專利名稱：通過(guò)粘膜給藥的含有作為免疫強(qiáng)化劑的病毒樣顆粒的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別是涉及新型疫苗免疫增強(qiáng)策略的用途。在本發(fā)明中，佐劑是一種同時(shí)構(gòu)成制劑中有意義的抗原的病毒樣顆粒(VLP)。該佐劑的機(jī)制以一種抗原對(duì)另一種抗原的正效應(yīng)或制劑中抗原之間的協(xié)同相互作用為基礎(chǔ)。
現(xiàn)有技術(shù)準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明尋求的技術(shù)目的是開(kāi)發(fā)能夠增強(qiáng)對(duì)通過(guò)粘膜途徑給予的抗原的免疫反應(yīng)的制劑，從而將該制劑中成分的數(shù)量減少到最低限度。提高活性受到粘膜水平上的顆粒之間的相互作用的支持，從而產(chǎn)生全身以及粘膜免疫。此外，為粘膜途徑開(kāi)發(fā)被視為中心抗原HBsAg的聯(lián)合疫苗提高了對(duì)一種或多種共同給予的抗原的免疫反應(yīng)。明顯的優(yōu)點(diǎn)在于消除不同于所關(guān)注的抗原的所有其它成分或化合物并使用不同的途徑。我們考慮到這是開(kāi)發(fā)粘膜用聯(lián)合疫苗的基礎(chǔ)或核心。
HBcAg是一種乙型肝炎病毒(HBV)感染過(guò)程中或免疫接種后具有極高免疫原性的抗原。在許多HBV慢性患者中，它是唯一能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原。它甚至可以以納克的量在小鼠中誘發(fā)免疫反應(yīng)。近來(lái)，幾種結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證實(shí)了解釋其有效免疫原性的重要特征。HBcAg特異性地結(jié)合小鼠體內(nèi)大量剩余B細(xì)胞中的膜免疫球蛋白受體，這一過(guò)程足以誘導(dǎo)共同刺激性B7-1和B7-2分子。由此可見(jiàn)，對(duì)HBcAg具有特異性的非敏感性B細(xì)胞可以攝取、加工并在體內(nèi)為原初T細(xì)胞提供HBcAg肽類并在體外為T(mén)細(xì)胞雜交瘤提供HBcAg肽類，它比巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞約有效105倍。這種結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系解釋了HBcAg的巨大免疫原性(Milich，D.R.等1997《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)12月23日；94(26)14648-53)。
血清學(xué)和生化研究表明HBV急性感染的消退因有效細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而發(fā)生，而慢性感染的特征在于難以或不能檢測(cè)到細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和相對(duì)有效的”體液反應(yīng)。
體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫通過(guò)不同族的輔助T細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)。影響誘發(fā)小鼠體內(nèi)對(duì)HBV抗原(HBcAg/HBeAg)的Th1或Th2反應(yīng)的因素顯示這種平衡受到下列因素影響(1)抗原結(jié)構(gòu)(HBcAg是一種顆粒狀結(jié)構(gòu)而HBeAg不是)；(2)被識(shí)別的宿主和T細(xì)胞抗原的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)；(3)Th1和TH2細(xì)胞之間的交叉調(diào)節(jié)；(4)對(duì)Th1細(xì)胞比對(duì)Th2細(xì)胞更為完全的T細(xì)胞的耐受性；(5)優(yōu)先使Th1細(xì)胞缺失的分泌的HBeAg的活性；和(6)使用用于在體內(nèi)調(diào)制對(duì)Th1或Th2細(xì)胞的反應(yīng)的細(xì)胞因子處理。這種Th1/Th2平衡與HBV感染的急性或慢性過(guò)程相關(guān)。Th2細(xì)胞優(yōu)先避免誘發(fā)與Th1相比的耐受性。如果在HBV垂直傳遞過(guò)程中HBeAg起耐受原的作用，那么使Th1缺失的細(xì)胞即主要對(duì)HBeAg具有特異性的Th2細(xì)胞可以影響慢性攜帶者情況中的發(fā)作和維持。在這種情況中，細(xì)胞因子療法用于調(diào)制對(duì)Th1的反應(yīng)、可以有利于治療HBV慢性感染(Milich，D.R.1997《病毒性肝炎雜志》(J.Viral.Hepat.)4，增刊248-59)。
