專利名稱：含有香菇菌絲體提取物的lak活性篩選材料以及使用該提取物的lak活性篩選方法
美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NCI)的S.Rosenberg博士發(fā)現(xiàn)，將外周淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞介素2(IL-2)溫育可以誘導(dǎo)產(chǎn)生殺傷細(xì)胞，其對(duì)廣泛的癌癥靶細(xì)胞(包括自體癌癥細(xì)胞)顯示細(xì)胞毒性，并且這些殺傷細(xì)胞甚至可以殺死抗NK細(xì)胞的癌癥細(xì)胞(見(jiàn)日本專利公開(kāi)文本116518/87)。這些殺傷細(xì)胞被命名為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)。LAK細(xì)胞并不是由細(xì)胞學(xué)上均一的群體所組成，并已知其包括NK細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞。最近，對(duì)過(guò)繼免疫療法進(jìn)行了試驗(yàn)，其中來(lái)自受試者的外周淋巴細(xì)胞被細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的IL-2激活，接著將顯示抗腫瘤活性的LAK細(xì)胞回輸入受試者中(LAK療法)。已有報(bào)道通過(guò)使用包括反復(fù)施用該LAK細(xì)胞的過(guò)繼免疫療法，使晚期癌癥達(dá)到了緩解或者使腫瘤生長(zhǎng)得到了抑制。然而LAK療法在不同的個(gè)體中所發(fā)揮的作用是不同的，并且有時(shí)幾乎沒(méi)有任何作用。它還包括許多問(wèn)題諸如由于從病人中分離大量白細(xì)胞而強(qiáng)加于受試者的物理應(yīng)激以及大量培養(yǎng)所分離白細(xì)胞的高花費(fèi)等等，此外，包括直接給予IL-2的LAK療法由于高濃度給予IL-2導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。
具體地，已知使用IL-2的LAK過(guò)繼免疫療法導(dǎo)致一些副作用，諸如全身疲憊、寒戰(zhàn)、發(fā)燒、低清蛋白血癥、貧血、嗜酸性粒細(xì)胞增多，并且這些副作用要比單獨(dú)施用IL-2時(shí)所導(dǎo)致的副作用更嚴(yán)重。更為顯著地，某些重要的副作用與LAK細(xì)胞針對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性相伴隨。另有報(bào)道，LAK細(xì)胞針對(duì)造血于細(xì)胞的這種細(xì)胞毒性引起貧血和血小板減少，以及在體外導(dǎo)致對(duì)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。而且，通過(guò)口服途徑施用的IL-2不能被良好地吸收，因而當(dāng)前必須主要通過(guò)注射直接施用。
因而，希望在體外確定通過(guò)直接施用是否可以增強(qiáng)LAK活性以及由于療效的不確定性避免使用易于導(dǎo)致副作用的LAK療法。然而，使用IL-2的體外篩選有花費(fèi)太高的缺點(diǎn)。
已知某些細(xì)菌、食物和其它天然存在的物質(zhì)具有抗癌特性。優(yōu)選細(xì)菌及食物型物質(zhì)用作抗癌劑，這是由于它們通常有溫和的特性和低副作用性。通過(guò)使用細(xì)菌治愈癌癥已進(jìn)行了許多試驗(yàn)，正如在有關(guān)報(bào)告中所顯示由粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesens)和生膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的培養(yǎng)物過(guò)濾液組成的Coley毒素(1964)；用BCG治療白血病(MatheG.，癌癥研究進(jìn)展(Adv.Cancer Res.)，14，1，1971)；豚鼠的腫瘤消退(Zbar，B.等人，國(guó)立腫瘤研究所雜志(J.Natl.CancerInst.)，48，831，1971)；和施用酵母細(xì)胞壁多糖抗移植的腫瘤細(xì)胞(諸如，例如，肉瘤180)的有效性。
