專利名稱：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(ctgf)及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及了生長(zhǎng)因子的領(lǐng)域，更具體地說，涉及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和調(diào)節(jié)CTGFs活性的方法。
生長(zhǎng)因子在發(fā)育組織中刺激靶細(xì)胞增殖、分化和成為組織。生長(zhǎng)因子的作用有賴于它們與特異性受體的結(jié)合，該特異性受體在細(xì)胞內(nèi)刺激了信號(hào)的發(fā)生。生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I，IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF，bFGF)和已知刺激細(xì)胞增殖的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)。
PDGF是在循環(huán)血小板的α顆粒中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)陽(yáng)離子、熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，已知是結(jié)締組織細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的一個(gè)促分裂素和化學(xué)趨化劑。由于該分子的活性，PDGF被認(rèn)為是參與傷口正常愈合和在病理學(xué)上對(duì)如動(dòng)脈粥樣硬化和纖維化等病變起作用的一個(gè)主要因子。PDGF是由α和/或β鏈聯(lián)合組成的二聚體分子。這些鏈形成異型二聚體或同型二聚體，目前分離的所有這些聯(lián)合體都是具有生物活性的。
對(duì)各種生長(zhǎng)因子在組織再生和修復(fù)中作用的研究發(fā)現(xiàn)了PDGF樣蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)具有與PDGF相似的免疫學(xué)和生物學(xué)活性，并能被PDGF特異的抗體所阻斷。
多肽生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子是作為一種重要類型的子宮蛋白質(zhì)出現(xiàn)的，這些蛋白質(zhì)可以在母體子宮和發(fā)育中的胚胎或胎兒之間形成生長(zhǎng)信號(hào)通路。不同物種的研究提示EGF、結(jié)締組織EGF樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、pleitrophin(PTN)、白血病抑制因子、集落刺激因子-1(CSF-1)和TGF-α可能是參與這些過程的子宮生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子中的成員。
CTGF是一個(gè)相對(duì)分子量(Mr)為38,000的富含半胱氨酸的單體肽，它是一個(gè)對(duì)結(jié)締組織細(xì)胞有促分裂和化學(xué)趨化活性的生長(zhǎng)因子。CTGF由細(xì)胞分泌，在與特異性細(xì)胞表面受體的相互作用中是有活性的。CTGF是與PDGF的α或β鏈基因不相關(guān)的一個(gè)基因的產(chǎn)物。它是一個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子家族的成員，該調(diào)節(jié)因子家族包括鼠(也被稱為fisp-12或βIG-M2)和人CTGF、Cyr61(鼠)、Cef10(雞)和Nov(雞)。在序列比較的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)這些家族成員均有模式化結(jié)構(gòu)，包括(1)一個(gè)負(fù)責(zé)結(jié)合的胰島素樣生長(zhǎng)因子區(qū)，(2)一個(gè)負(fù)責(zé)復(fù)合體形成的馮威勒布蘭特(VonWillebrand)因子區(qū)，(3)一個(gè)可能負(fù)責(zé)結(jié)合基質(zhì)分子的血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)片段，和(4)一個(gè)在基質(zhì)蛋白中發(fā)現(xiàn)的C-末端結(jié)構(gòu)，推測(cè)負(fù)責(zé)受體的結(jié)合。
人CTGF(hCTGF)的cDNA序列包含一個(gè)1047個(gè)核苷酸的開放閱讀結(jié)構(gòu)，其起始位點(diǎn)在130位，TGA末端位點(diǎn)在1177位，并編碼一個(gè)349個(gè)氨基酸的肽。在CTGF的cDNA和PDGF的α或β鏈的cDNA之間僅有40％的序列同源性。
hCTGF開放閱讀結(jié)構(gòu)編碼一個(gè)含39個(gè)半胱氨酸殘基的多肽，表明是一個(gè)具有多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的蛋白。肽的氨基末端含有一個(gè)代表分泌蛋白的疏水信號(hào)序列，在氨基酸序列的天冬酰胺殘基28和225位有兩個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。在CTGF多肽和由CEF-10mRNA轉(zhuǎn)錄體編碼的多肽之間總體有45％的序列同源性；當(dāng)推定的可選擇剪接區(qū)被去掉時(shí)同源性達(dá)到52％。