通過(guò)將HBeAg/HBcAg特異性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化移到(HBeAg和HBcAg)轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)檢驗(yàn)HBeAg循環(huán)對(duì)HBcAg Th1特異性T細(xì)胞的作用。存在的血清HBeAg消除了Th1介導(dǎo)的對(duì)HBcAg的反應(yīng)并改變了與Th2表型的平衡。這一結(jié)果提示在乙型肝炎感染過(guò)程中，循環(huán)HBeAg具有優(yōu)先消除清除病毒所需的炎癥特異性Th1細(xì)胞的潛能，從而提高了HBV的持久性(Milich-DR等1998《免疫學(xué)雜志》(J-Immunol.)2月15日；160(4)2013-21)。
已知對(duì)HBcAg的抗體自開(kāi)始感染而存在且在HBV慢性感染患者血清中達(dá)到高濃度，不過(guò)，這些抗體不具有保護(hù)性。由慢性攜帶者母親被動(dòng)傳遞給新生兒的抗體不能預(yù)防兒童感染。(Beasley等1977《美國(guó)流行病學(xué)雜志》(Ameican Journal of Epidemiology)105914-918)。然而，已經(jīng)證實(shí)給黑猩猩免疫接種HBcAg可部分或完全預(yù)防它們感染HBV(Iwarson，S.等1985 《腸胃病學(xué)》88763-767；Murray，K.等1987《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志》(Journal of Medical Virology)23101-107)。在Iwarson的研究中，有三只黑猩猩完全預(yù)防了感染。在用HBV攻擊后，對(duì)HBcAg和HBeAg的抗體水平升高，而僅一只黑猩猩對(duì)HBsAg產(chǎn)生了血清轉(zhuǎn)變。在Murray的研究中，4只免疫接種黑猩猩中的2只在攻擊后表現(xiàn)出低水平的病毒復(fù)制；在2或3周的時(shí)間在血清中可檢測(cè)到HBsAg，且此后它們發(fā)展成抗-HBsAg抗體反應(yīng)。假定不完全的保護(hù)作用是由于接種疫苗而不使用佐劑的動(dòng)物體內(nèi)的低免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的。
在給土撥鼠免疫接種溶于弗氏完全佐劑(ACF)的肝炎核心抗原(WHcAg)后，能夠防止土拔鼠受到不可檢測(cè)到的對(duì)表面蛋白(WHsAg)的抗體的感染跡象的病毒(WHV)的攻擊。盡管不可能拋棄T輔助細(xì)胞抗核殼免疫反應(yīng)可以增加對(duì)表面抗原的未檢測(cè)到的抗體的假說(shuō)，但是將細(xì)胞毒性活性看作是起預(yù)防作用的主要原因(Roos，S.等1989《遺傳病毒學(xué)雜志》(J.Gen.Virol.)70，2987-2095)。在使用土撥鼠進(jìn)行的第二種研究中，確定了HBcAg和WHcAg在預(yù)防上的作用以及可能的機(jī)理。給動(dòng)物免疫接種WHcAg和HBcAg并在此后使用高劑量的WHV進(jìn)行攻擊。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)WHcAg是一種存在交叉保護(hù)性作用的保護(hù)性抗原，因?yàn)?只免疫接種了HBcAg的土撥鼠中的4只被保護(hù)而沒(méi)有受到攻擊。兩種抗原產(chǎn)生了高抗體滴度，其中交叉反應(yīng)性低于1％，從而證明了目前使用內(nèi)部乙型肝炎病毒抗原具有保護(hù)作用的報(bào)導(dǎo)。由于看起來(lái)兩種抗原的顯性B表位不是保守的，所以這一結(jié)果也表明直接針對(duì)核心抗原的抗體對(duì)保護(hù)作用來(lái)說(shuō)并不重要。免疫接種了WHcAg/HBcAg的土撥鼠在受到WHC攻擊后對(duì)表面蛋白的血清抗體產(chǎn)生快速反應(yīng)，從而證明增加的輔助T細(xì)胞反應(yīng)作為免疫接種內(nèi)部抗原HBV/WHV后的保護(hù)作用的潛在機(jī)理。(Schodel-F等《疫苗》199311(6)624-8)。