特別地，對(duì)來(lái)自酵母的多糖(諸如酵母葡聚糖和酵母甘露聚糖)以及來(lái)自其它細(xì)菌、來(lái)自地衣和擔(dān)子菌類的多糖之抗癌作用進(jìn)行了大量的研究。在它們當(dāng)中，當(dāng)前可以得到的在市場(chǎng)中作為抗癌免疫強(qiáng)化劑的商業(yè)產(chǎn)品包括來(lái)自培養(yǎng)的kawaratake菌絲體的Krestin(采絨革蓋菌(Coriolus versicolor)，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌科(Polyporaceae))(宿主免疫功能的增強(qiáng)劑，Kureha Chemical Industryand Sankyo Co.Ltd.)，來(lái)自香菇(Lentinus edodes)稱作香菇多糖的一種多糖，以及來(lái)自suehirotake(裂褶菌(Schizophyllum commune))的一種多糖。
香菇(shiitake)是一種常見(jiàn)的可食用蘑菇，見(jiàn)于日本和中國(guó)，并且在日本已栽培了大約300年。最近對(duì)其藥理作用及有效成分予以了闡明并報(bào)道有多種作用，諸如對(duì)大鼠及小鼠的大腸和肝臟中移植腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Sugano N.等人，癌癥通訊(Cancer Letter)，271，1985；Suzuki Y.等人，日本結(jié)腸直腸學(xué)會(huì)雜志(Journal of the Japan Society ofColoproctology)，43178，1990)、促有絲分裂作用(Tabata T.等人，免疫藥理學(xué)(Immunopharmacology)，2457，1992；Hibino等人，免疫藥理學(xué)，2877，1994)等等。
本發(fā)明者研究了香菇的LAK活性增強(qiáng)作用(抗腫瘤和/或抗癌活性)，目的在于提供用于篩選具有體內(nèi)LAK活性增強(qiáng)作用(其由直接施用香菇菌絲體提取物證實(shí))的材料和方法。
在常規(guī)方法中，通過(guò)對(duì)宿主實(shí)際施用LAK活性增強(qiáng)劑或者將激活的淋巴細(xì)胞(通過(guò)分離大量的自體淋巴細(xì)胞，其后體外用LAK活性增強(qiáng)劑激活制備)再輸入到宿主中測(cè)試LAK活性增強(qiáng)作用。該方法牽涉到許多問(wèn)題(諸如，強(qiáng)加于受試者的物理應(yīng)激、該療法的高花費(fèi))。因而，建立體外篩選方法以證實(shí)LAK活性增強(qiáng)劑是否實(shí)際在體內(nèi)有作用將使減小物理應(yīng)激和高花費(fèi)成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，菌絲體(為香菇的可食用子實(shí)體之前體)提取物所具有的免疫增強(qiáng)活性、抗腫瘤活性和/或抗癌活性遠(yuǎn)高于子實(shí)體。我們也發(fā)現(xiàn)可以將該提取物用作IL-2的替代物，體外誘導(dǎo)LAK活性。我們是在這種發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上完成本發(fā)明的，即通過(guò)直接體內(nèi)施用所述提取物所顯示出的體內(nèi)抗腫瘤作用和/或抗癌作用，特別是LAK活性增強(qiáng)作用能夠在體外篩選。
更具體地，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)細(xì)胞毒性(其是由直接施用抗腫瘤或抗癌劑，特別是施用含有香菇菌絲體提取物的LAK活性增強(qiáng)劑產(chǎn)生)與將制備自受試者的淋巴細(xì)胞用所述LAK活性增強(qiáng)劑激活時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性具有正相關(guān)關(guān)系。本發(fā)明提供一種適于受試者的、用于在體外確定具有LAK活性增強(qiáng)作用的材料之方法，包括步驟(a)從受試者分離外周血液以制備淋巴細(xì)胞部分，(b)制備LAK誘導(dǎo)樣品(其是通過(guò)用本發(fā)明的篩選材料處理所述淋巴細(xì)胞部分產(chǎn)生)，和對(duì)照樣品(其是在不存在篩選材料時(shí)產(chǎn)生)，和(c)測(cè)量和比較所述誘導(dǎo)樣品與所述對(duì)照樣品的LAK活性，確定篩選材料對(duì)所述受試者的體外LAK活性增強(qiáng)作用。本發(fā)明還提供含有香菇菌絲體提取物的篩選材料，該篩選材料能用于所述體外篩選方法以篩選體內(nèi)LAK活性是否能夠得到增強(qiáng)。因而本發(fā)明涉及含有香菇菌絲體提取物的篩選材料以及使用所述材料的篩選方法，該篩選方法能夠在施用LAK活性激活劑之前，體外確定是否能夠從LAK活性增強(qiáng)劑預(yù)期體內(nèi)LAK活性增強(qiáng)作用。本發(fā)明的篩選材料和篩選方法可應(yīng)用于人類以及家養(yǎng)動(dòng)物。