如果有如何肽序列一致，CTGF在抗原性上與PDGF相關(guān)，盡管相關(guān)很少?？筆DGF抗體與PDGF或CTGF的非還原形式具有較高的親和力，而與缺乏生物活性的這些肽的還原形式的親和力小10倍。這表明在PDGF異構(gòu)體和CTGF分子之間有共同的三級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，導(dǎo)致了共同的抗原決定簇。
CTGF的合成和分泌可選擇性地由TGF-β、BMP-2和可能的TGF-β蛋白超家族的其他成員誘導(dǎo)。雖然TGF-β在瓊脂糖中可刺激正常成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，但CTGF單獨(dú)不能在成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)這種特性。然而，CTGF的合成和作用已顯示對(duì)于TGF-β刺激不依賴成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的固著是必需的。
CTGF或其片段，可能在創(chuàng)傷愈合中作為一個(gè)生長(zhǎng)因子起作用。在病理學(xué)上，CTGF被推測(cè)與結(jié)締組織細(xì)胞過度生長(zhǎng)的病理狀態(tài)，如全身性硬化、癌癥、纖維化病變和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。
CTGF多肽的基本生物活性是其促細(xì)胞分裂性，或刺激靶細(xì)胞增殖的能力和其在細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用。在體內(nèi)這種促分裂活性的最終結(jié)果是靶組織的生長(zhǎng)。CTGF也具有化學(xué)趨化活性，即細(xì)胞與特定分子相互作用從而化學(xué)性誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一個(gè)多核苷酸和及其編碼的多肽，該多肽已被鑒定為大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一個(gè)新的重組CTGF，及其活性片斷、類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明的CTGF的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA，以及蛋白質(zhì)的活性類似物和片斷。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)CTGF多肽的方法，該法包括在促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)和隨后回收該蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面提供了與CTGFs結(jié)合的抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞內(nèi)抑制CTGF表達(dá)的多核苷酸，包括一個(gè)在細(xì)胞中與CTGF靶核酸序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列，其中在細(xì)胞中多核苷酸與CTGF靶核酸序列雜交，從而與CTGF表達(dá)的未抑制水平相比，抑制了CTGF的表達(dá)，。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種抑制細(xì)胞中CTGF表達(dá)的方法，包括用含有在細(xì)胞中與CTGF靶核酸序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列的多核苷酸與細(xì)胞接觸，其中多核苷酸抑制細(xì)胞中CTGF的表達(dá)。
而根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了一種在個(gè)體中抑制CTGF表達(dá)的方法，包括給予患者含有在細(xì)胞中與CTGF靶核酸序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列的多核苷酸，多核苷酸以足以抑制患者中CTGF表達(dá)的水平表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CTGF相關(guān)疾患的藥物組合物。該藥物組合物包括一個(gè)藥學(xué)可接受的載體和治療有效劑量的與CTGF核酸結(jié)合的寡核苷酸。
附圖的簡(jiǎn)要說明下列附圖是本發(fā)明實(shí)施方案的舉例圖示，并不意味限制如權(quán)利要求中所包括的本發(fā)明的范圍。


圖1顯示了大鼠CTGF克隆2-4-7的核酸序列和由此核酸序列編碼的氨基酸序列。
圖2顯示了大鼠(rCTGF)(SEQ ID NO2)、人(hCTGF)(SEQ ID NO3)和鼠(mCTGF)(SEQ ID NO4)CTGF多肽的氨基酸序列比較。