轉(zhuǎn)染來(lái)自帶有二聚化HBV DNA的BALB/C小鼠肝細(xì)胞的確立的細(xì)胞系(ML系)導(dǎo)致在這些細(xì)胞系中表達(dá)HBV抗原。免疫接種了表達(dá)HBsAg和HBcAg的ML-1.1細(xì)胞的BALB/c小鼠脾細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致表達(dá)無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞退化。此外，免疫接種了HBsAg和HBcAg的BALB/c小鼠脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也導(dǎo)致腫瘤退化。這些結(jié)果表明表面和核殼抗原可以誘發(fā)能夠在體內(nèi)排斥肝細(xì)胞癌的免疫性(Chen，S.H.等1993《癌癥研究》(Cancer-Res.)10月1日；53(19)4648-51)。
在II/IH期研究中檢測(cè)了以人HLA用特異性核殼表位為基礎(chǔ)的治療疫苗(Liaw，Y.F.1997《胃腸病學(xué)和肝臟病學(xué)雜志》(J.Gastroenterol.Hepatol.)10月，12(9-10)S227-35)。
已經(jīng)證實(shí)HBcAg是一種極佳的載體。HBcAg代表人和動(dòng)物模型中的高度免疫原性抗原。HBcAg直接激活B細(xì)胞并產(chǎn)生強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)；此外，由抗原呈遞細(xì)胞有效加工和呈遞的HBcAg使得它成為理想的載體分子。因此，已經(jīng)將大量的表位通過(guò)化學(xué)方式與HBcAg分子連接或通過(guò)遺傳方式與HBcAg分子融合而成功地增加了其免疫原性。已經(jīng)在細(xì)茵中設(shè)計(jì)了表達(dá)載體以便能夠在HBcAg顆粒內(nèi)部的不同位置上插入異源B細(xì)胞表位并有效純化雜交顆粒。
B細(xì)胞表位的位置研究表明80位氨基酸的內(nèi)部插入物持續(xù)是免疫顯性的，從而使得抗體產(chǎn)生的量比其它融合蛋白增加。已經(jīng)在不同系統(tǒng)中使用實(shí)驗(yàn)性攻擊進(jìn)行了免疫原性研究。例如，將來(lái)自Plasmodiumberghei環(huán)子孢子的肽插入該位點(diǎn)且純化的雜交顆粒HBcAg/CS是高度免疫原性的并且對(duì)受瘧疾攻擊的小鼠預(yù)防率可達(dá)100％。為了開(kāi)發(fā)口服疫苗，已經(jīng)將減毒的無(wú)毒性沙門(mén)菌屬菌株用于引入編碼HBcAg雜交顆粒的基因(Milich，D.R.等1995《紐約科學(xué)院年鑒》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)5月31日；754187-201)。
總之，除在黑猩猩(chimps)中總體或部分證明的或由使用WHcAg實(shí)驗(yàn)間接涉及的HBcAg與保護(hù)作用之間的關(guān)系之外，這種蛋白質(zhì)具有使之成為獨(dú)一無(wú)二的許多特性。HBcAg作為T(mén)依賴性和T非依賴性抗原起作用(Milich，D.R.等1986《科學(xué)》(Science)234，1398-1401)，它具有極高的免疫原性，它甚至不通過(guò)佐劑的輔助且其接種優(yōu)先敏化Th1細(xì)胞(Milich，D.R.等1997《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)71，2192-2201)。HBcAg是一種極為有效的載體蛋白質(zhì)(Schdel，F(xiàn).等1992《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)66，106-114；Milich，D.R.等1995《紐約科學(xué)院年鑒》(Ann-N-Y.Acad-Sci.)5月31日；754187-20)且Th HBcAg特異性細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)HBcAg的抗體反應(yīng)以及抗-HBsAg(Milich，D.R.