正如本文所用，“LAK活性”的含義為細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒活性，它攻擊不被具有NK活性的淋巴細(xì)胞識(shí)別的腫瘤，但是它對(duì)自體正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有什么影響?！癓AK活性增強(qiáng)”指增強(qiáng)該LAK活性的作用，它誘導(dǎo)從淋巴細(xì)胞產(chǎn)生LAK細(xì)胞或者進(jìn)一步增強(qiáng)現(xiàn)有LAK細(xì)胞的抗腫瘤活性。
LAK活性的增強(qiáng)增加了LAK細(xì)胞的抗腫瘤活性，它可導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能的提高。因而，本發(fā)明不僅能應(yīng)用于提高抗腫瘤活性的治療而且能應(yīng)用于提高免疫功能的治療。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是與表1中的數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)的條形圖，表示用本發(fā)明的香菇菌絲體提取物篩選LAK活性增強(qiáng)的結(jié)果。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案本發(fā)明提供含有香菇菌絲體提取物的篩選材料，以及使用所述材料的篩選方法，該篩選方法能夠在施用所述提取物之前，體外確定是否可以預(yù)期由直接體內(nèi)施用抗腫瘤劑或抗癌劑(特別是含有香菇菌絲體提取物的LAK活性增強(qiáng)配方)所產(chǎn)生的體內(nèi)LAK活性增強(qiáng)作用。正如本文所用，“篩選材料”指用于體外測(cè)試由體內(nèi)施用獲得的LAK活性增強(qiáng)作用的材料?！跋愎骄z體提取物”在本發(fā)明中用作篩選材料，指在有水和酶存在下，通過(guò)壓榨和分解菌絲體(從培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基的香菇生長(zhǎng)出來(lái))或者含有所述菌絲體的固體培養(yǎng)基本身所制備的提取物。
正如本文所用，“香菇菌絲體提取物”優(yōu)選地由(但不限于)以下方法獲得。將香菇菌種接種在以蔗渣(甘蔗余渣)和去脂稻糠為基礎(chǔ)的固體培養(yǎng)基上以生長(zhǎng)菌絲體，接著將含有已生長(zhǎng)好菌絲體的固體培養(yǎng)基去木質(zhì)化，使大約或者少于30％(重量)的部分通過(guò)12-目篩。向該去木質(zhì)化的固體培養(yǎng)基加入水和一種或多種含有糖酶、蛋白酶或其組合的酶，并將所述固體培養(yǎng)基保持在大約30-55℃溫度壓榨和碾磨。用于本步驟的酶包括但不限于纖維素酶、蛋白酶或葡萄糖苷酶。調(diào)整該步驟壓榨和碾磨的固體培養(yǎng)基，以使至少70％(重量)的蔗渣纖維能夠通過(guò)12-目篩，接著將固體培養(yǎng)基加熱到95℃溫度以確保酶的滅活和滅菌。最后，將所得懸浮液過(guò)濾得到香菇菌絲體提取物。
香菇菌絲體提取物可直接用于篩選材料或者本發(fā)明的免疫治療劑，但是，可以方便地將其濃縮及凍干為粉末以便以多種形式保存和使用。凍干產(chǎn)物為具有吸濕特性的棕色粉末，并有特殊的味道和氣味。
可以將本發(fā)明的香菇菌絲體提取物直接加到從外周血液制備的淋巴細(xì)胞部分。當(dāng)將香菇菌絲體提取物直接加到淋巴細(xì)胞部分時(shí)，它們?cè)诒景l(fā)明的篩選材料中所含有的濃度為優(yōu)選地1ug/ml-100mg/ml，更優(yōu)選地1μg/ml-100μg/ml，最優(yōu)選地10μg/ml-50μg/ml。在加到培養(yǎng)細(xì)胞或者直接加到外周血液之前，優(yōu)選地將本發(fā)明的香菇菌絲體提取物用丙酮滅菌。
使用本發(fā)明篩選材料的篩選方法可以按Takagi等人的方法(臨床免疫學(xué)(Clinical Immunology)，19245-249，1987)進(jìn)行，除了使用篩選材料(諸如，香菇菌絲體提取物)取代IL-2。
因此，本發(fā)明的LAK活性增強(qiáng)篩選方法為用于體外確定適于受試者的、具有LAK活性增強(qiáng)作用材料的方法，包括步驟(a)從受試者分離外周血液以制備淋巴細(xì)胞部分，(b)制備LAK誘導(dǎo)樣品(其是通過(guò)用本發(fā)明的篩選材料處理所述淋巴細(xì)胞部分產(chǎn)生)，和對(duì)照樣品(其是在不存在篩選材料時(shí)產(chǎn)生)，和(c)測(cè)量和比較所述誘導(dǎo)樣品與所述對(duì)照樣品的LAK活性以確定篩選材料對(duì)所述受試者的體外LAK活性增強(qiáng)作用。