圖3顯示了用反義寡聚體處理后CTGF mRNA表達(dá)的Northem印跡(Northern blot)分析。Northem印跡結(jié)果表明靶向CTGF的6個(gè)反義寡聚體均導(dǎo)致靶mRNA的斷裂。穩(wěn)定的CTGF5’裂解片斷(箭頭所指)在印跡上清晰可見(圖3，板A)。作為上樣和轉(zhuǎn)移有效性的內(nèi)參照，印跡用放射性標(biāo)記的鼠GAPDH片斷進(jìn)行探測(cè)(圖3，板B)。
從下面的詳細(xì)描述中將顯現(xiàn)本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。但可以理解的是，詳細(xì)的描述和具體的實(shí)例，在說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，僅僅以舉例的方式給出，因?yàn)閺倪@一詳細(xì)的描述中，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可明白在本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明公開了大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的核酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)。這個(gè)蛋白質(zhì)可能在哺乳類動(dòng)物組織的正常發(fā)育、生長(zhǎng)和修復(fù)中起重要作用。CTGF的生物活性類似于PDGF，但CTGF是與PDGF的α或β鏈基因不相關(guān)的基因的產(chǎn)物。由于CTGF由內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，而兩者均存在于創(chuàng)傷部位，因此CTGF在創(chuàng)傷的愈合中可能是作為一個(gè)生長(zhǎng)因子起作用的。病理學(xué)上，CTGF可能涉及有結(jié)締組織細(xì)胞過度生長(zhǎng)的疾病，如癌癥、纖維化疾病和動(dòng)脈粥樣硬化。CTGF多肽可能在皮膚傷口愈合不全或需要增強(qiáng)正常的愈合機(jī)制的情況下用作治療劑。從治療上說，抗體或抗體分子的片斷也可在CTGF誘導(dǎo)組織過度生長(zhǎng)的疾病中用以中和CTGF的生物活性。
CTGF多肽的一個(gè)基本生物學(xué)活性是其促分裂性，或刺激靶細(xì)胞增殖的能力。這種體內(nèi)促分裂活性的最終結(jié)果是靶組織的生長(zhǎng)。CTGF多肽的第二個(gè)活性涉及多肽或其片斷在細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)生和發(fā)育，包括膠原(ECM)沉積中的作用。CTGF也具有化學(xué)趨化性，即與特定分子相互作用，化學(xué)性地誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。首選地，本發(fā)明的CTGF對(duì)結(jié)締組織細(xì)胞是促進(jìn)分裂和化學(xué)趨化的，但其它類型細(xì)胞對(duì)CTGF多肽也可能有反應(yīng)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“基本上純的”是指基本上不含其它蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其它天然相伴物質(zhì)的CTGFs。在非還原聚丙烯酰胺凝膠上基本上純的CTGF會(huì)產(chǎn)生一個(gè)單一的主要條帶。CTGFs的純度也可由氨基末端氨基酸序列分析確定。只要CTGF的生物學(xué)活性能夠保持(如，在成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)生物學(xué)反應(yīng)，如同采用在本領(lǐng)域普遍的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)所確定的或這里所教授的那樣)，這里所說的CTGFs包括多肽的功能性片斷。本發(fā)明也包括含有CTGF生物學(xué)活性的較小的多肽。另外，更有效的CTGFs，例如通過CTGF多肽cDNA直接誘變位點(diǎn)產(chǎn)生的，也包括在內(nèi)。“重組”CTGFs指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的CTGF多肽；即，從由編碼所需CTGF多肽的外源DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的。“合成”CTGF是由化學(xué)合成制備的CTGF。一個(gè)“編碼”特定CTGF多肽序列的DNA或“核苷酸序列”，是當(dāng)置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯為一個(gè)CTGF多肽的一個(gè)DNA序列。
本發(fā)明提供了編碼CTGF蛋白的多核苷酸。這些多核苷酸包括編碼結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的DNA、cDNA和RNA序列?？梢岳斫獾氖?，編碼所有或部分CTGF的所有多核苷酸也包括在其中，只要它們編碼一個(gè)具有CTGF的促分裂ECM和/或化學(xué)趨化活性的多肽。這些多核苷酸包括天然存在的和有意處理的多核苷酸。例如，CTGF多核苷酸可能接受位點(diǎn)指導(dǎo)的誘變。本發(fā)明的多核苷酸包括簡(jiǎn)并為遺傳代碼的序列。僅有20個(gè)天然氨基酸，大多數(shù)由超過一個(gè)的密碼子確定。因此只要CTGF的氨基酸序列在功能上未改變，所有簡(jiǎn)并的核苷酸序列均包括在本發(fā)明中。