等1987《自然》(Nature)(London)329547-549)。對(duì)于顆粒狀HBcAg來(lái)說(shuō)，這些免疫特性是獨(dú)特的且不適用于非顆粒形式的抗原HBeAg(Milich，D.R.等1997《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)12月23日；94(26)14648-53)。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，第一次報(bào)導(dǎo)了具有足量比例的HBsAg和HBcAg作為主要化合物的疫苗制劑?？梢砸肫渌衔镒鳛榉€(wěn)定劑和防腐劑。
HBsAg/HBcAg制劑的新穎性在于當(dāng)將HBsAg與HBcAg混合時(shí)與所產(chǎn)生的抗HBsAg的提高作用連接。兩種抗原是HBV的化合物且由此佐劑的作用被本身作為疫苗抗原而令人關(guān)注的其它病毒抗原擔(dān)當(dāng)，從而使疫苗制劑具有較寬的抗乙型肝炎的免疫反應(yīng)譜。核殼抗原與表面抗原聯(lián)用的其它制劑、例如HBsAg/人乳頭瘤病毒樣顆粒并擴(kuò)展至其它病毒抗原的病毒制劑導(dǎo)致對(duì)兩種抗原的滴度增加。在將HBsAg與其它抗原混合后，可以顯現(xiàn)出免疫原性的增加超過(guò)其它共同接種的抗原，從而證實(shí)由X＋HBsAg聯(lián)用通過(guò)鼻部途徑產(chǎn)生的協(xié)同作用。一般來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果使生產(chǎn)HBsAg的粘膜用聯(lián)用疫苗成為可能且能夠使用VPL之間的正向相互作用，將VPL看作類似于病毒的、具有納米大小的具有機(jī)體構(gòu)造蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)。
就含有HBsAg和HBcAg的制劑而言，我們可以獲得比商購(gòu)的單一HBsAg疫苗更為優(yōu)良的產(chǎn)品，這是因?yàn)椋?可能獲得由在抗VHB保護(hù)作用中本身被視為重要抗原的HBcAg產(chǎn)生的更寬譜的免疫反應(yīng)。此外，通過(guò)粘膜接種達(dá)到的IgG血清水平抗-HBsAg與使用在明礬中全身接種所獲得的結(jié)果同樣強(qiáng)。
-接種途徑提供了特殊的優(yōu)點(diǎn)，諸如同時(shí)獲得全身和粘膜免疫性；消除了嚴(yán)格的質(zhì)量控制諸如無(wú)菌和致熱原以及高價(jià)注射用疫苗、相關(guān)的毒性。
-可以避免由以明礬為基礎(chǔ)的疫苗產(chǎn)生的毒性作用和注射佐劑的毒性作用，因?yàn)?號(hào)抗原同時(shí)也是佐劑。
-能夠使用原始HBsAg＋HBcAg制劑作為聯(lián)用疫苗的核心(nucleus)。
-能夠使用這種制劑給對(duì)表面抗原無(wú)反應(yīng)者和免疫抑制患者進(jìn)行免疫接種，這是由于接種途徑和引入的核殼抗原本身被視為保護(hù)性抗原所導(dǎo)致的。
-該制劑的特性使得它成為作為治療用途的理想制劑。
在第二個(gè)方面中，核殼抗原有利于增加共同接種的抗原的免疫原性。我們發(fā)現(xiàn)所得的制劑具有很大的單純性(simplicity)且同時(shí)因避免使用本身屬于對(duì)保護(hù)作用沒(méi)有意義的佐劑的可能性而具有最低數(shù)量抗原的這些有潛力疫苗的效價(jià)提高。由此可見(jiàn)，如果需要，可以獲得極其減少的聯(lián)合用于單一或聯(lián)用疫苗。
在第三個(gè)方面中，能夠生產(chǎn)具有作為核心的HBsAg的聯(lián)用疫苗，其中HBsAg對(duì)其它共同接種的抗原的免疫增強(qiáng)作用在實(shí)施例4中得到證實(shí)。這些制劑的優(yōu)點(diǎn)以作為抗HBV疫苗中心抗原的HBsAg與其它抗原的有效結(jié)合為基礎(chǔ)，其中在產(chǎn)生的針對(duì)兩種抗原的反應(yīng)中證實(shí)了協(xié)同作用。這一事實(shí)不僅具有上述變化形式的吸引力，而且使得對(duì)世界上廣泛分布的疾病具有保護(hù)作用的抗原HBsAg成為聯(lián)合制劑的中心抗原。
一般來(lái)說(shuō)，與其它粘膜用疫苗相比，能夠分離出下列優(yōu)點(diǎn)一‘輔助過(guò)程-混合抗原-不需要抗原吸附且HBcAg抗原的量在HBsAg的相似水平。