為誘導(dǎo)LAK細(xì)胞，從受試者的外周血液分離淋巴細(xì)胞。將肝素加入到來(lái)自受試者的外周血液中，在Ficoll-Conray溶液(比重＝1.077)中通過(guò)密度梯度離心分離位于界面的單核細(xì)胞。經(jīng)分離的單核細(xì)胞用PBS(pH7.4，沒(méi)有Ca和Mg)洗2-3次，然后以1×106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度懸浮于培養(yǎng)基(優(yōu)選地，含有FBS(滅活的胎牛血清)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)和/或抗生素(如果需要的話))中。將該懸浮液轉(zhuǎn)至用自體血清(血漿)在37℃預(yù)包被15分鐘的培養(yǎng)皿中，并在37℃溫育1小時(shí)。將未附著細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞部分予以回收。
LAK誘導(dǎo)樣品由例如以下方法制備。將由上面步驟制備的淋巴細(xì)胞部分以終濃度1×105-1×106個(gè)細(xì)胞/毫升懸浮于培養(yǎng)基中，并將100μl含有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基以1×104-1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度加到每個(gè)孔中。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于所使用效應(yīng)細(xì)胞的活性以及靶細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的敏感性等可以大致確定每孔的細(xì)胞數(shù)。依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，所述懸浮溶液含有香菇菌絲體提取物作為篩選材料，其終濃度范圍為1ng/ml-100mg/ml。
因而，在含有多種濃度(包括零)的本發(fā)明之香菇菌絲體提取物中培養(yǎng)受試者的淋巴細(xì)胞以制備效應(yīng)細(xì)胞。正如本文所用，術(shù)語(yǔ)效應(yīng)細(xì)胞指在培養(yǎng)條件下處理3天的細(xì)胞，并且既包括與LAK活性增強(qiáng)劑共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞(用LAK活性增強(qiáng)劑處理的淋巴細(xì)胞)又包括在沒(méi)有LAK活性增強(qiáng)劑的單獨(dú)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞(在無(wú)提取物條件下處理的淋巴細(xì)胞)。
對(duì)照樣品與LAK誘導(dǎo)樣品的制備方法相同，除了加入無(wú)菌的重組IL-2(rIL-2，2000U/ml)取代篩選材料。
LAK活性能夠由51Cr釋放試驗(yàn)、〔3H〕尿苷試驗(yàn)等確定。就方便性和客觀性而言，優(yōu)選51Cr釋放試驗(yàn)用于本發(fā)明。51Cr釋放試驗(yàn)是體外確定針對(duì)LAK細(xì)胞(誘導(dǎo)自用LAK活性增強(qiáng)劑處理的淋巴細(xì)胞)之靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定方法之一。51Cr釋放試驗(yàn)是一種確定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，其包括步驟(i)將51Cr-標(biāo)記的鉻酸鈉加到靶細(xì)胞中以標(biāo)記靶細(xì)胞，(ii)靶細(xì)胞與用篩選材料刺激的效應(yīng)細(xì)胞(諸如，殺傷T細(xì)胞或LAK細(xì)胞)或用IL-2刺激，作為對(duì)照的效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)，和(iii)測(cè)量從被效應(yīng)細(xì)胞提升(bursted)的靶細(xì)胞釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的51Cr量。
