不溶性N-甲基靛紅酸酐和雜質(zhì)，濾液凍干，即可得到熒光標(biāo)記阿拉伯膠。
[0017]實(shí)施例2
(I)樣品處理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸鹽緩沖液5~10mL和w/v 50%的二甲基亞砜溶液溶解配制成40~80mg/mL麥芽糊精溶液。
[0018](2)熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液的制備:N-甲基靛紅酸酐用二甲基亞砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0019](3)將配制好的熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液按照熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與麥芽糊精的質(zhì)量比1:55的比例加入到麥芽糊精溶液中35°C孵化18min。
[0020](4)熒光標(biāo)記多糖的分離:N-甲基靛紅酸酐標(biāo)記的阿拉伯膠用有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行分離，向標(biāo)記后的多糖溶液中加入無水乙醇，利用多糖醇沉的性質(zhì)將多糖分離，熒光標(biāo)記多糖溶液:無水乙醇體積比1:6，醇沉的多糖6000Xg離心10~20min，離心得到的上清液:無水乙醇體積比1:2~1:4,再次醇沉離心。
[0021](5)熒光標(biāo)記多糖的純化:將兩次得到的沉淀混合，用蒸餾水復(fù)溶，使用砂芯過濾裝置過濾以除去未與多糖反應(yīng)的水不溶性N-甲基靛紅酸酐和雜質(zhì)，濾液凍干，即可得到熒光標(biāo)記麥芽糊精。
[0022]實(shí)施例3
(I)樣品處理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸鹽緩沖液5~10mL和w/v 50%的二甲基亞砜溶液溶解配制成40~80mg/mL麥芽糊精溶液。
[0023](2)熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液的制備:N-甲基靛紅酸酐用二甲基亞砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0024](3)將配制好的熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液按照熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與麥芽糊精的質(zhì)量比1:60的比例加入到麥芽糊精溶液中35°C孵化20min。
[0025](4)熒光標(biāo)記多糖的分離:N-甲基靛紅酸酐標(biāo)記的阿拉伯膠用有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行分離，向標(biāo)記后的多糖溶液中加入無水乙醇，利用多糖醇沉的性質(zhì)將多糖分離，熒光標(biāo)記多糖溶液:無水乙醇體積比1:8，醇沉的多糖6000Xg離心10~20min，離心得到的上清液:無水乙醇體積比1:2~1:4,再次醇沉離心。
[0026](5)熒光標(biāo)記多糖的純化:將兩次得到的沉淀混合，用蒸餾水復(fù)溶，使用砂芯過濾裝置過濾以除去未與多糖反應(yīng)的水不溶性N-甲基靛紅酸酐和雜質(zhì)，濾液凍干，即可得到熒光標(biāo)記麥芽糊精。
[0027](6)熒光標(biāo)記微膠囊的制備:麥芽糊精(含部分N-甲基靛紅酸酐標(biāo)記的麥芽糊精)與變性淀粉溶于60°C蒸餾水，再加入已溶有乳化劑油脂，經(jīng)高壓均質(zhì)、噴霧干燥，得到熒光標(biāo)記微膠囊。
[0028](7)觀察:將得到的熒光標(biāo)記微膠囊平鋪于載玻片上，保證顆粒分散。使用激光共聚焦顯微鏡在405nm激發(fā)波長下觀察微膠囊中麥芽糊精的分布情況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法，其特征是: (1)樣品處理:用0.lmol/L、PH 8.0的硼酸鹽緩沖液和5~10mL濃度w/v為50%的二甲基亞砜溶液溶解配制成40~80mg/mL多糖溶液； (2)熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液的制備:N-甲基靛紅酸酐用二甲基亞砜溶解配制成20mg/mL溶液； (3)將步驟(2)得到的熒光標(biāo)記儲(chǔ)備液加入到步驟(I)得到的多糖溶液中進(jìn)行孵化； (4)熒光標(biāo)記多糖的分離:采用有機(jī)溶劑沉淀法，即將步驟(3)的熒光標(biāo)記多糖溶液加入無水乙醇，利用多糖醇沉的性質(zhì)將多糖分離，第一次離心得到的上清液與無水乙醇體積比為1:2~1:4，再次醇沉離心； (5)熒光標(biāo)記多糖的純化:將兩次得到的沉淀混合，用蒸餾水復(fù)溶，使用砂芯過濾裝置過濾以除去未與多糖反應(yīng)的水不溶性N-甲基靛紅酸酐和雜質(zhì)，濾液凍干，即可得到熒光標(biāo)記多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法，其特征是:所述多糖溶液為阿拉伯膠溶液或麥芽糊精溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法，其特征在于:步驟(3)中熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐與多糖的質(zhì)量比為1:50~1:60。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的孵化條件為:35°C下孵化15~20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的方法及分離純化工藝，其特征在于:步驟(4)中第一次離心多糖醇沉?xí)r熒光標(biāo)記多糖溶液與無水乙醇體積比為1:4~1: 8，醇沉的多糖 6000 X g 離心 10~20min。
【專利摘要】一種N-甲基靛紅酸酐快速標(biāo)記多糖的制備方法，屬于熒光標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以熒光標(biāo)記物N-甲基靛紅酸酐標(biāo)記多糖，其方法為：N-甲基靛紅酸酐儲(chǔ)備液與多糖溶液在35℃條件下孵化15~20min，并通過有機(jī)溶劑沉淀法對熒光標(biāo)記多糖進(jìn)行分離純化，該反應(yīng)反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、熒光標(biāo)記多糖分離純化方法簡單。熒光標(biāo)記后的多糖，可以使用常規(guī)的熒光檢測器進(jìn)行檢測，便于對多糖的功能和機(jī)制進(jìn)行研究。
【IPC分類】G01N33-52, G01N21-64
【公開號(hào)】CN104535754
【申請?zhí)枴緾N201410748956
【發(fā)明人】涂宗財(cái), 李如一, 石燕, 王輝, 楊文華, 李雪, 常海霞
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月10日