-因小的顆粒大小而可以使用作為滅菌工藝的過(guò)濾，而以這種方式不能對(duì)其它策略中和超過(guò)0.2μm的佐劑進(jìn)行除菌。
-HBcAg生產(chǎn)過(guò)程的簡(jiǎn)單性使得它與其它佐劑相比成為極其低廉的抗原。
本發(fā)明的制劑可以以0.01-10mL體積的形式存在，這取決于接種途徑和用于免疫接種的物種?？乖膭┝吭?.001-1mg的范圍內(nèi)改變。
操作實(shí)施例實(shí)施例1為了評(píng)價(jià)HBcAg經(jīng)鼻部途徑的免疫原性，在所有情況中給3組8只雌性BALB/c小鼠接種10μg劑量的HBcAg。給第一組接種溶于乙酰嗎喃(acemannan)(CIGB，La Habana)3mg/mL(干重)的HBcAg，乙酰嗎喃是目前通過(guò)鼻部途徑用于增加特定系統(tǒng)的免疫原性的佐劑。給第二組接種溶于磷酸鹽鹽水(PBS)緩沖液的HBcAg。給第三組經(jīng)皮下注射溶于明礬的抗原并用作全身接種的對(duì)照組。在第0、14、28天給予接種方案并在第42天提取結(jié)果。通過(guò)免疫酶試驗(yàn)(ELISA)對(duì)抗體反應(yīng)進(jìn)行定量以便測(cè)定血清中針對(duì)HBcAg的IgG抗體。
進(jìn)行斯氏t檢驗(yàn)以便對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將p＜0.05看作具有顯著性差異。
證明使用乙酰嗎喃不可能增加抗-HBcAg抗體的免疫反應(yīng)。溶于PBS的抗原產(chǎn)生與使用乙酰嗎喃獲得的相似強(qiáng)度的免疫反應(yīng)(附
圖1)。在經(jīng)鼻部接種溶于乙酰嗎喃或PBS的抗原后的反應(yīng)與使用明礬全身接種獲得的反應(yīng)相似?？傊?，通過(guò)鼻部途徑可以使用具有高免疫原性的HBcAg。實(shí)施例2為了證明當(dāng)將HBcAg與HBsAg兩者混合并通過(guò)鼻部途徑接種時(shí)HBcAg對(duì)HBsAg的免疫增強(qiáng)活性，檢測(cè)4組8只雌性BALB/c小鼠。實(shí)施兩種接種方案。在第0和第14天進(jìn)行接種。在第21天提取結(jié)果。給第一組接種10μg溶于PBS的HBsAg；給第二組接種10μg溶于乙酰嗎喃(acemannan)3mg/mL(干重)的HBsAg(CIGB，La Habana)；給第三組接種10μg的HBsAg和10μg的HBcAg。將第四組用作全身對(duì)照、皮下接種10μg溶于明礬的HBsAg(附圖2)。進(jìn)行斯氏t檢驗(yàn)以便對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將p＜0.05看作具有顯著性差異。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)概括出如下結(jié)論通過(guò)經(jīng)鼻部途徑接種HBsAg和HBcAg可以增強(qiáng)抗HBsAg的免疫反應(yīng)?？笻BsAg反應(yīng)明顯優(yōu)于接種溶于PBS的HBsAg時(shí)的組且類似于接種溶于乙酰嗎喃組所達(dá)到的反應(yīng)水平。全身接種于明礬中的HBsAg與通過(guò)鼻部途徑接種乙酰嗎喃的組沒(méi)有顯著性差異。實(shí)施例3為了研究不同劑量的HBcAg在鼠模型中的增強(qiáng)作用，選擇6組6只雌性BALB/c小鼠。方案由三次接種(第0、14和28天)和兩次提取(第26和42天)組成。試驗(yàn)組符合下列要求(1)5μg溶于PBS的HBsAg；(2、3和4)分別使用5μg的HBsAg與5、10和20μg的HBcAg；(5)5μg的HBsAg溶于乙酰嗎喃(CIGB，La Habana)3mg/mL(干重)；和(6)5μg的HBsAg溶于明磯0.5mg/mL。給除第6組外的所有組經(jīng)鼻部接種。第6組經(jīng)肌內(nèi)接種。
進(jìn)行斯氏t檢驗(yàn)以便對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將p＜0.05看作具有顯著性差異。