大鼠CTGF(圖1)的cDNA序列包含一個(gè)2350個(gè)核苷酸的開放可閱讀結(jié)構(gòu)，其起始點(diǎn)位于212位點(diǎn)，TAA末端位于1353位點(diǎn)，并編碼一個(gè)346個(gè)氨基酸的肽。
通過“分離的核酸”是指一個(gè)核酸，如一個(gè)DNA或RNA分子，它并不立即與5’和3’側(cè)翼序列相鄰，而在其來源生物體的天然發(fā)生的基因組中時(shí)，正常情況下是立即相鄰的。因此，術(shù)語(yǔ)描述的是，例如，一個(gè)摻入到載體如質(zhì)?；虿《据d體中的核酸；一個(gè)摻入到異源細(xì)胞基因組的核酸(或同源細(xì)胞基因組，但與其天然存在的位點(diǎn)不同)；和一個(gè)以獨(dú)立分子存在的核酸，如一個(gè)通過PCR擴(kuò)增或限制性酶消化產(chǎn)生的DNA片斷，或一個(gè)通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子。該術(shù)語(yǔ)也描述了一個(gè)重組核酸，該核酸可形成一個(gè)編碼可被使用的其他多肽序列的雜交基因的一部分，如在產(chǎn)生一個(gè)融合蛋白時(shí)。
本發(fā)明的核酸分子可用作生產(chǎn)CTGF基因產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)方法的模板(如CTGF RNAs和CTGF多肽)。另外，編碼CTGF多肽(及其片斷)的核酸分子和相關(guān)核酸，如(1)含有與編碼CTGF多肽的核酸或其片斷(如，至少含有10、12、15、20或25個(gè)核苷酸的片斷)互補(bǔ)、或雜交的序列的核酸，不包括在本領(lǐng)域已知的編碼非大鼠CTGF的序列；和(2)含有與編碼CTGF多肽核酸互補(bǔ)序列雜交的序列的核酸，或其片斷(如，至少含有10、12、15、20或25個(gè)核苷酸的片斷)，不包括在本領(lǐng)域已知的編碼非大鼠CTGF的序列；可被用于著重于其雜交特性的方法中。例如，如在下面進(jìn)一步的詳述中所描述的，這些核酸分子可被用于下列方法中合成CTGF核酸的PCR方法，在一個(gè)樣品中檢測(cè)CTGF核酸存在的方法，鑒定編碼新的CTGF家族成員核酸的篩選方法。用于篩選方法的寡核苷酸酸探針在長(zhǎng)度上從10到大約150個(gè)核苷酸。更進(jìn)一步，這些探針在長(zhǎng)度上優(yōu)選10到大約100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地10到大約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
本發(fā)明也包括了鑒定除SEQ ID NO1之外的編碼CTGF家族成員的核酸分子的方法。在這些方法中，一個(gè)含有編碼CTGF多肽的核酸的樣品，如一個(gè)諸如大鼠cDNA文庫(kù)的核酸文庫(kù)，采用CTGF特異探針進(jìn)行篩選，該探針如CTGF特異的核酸探針。CTGF特異的核酸探針是與編碼CTGF多肽的核酸或其互補(bǔ)序列特異性雜交的核酸分子(如，含有DNA或RNA核苷酸的分子，或其組合或修飾)。術(shù)語(yǔ)“CTGF特異性探針”，在本發(fā)明方法的內(nèi)容中，是指與編碼大鼠CTGF多肽的核酸或其互補(bǔ)序列結(jié)合的探針，達(dá)到的可檢測(cè)水平高于編碼其他蛋白質(zhì)的核酸或其互補(bǔ)序列。
本發(fā)明促進(jìn)了CTGF特異性核酸探針的生產(chǎn)。獲得這些探針的方法可根據(jù)圖1顯示的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。這些探針，可含有至少如10、15、25、35、50、100或150個(gè)核苷酸，可以采用幾種標(biāo)準(zhǔn)方法(見，如Ausubel等，見前)的任一方法進(jìn)行生產(chǎn)。例如，優(yōu)選地，探針采用PCR擴(kuò)增的方法產(chǎn)生。在這些方法中，引物的設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于包括CTGF特異氨基酸的CTGF保守序列(見圖1)，得到的PCR產(chǎn)物用作探針以篩選核酸文庫(kù)，如一個(gè)cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明的全長(zhǎng)基因的片斷可被用作一個(gè)cDNA或一個(gè)基因組文庫(kù)的雜交探針，以分離全長(zhǎng)DNA和分離其他具有基因序列高度相似性或生物學(xué)活性相似的DNAs。這種探針具有至少10個(gè)，優(yōu)選地至少15個(gè)，更為優(yōu)選地至少30個(gè)堿基，并可含有如至少50個(gè)或更多的堿基。探針也可用于鑒定與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物相對(duì)應(yīng)的DNA克隆和一個(gè)基因組克隆或含有包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完全基因的克隆。