在51Cr釋放試驗(yàn)中用作靶細(xì)胞的次代培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選Daudi細(xì)胞或Raji細(xì)胞。將培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的靶細(xì)胞回收，用51Cr標(biāo)記并且標(biāo)記后接著就分入到微滴定板的每一個(gè)孔中。優(yōu)選使用適于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，例如靶細(xì)胞培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基包括，例如，用血清、抗生素等大致補(bǔ)充的RPMI 1640。
每106個(gè)培養(yǎng)的靶細(xì)胞加入100-150μ Ci51Cr-鉻酸鈉，接著徹底攪拌并在37℃溫育1-2小時(shí)以標(biāo)記靶細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗三次，并接著以1×106個(gè)細(xì)胞/毫升懸浮在含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將標(biāo)記細(xì)胞用用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液(PBS)洗，并在含有10％胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中調(diào)整至終濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/毫升供測(cè)定。將靶細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度加入到微滴定板的每一個(gè)孔中，每孔加50μl。
在確定細(xì)胞毒性的測(cè)定中，對(duì)每個(gè)含有所述靶細(xì)胞的孔進(jìn)一步提供100μl 1N HCl用于最大離解，單獨(dú)的100μl培養(yǎng)基用于自然離解，或者提供效應(yīng)細(xì)胞(在100μl培養(yǎng)基中，密度為1×105-1×106個(gè)細(xì)胞/毫升，用本發(fā)明的香菇菌絲體提取物(在多種濃度下)刺激或者用2000U/ml的IL-2刺激，作為對(duì)照)用于實(shí)驗(yàn)離解。接著，將微滴定板在板式離心機(jī)上以800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集孔底部的細(xì)胞，接著在含5％CO2的溫育箱中37℃溫育3.5小時(shí)。
在51Cr釋放試驗(yàn)中，由下面等式計(jì)算對(duì)靶細(xì)胞的毒性。LAK活性％＝[實(shí)驗(yàn)離解(cpm)－自然離解(cpm)]/[最大離解(cpm)－自然離解(cpm)]×100篩選材料的體外LAK活性誘導(dǎo)能力，可以通過(guò)比較由上面等式計(jì)算出的誘導(dǎo)樣品與對(duì)照樣品的LAK活性來(lái)確定。
在確定最大離解、自然離解和實(shí)驗(yàn)離解的步驟中，將靶細(xì)胞在5％CO2、37℃溫育。本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、所使用的?xì)胞數(shù)量或者其他條件可以大致確定培養(yǎng)周期；例如，在本發(fā)明中為3.5小時(shí)。
釋放到培養(yǎng)上清液中的51Cr的放射性可以用閃爍計(jì)數(shù)儀等測(cè)量。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，各步驟按如下進(jìn)行，盡管作適當(dāng)?shù)男薷膶⒛鼙槐绢I(lǐng)域技術(shù)人員理解。
從溫育的板收集每孔中的培養(yǎng)上清液以在閃爍計(jì)數(shù)儀中測(cè)定放射性。
將在上面的篩選方法中顯示體外LAK誘導(dǎo)活性的香菇菌絲體提取物施用7天，3600毫克/天，以誘導(dǎo)體內(nèi)LAK活性。將由上面的淋巴細(xì)胞回收方法收集的淋巴細(xì)胞部分用于測(cè)定LAK活性百分比，測(cè)定條件與所述LAK誘導(dǎo)樣品的測(cè)定條件相同，結(jié)果顯示體內(nèi)LAK活性增強(qiáng)作用與體外結(jié)果具有正相關(guān)關(guān)系。
以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不應(yīng)認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修改而不背離本發(fā)明的精神。
接著，通過(guò)可變速齒輪泵循環(huán)含培養(yǎng)基混合物，在此期間固體培養(yǎng)基在齒輪處被壓榨和碾磨大約200分鐘以使大約80％(重量)的蔗渣纖維能夠通過(guò)12-目篩。在壓榨和碾磨含培養(yǎng)基混合物時(shí)所述混合物的溫度逐漸上升。接著，將含培養(yǎng)基混合物進(jìn)一步加熱至90℃以確保酶的失活和滅菌，并在90℃靜置30分鐘。將所得含培養(yǎng)基混合物通過(guò)60-篩眼濾布過(guò)濾，得到香菇菌絲體提取物溶液，將該提取物溶液濃縮并接著轉(zhuǎn)化為凍干粉末。