在本實(shí)驗(yàn)中再次概括出如下結(jié)論通過(guò)共同接種HBsAg和HBcAg能夠增強(qiáng)抗HBsAg的反應(yīng)。三個(gè)免疫接種兩種抗原的組的血清IgG反應(yīng)明顯高于通過(guò)接種溶于PBS的HBsAg獲得的反應(yīng)并與通過(guò)接種溶于乙酰嗎喃的抗原的組獲得的反應(yīng)類似。我們已經(jīng)預(yù)先證實(shí)乙酰嗎喃可將滴度增加至與由小鼠體內(nèi)霍亂毒素獲得的水平相類似。通過(guò)全身接種溶于明礬的抗原獲得的滴度與通過(guò)鼻部途徑接種乙酰嗎喃和HBcAg/HBsAg的組沒(méi)有差異。盡管第4組抗-HBsAg抗體反應(yīng)比第3組下降，但是這種差異是由于第4組中HBcAg劑量的雙倍增加所導(dǎo)致的。這種增加可能會(huì)減少HBsAg透過(guò)粘膜的可能性。實(shí)施例4為了研究人乳頭瘤病毒16(VLP del VPH16)的病毒樣顆粒，HBsAg和HBcAg的相互作用而使用不同的抗原。給8組6只雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種，接種方案以第0、14天的接種和第2次接種7天后的提取結(jié)果為基礎(chǔ)。
比較對(duì)HBsAg的抗體滴度，乙酰嗎喃制劑(第6組)與HBcAg/HBsAg制劑(第7組)分別具有相同強(qiáng)度的反應(yīng)。這是我們第三次證明HBcAg的增強(qiáng)作用。
從本實(shí)驗(yàn)中我們還可以概括出如下結(jié)論正如圖3中第4、5和8組所表示的，乙酰嗎喃和HBcAg均不能增強(qiáng)對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)的VLP的抗體反應(yīng)。使用斯氏t檢驗(yàn)進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(將p＜0.05看作具有顯著性差異)在這些組中沒(méi)有顯示出任何差異。
分析接種HBcAg和HPV的VLP的第5組中對(duì)HBcAg的反應(yīng)，可以證實(shí)對(duì)HBcAg的抗體滴度的水平比將HBcAg與HBsAg一起引入的第7組中低。可能這兩種顆粒的存在可以在粘膜水平上產(chǎn)生反作用。然而，在第2組中，通過(guò)添加HBsAg可以實(shí)現(xiàn)高HBcAg和HPV的抗VLP，這些反應(yīng)的增加明顯高于第5組且不同于第7組中(與HBsAg)的抗HBcAg反應(yīng)。由此我們可以認(rèn)識(shí)到HBsAg與核心抗原之間的正向相互作用和VLPs與HBcAg之間的反向相互作用。在粘膜水平上的增強(qiáng)作用在兩種情況中發(fā)生，從而能夠設(shè)計(jì)具有作為核心HBsAg或HBsAg/HBcAg聯(lián)用的聯(lián)合疫苗。
HBsAg對(duì)第2組的作用不僅增強(qiáng)了對(duì)HBcAg的反應(yīng)，而且它還增強(qiáng)了抗體對(duì)HPV的VLP的反應(yīng)。比較第1、2和3與接種溶于PBS的VLP的第8組之間對(duì)VLP的反應(yīng)可以認(rèn)識(shí)到這種相同的作用。第1、2和3組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有相似的抗體水平，它們均高于第8組的抗體水平。
第1組(乙酰嗎喃＋HBsAg＋VLPs HPV)和第3組(HBsAg和VLP)在抗-HBsAg抗體滴度方面沒(méi)有差異。在第3組與第6組和第7組(分別為HBsAg/乙酰嗎喃和HBsAg/HBcAg)之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果證實(shí)了HPV的VLP對(duì)HBsAg免疫原性的增強(qiáng)作用。
這些結(jié)果支持了通過(guò)鼻部途徑的用HBsAg作為免疫增強(qiáng)核心抗原的聯(lián)合制劑的應(yīng)用。例如，HBsAg與HPV VLP的簡(jiǎn)單混合物非常具有吸引力且確實(shí)可以使引入更多的通過(guò)與HBsAg發(fā)生相互作用而得到強(qiáng)化的抗原成為可能。
不降低抗體對(duì)各成分的反應(yīng)而生成復(fù)合體制劑是可能的，例如可以將HPV的VLP、HBcAg和HBsAg混合而不影響IgG對(duì)各成分的反應(yīng)。實(shí)施例5為了證明當(dāng)將丙型肝炎病毒核殼(HCV NC)與HBsAg兩者混合并通過(guò)鼻部途徑接種時(shí)丙型肝炎病毒核殼(HCV NC)對(duì)HBsAg的免疫增強(qiáng)活性，檢測(cè)3組8只雌性BALB/c小鼠。實(shí)施兩種接種方案。在第0、14和28天進(jìn)行接種。在第42天提取結(jié)果。給第一組接種10μg的HCVNC；給第二組接種5μg溶于PBS的HBsAg且給第三組接種5μg溶于PBS的HBsAg和10μg溶于PBS的HCV NC(CIGB，La Habana)(附圖5)。