本發(fā)明，除了在圖1(SEQ ID NO1)中公開的編碼大鼠CTGF的分離核酸分子外，也提供了基本上相似的序列。分離的核酸序列實(shí)際上是相似的，如果(i)它們能夠在此后描述的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與SEQ ID NO1雜交；或(ii)它們編碼與SEQ ID NO1簡(jiǎn)并的DNA序列，這些分離的核酸序列并不編碼已知形式的CTGF(如人CTGF)。簡(jiǎn)并的DNA序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列，但在核苷酸密碼序列上有變化。如這里所使用的，“基本上相似”是指序列與本發(fā)明的序列有相似的一致性?；旧舷嗨频暮塑账嵝蛄锌赏ㄟ^雜交或序列對(duì)比進(jìn)行鑒定。實(shí)際上相似的蛋白質(zhì)序列可通過下列一個(gè)或多個(gè)方法進(jìn)行鑒定蛋白水解消化、凝膠電泳和/或微量測(cè)序。分離編碼CTGF蛋白的核酸分子的一種方法是使用一種天然或人工設(shè)計(jì)的探針采用本領(lǐng)域認(rèn)可的方法(見，如分子生物學(xué)的現(xiàn)代規(guī)程(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel F.M.等(Eds.)綠色印刷公司協(xié)會(huì)(Green Publishing CompanyAssoc.)和John Wiley Interscience，紐約，1989，1992)在基因組基因文庫(kù)中進(jìn)行探測(cè)。令本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員欣慰的是SEQ ID NO1，或其片斷(由至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸組成并至少與靶序列70％互補(bǔ))是一個(gè)特別有用的探針。為此目的的其它特別有用的探針是可與SEQ IDNO1序列雜交的片斷(即，至少由10個(gè)連續(xù)的核苷酸組成并至少與靶序列70％互補(bǔ))。
如果可獲得合適的探針，依靠核苷酸雜交的篩選程序使自任何生物體中分離任何基因序列成為可能。例如，對(duì)應(yīng)于編碼所談?wù)摰鞍椎男蛄兄徊糠值墓押塑账崴崽结?，可被化學(xué)合成。這要求必須知道氨基酸序列的短的、寡肽伸展。編碼蛋白的DNA序列可從遺傳密碼來推算，但必須考慮密碼的簡(jiǎn)并。當(dāng)序列簡(jiǎn)并時(shí)可能進(jìn)行混合的附加反應(yīng)。這包括變性的雙鏈DNA的不均一混合物。為了篩選，雜交優(yōu)選地在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進(jìn)行。當(dāng)cDNA克隆的來源中存在的與感興趣多肽相關(guān)的mRNA序列數(shù)量極低時(shí)，雜交在cDNA克隆的檢測(cè)中特別有用。換句話說，通過使用避免非特異性結(jié)合的選擇性雜交條件，就有可能，例如，通過將靶DNA在混合物中與同其完全互補(bǔ)的單一探針雜交(Wallace等，Nucleic AcidResearch，9879，1981)，而使特異性cDNA克隆放射自顯影。還有價(jià)值的是，這種選擇性雜交探針可被優(yōu)選地用分析上可以檢測(cè)到的試劑標(biāo)記，以促進(jìn)探針的識(shí)別?？捎玫脑噭┌ǖ幌抻诜派浠钚?、熒光染料或能催化形成可檢測(cè)產(chǎn)物的酶。選擇性雜交探針因此可用于分離其他來源的DNA互補(bǔ)拷貝，或篩選這些來源以尋找相關(guān)序列。
關(guān)于與這里公開的特異性核酸序列雜交的核酸序列，雜交可在較少嚴(yán)謹(jǐn)、中度嚴(yán)謹(jǐn)或一致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行。作為寡核苷酸酸雜交的實(shí)例，含有固定的變性核酸的多聚膜首先在含有0.9M NaCl，50mMNaH2PO4，pH7.0，5.0mM Na2EDTA，0.5％SDS，10X Denhardt’s和0.5mg/mL多聚核糖腺苷酸的溶液中，45℃預(yù)雜交30分鐘。然后向溶液中加入大約2×107cpm(特異活性為4×108cpm/μg)的32P末端標(biāo)記的寡核苷酸酸探針。孵育12-16小時(shí)后，室溫下在含有0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl，20mM Tris鹽酸，pH7.8，1mM Na2EDTA)中洗膜30分鐘，然后在平均溫度(Tm)-10℃，在新鮮的1×SET中清洗30分鐘以去除寡核苷酸酸探針。然后將膜暴露于放射自顯影膠片上以檢測(cè)雜交信號(hào)。
在核酸雜交反應(yīng)中，根據(jù)被雜交的核酸的特性，達(dá)到特定嚴(yán)謹(jǐn)度水平所用的條件不同。例如核酸雜交區(qū)域核酸的長(zhǎng)度、互補(bǔ)程度、核苷酸序列的組成(如，GC對(duì)AT的含量)和核酸類型(如，RNA對(duì)DNA)，可在選擇雜交條件中考慮。另外要考慮是否核酸之一是固定的，如在濾過器上。
嚴(yán)謹(jǐn)度條件逐漸增高的實(shí)例如下在大約室溫下2×SSC/0.1％SDS(雜交條件)；在大約室溫下0.2×SSC/0.1％SDS(低的嚴(yán)謹(jǐn)條件)；在大約42℃，0.2×SSC/0.1％SDS(中等嚴(yán)謹(jǐn)條件)；和在大約68℃，0.1×SSC(較高嚴(yán)謹(jǐn)條件)。清洗可僅采用這些條件中的一個(gè)進(jìn)行，如，較高的嚴(yán)謹(jǐn)條件，或以如上所列的順序采用每一個(gè)條件，例如，每個(gè)條件10-15分鐘，重復(fù)任何或所有所列的步驟。但如上所述，最佳的條件要根據(jù)涉及的特定雜交反應(yīng)而變化，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。