上述制備的香菇菌絲體提取物含有25.3％(重量/重量)碳水化合物(由苯酚-硫酸方法測(cè)定)，19.7％(重量/重量)蛋白質(zhì)(由Lowry法測(cè)定)，2.6％(重量/重量)多酚(由Folin-Denis法測(cè)定，使用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物)。香菇菌絲體提取物進(jìn)一步含有8％粗脂肪，22％粗灰分和大約20％可溶性的無(wú)氮非碳水化合物。
香菇菌絲體提取物的糖組成(％)如下木糖(Xyl)15.2，阿拉伯糖(Ara)8.2，甘露糖(Man)8.4，古洛糖(Gul)39.4，半乳糖(Gal)5.4，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcN)12.0，葡糖醛酸(GluUA)酸(GluUA)11.3。實(shí)施例2 LAK活性的確定最初，在施用香菇菌絲體提取物之前和口服香菇菌絲體提取物(每個(gè)受試者每次1200毫克、每天三次、持續(xù)一周)之后從受試者A、B和C收集外周血液。由下面方法，從這些外周血液分離的淋巴細(xì)胞部分能夠用于篩選本發(fā)明的提取物之體內(nèi)淋巴細(xì)胞激活能力與提取物之體外淋巴細(xì)胞激活能力間的相互關(guān)系。
首先將肝素加入到外周血液，在Ficoll-Conray溶液(比重＝1.077)中通過(guò)密度梯度離心分離位于界面的單核細(xì)胞，接著將分離的單核細(xì)胞用PBS(pH7.4，沒(méi)有Ca和Mg)洗兩次，然后以1×106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度懸浮于含有10％FBS(滅活的胎牛血清)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)中。將由上面方法分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)至用自體血清(血漿)在37℃預(yù)外包15分鐘的培養(yǎng)皿中，隨后在37℃溫育1小時(shí)，接著回收未附著細(xì)胞，作為淋巴細(xì)胞部分。
將傳代培養(yǎng)于含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的靶細(xì)胞(Daudi細(xì)胞)通過(guò)離心回收，并與100-150μCi51Cr-鉻酸鈉(New EnglandNuclear)/106個(gè)細(xì)胞在5％CO2溫育箱中37℃溫育1小時(shí)。將51Cr標(biāo)記的培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗三次，并接著以1×106個(gè)細(xì)胞/毫升懸浮于含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。
將按上述標(biāo)記的50μl等分試樣靶細(xì)胞(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)加到微滴定板的每個(gè)孔中，將100μl 1N HCl進(jìn)一步加到最大離解組(陽(yáng)性對(duì)照)的每個(gè)孔中，將100μl含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)一步加到自然離解組(陰性對(duì)照)的每個(gè)孔中，將用10μg/ml本發(fā)明的香菇菌絲體提取物刺激(或者用rIL-2刺激，2000U/ml，作為對(duì)照)的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)一步加到實(shí)驗(yàn)離解組的每個(gè)孔中(每孔100μl，1×104個(gè)細(xì)胞/孔)。將板在板式離心機(jī)中以800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集孔底部的細(xì)胞，并接著在5％CO2溫育箱中37℃溫育3.5小時(shí)。
通過(guò)SOKEN-PETΣ-96從溫育板收集每孔中的培養(yǎng)上清液，并在γ-閃爍計(jì)數(shù)儀中測(cè)量放射性。
由下面等式計(jì)算LAK活性。