進(jìn)行斯氏t檢驗(yàn)以便對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將p＜0.05看作具有顯著性差異。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)概括出如下結(jié)論通過(guò)經(jīng)粘膜(IN)共同給予HBsAg和HCV NC能夠增強(qiáng)IgG反應(yīng)。IgG血清反應(yīng)明顯高于免疫接種溶于PBS的HBsAg的組。
附圖描述附圖1.三種劑量方案(第0、14和28天)。在第42天進(jìn)行提取。給第1和2組經(jīng)鼻部途徑接種50μL。給第3組經(jīng)皮下接種100μL。
附圖2.兩種劑量方案(第0和14天)。在第21天進(jìn)行提取。給第1、2和3組經(jīng)鼻部途徑接種50μL。給第4組經(jīng)皮下接種100μL。
附圖3.三種劑量方案(第0、14和28天)。在第26天進(jìn)行提取。給第1、2、3、4y5組經(jīng)鼻部途徑接種50μL。給第6組經(jīng)肌內(nèi)接種100μL。
附圖4.兩種劑量方案(第0和14天)。在第26天進(jìn)行提取。給所有組經(jīng)鼻部途徑接種50μL。實(shí)驗(yàn)組的組成由添加在附圖中的表中所示。
附圖5.兩種劑量方案(第0、14和28天)。在第42天進(jìn)行提取。給第1、2和3組經(jīng)鼻部途徑接種50μL。
權(quán)利要求
1.一種用于鼻部給藥的疫苗制劑，其中的成分是(a)來(lái)自病毒的表面抗原和(b)一種或多種以佐劑作用方式與(a)產(chǎn)生協(xié)同作用的疫苗抗原，各抗原的濃度可高達(dá)1mg；可以加入防腐劑和穩(wěn)定劑。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其中成分(a)是乙型肝炎病毒表面抗原且成分(b)是病毒核殼抗原。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的疫苗制劑，其中成分(b)是一種含有乙型肝炎病毒的核殼抗原的病毒樣顆粒。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的疫苗制劑，其中成分(b)是一種含有人乳頭瘤病毒的核殼抗原的病毒樣顆粒。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的疫苗制劑，其中成分(b)是一種含有丙型肝炎病毒的核殼抗原的病毒樣顆粒。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其中成分(a)是乙型肝炎病毒表面抗原且成分(b)是一種任意性質(zhì)的疫苗抗原或不同抗原的混合物，其從乙型肝炎表面抗原中獲得免疫增強(qiáng)作用。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗制劑，將它作為一種固體、液體或噴霧產(chǎn)品的形式給藥。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗制劑，用于粘膜給藥。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗制劑作為治療用疫苗的用途。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗制劑作為預(yù)防性疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)粘膜給予的能夠加強(qiáng)對(duì)乙型肝炎抗原的免疫反應(yīng)的制劑。所述的制劑包括a)乙型肝炎表面抗原(Hbs Ag)和b)乙型肝炎病毒核殼抗原(HBc Ag),從而通過(guò)制劑中抗原之間的相互協(xié)同作用而產(chǎn)生有效的粘膜和全身反應(yīng)。本發(fā)明的制劑可作為人和動(dòng)物用的疫苗制劑適用于藥物工業(yè)。
文檔編號(hào)A61K39/295GK1332637SQ99815191
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月2日
發(fā)明者J·C·阿吉拉拉比多, D·O·帕倫祖拉蓋登, V·L·穆茲歐岡薩雷斯, G·E·吉倫涅托, E·潘頓阿里亞斯, D·皮查多迪亞茲, E·伊格萊西亞斯佩雷斯 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心