這里所使用的“選擇性雜交”是指在中等嚴(yán)謹(jǐn)或較高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳韺W(xué)條件下進(jìn)行的雜交(見，J.Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpring Harbor Laboratory(目前版)，這里整體引用作為參考)，這些條件可以根據(jù)鄰近核苷酸序列之間的一致程度為進(jìn)行的雜交區(qū)分相關(guān)和不相關(guān)的CTGF。同樣，可以理解的是，100個(gè)堿基對(duì)(bps)序列的一個(gè)95bps長(zhǎng)的片斷，與其來源的100bps序列有95％的一致性。如這里所使用的，當(dāng)互相正確排列時(shí)，例如以BLASTN排列，如果在第一個(gè)序列和另一個(gè)序列的堿基之間分別至少70％和優(yōu)選地至少80％或90％相同，則第一個(gè)DNA(RNA)序列至少70％和優(yōu)選地至少80％與另一個(gè)DNA(RNA)序列相同。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“一致性”，是指由與參照多核苷酸(SEQ ID NO1)有相同百分比的堿基組成的多核苷酸序列。例如，與參照多核苷酸至少90％相同的多核苷酸，含有與構(gòu)成參照多核苷酸堿基90％相同的多核苷酸堿基(即，當(dāng)采用本領(lǐng)域通用的標(biāo)準(zhǔn)的排列方式和同源調(diào)整方式(如，NetBlast或GRAIL)，這些序列互相正確排列時(shí))，組成該多核苷酸序列的堿基中可能有10％的不同堿基。
本發(fā)明也涉及與參照多核苷酸不同的多核苷酸，這些變化是無義變化，例如變化并未改變由多核苷酸編碼的氨基酸序列。本發(fā)明也涉及導(dǎo)致在由參照多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)生氨基酸取代、添加、缺失、融合和截?cái)嗟暮塑账岣淖?。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，這些蛋白質(zhì)保留了與參照多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)相同的生物學(xué)作用。
還應(yīng)理解的是，這種探針可被優(yōu)選地用分析上可以檢測(cè)到的試劑標(biāo)記，以促進(jìn)探針的識(shí)別?？捎玫脑噭┌ǖ幌抻诜派浠钚浴晒馊玖匣蚰艽呋蓹z測(cè)產(chǎn)物形成的蛋白質(zhì)。因此探針可用于從其它動(dòng)物來源中分離DNA的互補(bǔ)拷貝，或篩選這些來源以尋找相關(guān)序列。
本發(fā)明也包括大鼠CTGF多肽的片斷，該片斷保留了至少一個(gè)CTGF特異的活性或抗原決定簇。例如，一個(gè)含有如至少8-10個(gè)氨基酸的CTGF多肽片斷，可用作生產(chǎn)CTGF特異抗體的免疫原。該片斷可含有，例如，在CTGF’s中保守的一個(gè)氨基酸序列。除了用作肽免疫原，上述的CTGF片斷可被用在免疫實(shí)驗(yàn)中，如ELISAs，以檢測(cè)樣品中CTGF特異性抗體的存在。
本發(fā)明的CTGF多肽可采用幾種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種獲得。例如，CTGF多肽可在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生(見下)，化學(xué)合成(這限于小的CTGF肽片斷)，或從天然表達(dá)的生物體中純化。
編碼圖1(如，SEQ ID NO1)中成熟蛋白質(zhì)的多核苷酸，可能包括但不限于僅成熟蛋白質(zhì)的密碼序列；成熟蛋白質(zhì)的密碼序列和附加密碼序列如一個(gè)前導(dǎo)序列或原蛋白序列；成熟蛋白質(zhì)的密碼序列(和可選擇地附加密碼序列)和非密碼序列，如內(nèi)含子或成熟蛋白質(zhì)密碼序列的非密碼序列5’和/或3’。
圖1蛋白質(zhì)的片斷、衍生物或類似物可能是(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列殘基被一個(gè)保守的或非保守的氨基酸殘基所取代(優(yōu)選地為保守的氨基酸殘基)，這些取代的氨基酸殘基可能是或不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含一個(gè)取代基團(tuán)，或(iii)其中成熟蛋白質(zhì)與另一個(gè)化合物融合，如一個(gè)增加蛋白質(zhì)半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)其中附加的氨基酸與成熟蛋白質(zhì)融合，如一個(gè)前導(dǎo)或分泌序列或一個(gè)用于成熟蛋白質(zhì)純化的序列或一個(gè)前蛋白序列。從這里所教授的，這些片斷、衍生物和類似物被認(rèn)為是在專業(yè)技術(shù)人員的認(rèn)識(shí)范圍內(nèi)。