LAK活性％＝[實(shí)驗(yàn)離解(cpm)－自然離解(cpm)]/[最大離解(cpm)－自然離解(cpm)]×100結(jié)果見(jiàn)表1和圖1表1LAK活性受試者試驗(yàn)號(hào) AB C1 施用前 13％27％14％2 使用提取物篩選 21％34％15％(終濃度10μg/ml)3 施用提取物后 40％43％15％工業(yè)應(yīng)用性將香菇菌絲體提取物口服施用于受試者A和B顯示體內(nèi)LAK活性的增強(qiáng)(見(jiàn)表1，試驗(yàn)號(hào)3)。用本發(fā)明提取物刺激分離自受試者A和B的外周血液的淋巴細(xì)胞，用本發(fā)明提取物進(jìn)行體外篩選表現(xiàn)出LAK活性增強(qiáng)作用，并且所述作用與通過(guò)受試者A和B直接口服施用本發(fā)明提取物所獲得的LAK活性增強(qiáng)作用具有正相關(guān)關(guān)系(見(jiàn)表1，試驗(yàn)號(hào)2)。因而，發(fā)現(xiàn)通過(guò)口服施用獲得的本發(fā)明之香菇菌絲體提取物的LAK活性增強(qiáng)作用能夠由體外篩選預(yù)測(cè)。
將香菇菌絲體提取物實(shí)際口服給予受試者C沒(méi)有顯示體內(nèi)LAK活性的增強(qiáng)(見(jiàn)表1，試驗(yàn)號(hào)3)。甚至用本發(fā)明提取物刺激從受試者C的外周血液收集的淋巴細(xì)胞時(shí)，用本發(fā)明提取物體外篩選沒(méi)有顯示LAK活性增強(qiáng)作用(見(jiàn)表1，試驗(yàn)號(hào)2)。該實(shí)施例還證明了通過(guò)口服施用本發(fā)明之香菇菌絲體提取物獲得的LAK活性增強(qiáng)作用能夠由體外篩選預(yù)測(cè)。
因而，發(fā)現(xiàn)通過(guò)口服施用獲得的本發(fā)明的LAK活性增強(qiáng)劑的LAK活性增強(qiáng)作用能夠準(zhǔn)確地從體外篩選結(jié)果預(yù)測(cè)。所以，直接施用含有本發(fā)明之香菇菌絲體提取物的LAK活性增強(qiáng)劑之體內(nèi)LAK活性增強(qiáng)作用，能夠在將所述LAK活性增強(qiáng)劑實(shí)際直接施用前方便地在體外確定。作為結(jié)論，能夠?qū)AK活性增強(qiáng)劑快速有效地給予有可能成功地獲得LAK活性增強(qiáng)作用的受試者，此外，能夠避免將所述LAK活性增強(qiáng)劑無(wú)效地給予沒(méi)有可能成功地獲得LAK活性增強(qiáng)作用的受試者。
而且，在本發(fā)明的方法中，由于LAK活性增強(qiáng)劑的體內(nèi)治療作用能夠在體外篩選，不必從受試者的血液收集大量的淋巴細(xì)胞，從而極大地減輕了受試者的物理應(yīng)激。
權(quán)利要求
1.一種在體外確定適用于受試者的具有LAK活性增強(qiáng)作用的材料的方法，包括以下步驟(a)從受試者分離外周血液以制備淋巴細(xì)胞部分，(b)制備LAK誘導(dǎo)樣品和對(duì)照樣品，其中所述LAK誘導(dǎo)樣品是通過(guò)用本發(fā)明的篩選材料處理所述淋巴細(xì)胞部分產(chǎn)生，所述對(duì)照樣品是在不存在篩選材料下產(chǎn)生，和(c)測(cè)量和比較所述誘導(dǎo)樣品與所述對(duì)照樣品的LAK活性，以確定篩選材料對(duì)所述受試者的體外LAK活性增強(qiáng)作用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的篩選材料是一種香菇菌絲體提取物。
3.一種含有香菇菌絲體提取物的篩選材料，其能夠用于權(quán)利要求1的體外篩選方法，篩選是否能夠在體內(nèi)增強(qiáng)LAK活性。
4.一種由體內(nèi)施用權(quán)利要求2的篩選材料治療受試者的腫瘤的方法。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供廉價(jià)材料和方法,用于篩選顯示抗腫瘤和/或抗癌活性的免疫治療劑。本發(fā)明提供了一種方法用于體外確定適用于受試者的具有LAK活性增強(qiáng)作用的材料,包括步驟:(a)從受試者收集外周血液以制備淋巴細(xì)胞部分,(b)通過(guò)將本發(fā)明的篩選材料加入或不加入到所述淋巴細(xì)胞部分,制備LAK誘導(dǎo)樣品和對(duì)照樣品,(c)測(cè)量所述誘導(dǎo)樣品與所述對(duì)照樣品的LAK活性并比較結(jié)果,以確定篩選材料對(duì)所述受試者的體外LAK活性增強(qiáng)作用。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1332847SQ99815189
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月27日
發(fā)明者淺野健治, 松田由紀(jì)子, 田島裕 申請(qǐng)人:小林制藥株式會(huì)社, 長(zhǎng)岡均