因此，術(shù)語(yǔ)“編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的多核苷酸”包含一個(gè)僅包括蛋白質(zhì)密碼序列的多核苷酸，和一個(gè)包括附加密碼和/或非密碼序列的多核苷酸。然后分離的核酸序列和其他蛋白質(zhì)被檢測(cè)其保留本發(fā)明蛋白質(zhì)特有的生物活性的情況，例如，在一個(gè)檢測(cè)CTGF的酶活性的實(shí)驗(yàn)中。這些蛋白質(zhì)包括CTGF的截?cái)嘈问?，和如缺失和插入變型的變異體。
本發(fā)明的多核苷酸可能是DNA形式，包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是密碼鏈或非密碼(反義)鏈。編碼成熟蛋白質(zhì)的密碼序列可能與圖1-6中顯示的密碼序列相同，或可能是不同的密碼序列，其密碼序列是遺傳密碼增加或簡(jiǎn)并的結(jié)果，與圖1的DNA(如，SEQ ID NO1)編碼同一個(gè)成熟蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及此上描述的多核苷酸的變異體，它編碼蛋白質(zhì)的片斷、類似物和衍生物，該蛋白質(zhì)具有圖1(如，SEQ ID NO2)推算的氨基酸序列。多核苷酸的變異體可能是天然發(fā)生的多核苷酸等位基因變異體或非天然發(fā)生的多核苷酸變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼與圖1所示相同的成熟蛋白質(zhì)的多核苷酸，以及該多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖1蛋白質(zhì)的片斷、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體和添加或插入變異體。
如此上所表明的，多核苷酸可能具有圖1(SEQ ID NO1)所示密碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異的密碼序列。如在本領(lǐng)域已知的，一個(gè)等位基因變異是多核苷酸序列的可替換形式，可有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，實(shí)際上并未改變所編碼蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明也包括多核苷酸，其中成熟蛋白質(zhì)的密碼序列可在同一閱讀結(jié)構(gòu)中與一個(gè)多核苷酸序列融合，后者輔助蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌，例如，一個(gè)起控制蛋白質(zhì)從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)是一個(gè)前蛋白，可由宿主細(xì)胞切斷前導(dǎo)序列以形成蛋白的成熟形式。多核苷酸也可能編碼一個(gè)前蛋白，它是成熟蛋白加附加的5’氨基酸殘基。一個(gè)含有前序列的成熟蛋白是一個(gè)前蛋白，它是蛋白的無活性形式。一旦前序列被切除，就成為一個(gè)活性的成熟蛋白質(zhì)。
如果序列間至少有70％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％的一致，本發(fā)明進(jìn)一步涉及與此上描述的序列雜交的多核苷酸，其中的序列是本領(lǐng)域以往未知的。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與此上描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”意味著雜交將僅在至少有95％、優(yōu)選地至少有97％一致的序列間發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與此上描述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)實(shí)際上保留了由圖1中DNA編碼的成熟蛋白質(zhì)的相同生物學(xué)功能或活性。
可以選擇的是，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸可能有至少15個(gè)堿基，優(yōu)選地至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選地至少50個(gè)堿基，如此上描述的，有另外的同一性，且可能保留或不保留活性。例如，這些多核苷酸可能用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探針，以回收多核苷酸或作為一個(gè)PCR引物。
CTGF多肽的表達(dá)編碼CTGF多肽的DNA序列可在體外通過將DNA轉(zhuǎn)到一個(gè)合適的宿主細(xì)胞中而表達(dá)?！八拗骷?xì)胞”是采用本發(fā)明載體的基因工程細(xì)胞(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，載體可能是，例如，一個(gè)克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可在傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基經(jīng)過修飾以適合激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增本發(fā)明的基因。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，是選作表達(dá)的宿主細(xì)胞以往所用的，對(duì)于普通的技術(shù)人員是很清楚的。術(shù)語(yǔ)也包括接受培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的所有后代?？梢岳斫獾氖?，所有后代并不等同于親代細(xì)胞，因?yàn)樵趶?fù)制過程中可能發(fā)生突變。但，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”時(shí)這些后代細(xì)胞是被包括的。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、電造孔法或本領(lǐng)域中其它任何的方法(Davus，L.等，分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in MolecularBiology)，(目前版))有效地將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的核酸可能被應(yīng)用于通過重組技術(shù)來生產(chǎn)CTGFs。因此，例如，多核苷酸可被包含進(jìn)多種表達(dá)載體中的任何一個(gè)以表達(dá)CTGF多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假性狂犬病病毒聯(lián)合體的載體。然而，只要在宿主中可復(fù)制和可生存，所有其他的載體都可被使用。
合適的DNA序列可通過多種方法被插入到載體中。通常，DNA序列可通過本領(lǐng)域已知的方法插入到合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些方法和其它的方法被認(rèn)為是在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)范圍內(nèi)的。編碼CTGFs的DNA序列可在原核生物或真核生物體內(nèi)表達(dá)。在原核生物內(nèi)表達(dá)含有真核生物密碼序列的DNA序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)為人熟知。宿主包括微生物、酵母和哺乳動(dòng)物機(jī)體。
編碼CTGF的DNA序列可通過將DNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行體外表達(dá)?！八拗骷?xì)胞”是載體可在其中繁殖并表達(dá)其DNA的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括接受培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的任何后代。可以理解的是，所有后代并不等同于親代細(xì)胞，因?yàn)樵趶?fù)制過程中可能發(fā)生突變。但，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”時(shí)，這些后代包括在內(nèi)。
編碼CTGF的DNA序列可在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。在原核生物內(nèi)表達(dá)含有真核生物密碼序列的DNA序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)為人熟知。宿主包括微生物、酵母和哺乳動(dòng)物機(jī)體。
一個(gè)cDNA表達(dá)文庫(kù)，如λgtll，可以采用CTGF特異的抗體或與CTGF交叉反應(yīng)的PDGF抗體來間接的篩選具有至少一個(gè)抗原決定簇的CTGF肽。這些抗體可以是多克隆或單克隆來源的，用來檢測(cè)指示CTGF cDNA存在的表達(dá)產(chǎn)物。
能夠在宿主中表達(dá)和復(fù)制的生物學(xué)功能性病毒和質(zhì)粒DNA載體在本領(lǐng)域是已知的。這些載體用來?yè)饺氡景l(fā)明的DNA序列。通常，含有啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體用于與宿主的連接，該啟動(dòng)子序列可促進(jìn)插入的真核基因序列的有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體典型地含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)、一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子，以及能夠提供轉(zhuǎn)化細(xì)胞顯性選擇的特異基因。
當(dāng)RNA聚合酶將兩個(gè)密碼序列轉(zhuǎn)錄為一個(gè)單一mRNA，然后翻譯成一個(gè)具有來源于兩個(gè)密碼序列的氨基酸的單一多肽時(shí)，一個(gè)密碼序列是“可操作地聯(lián)系到”另一個(gè)密碼序列的。只要表達(dá)序列最終可產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)，密碼序列不必相互連接。
特定蛋白質(zhì)的一個(gè)DNA“密碼序列”或編碼該蛋白質(zhì)的“核苷酸序列”，是當(dāng)處于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，可轉(zhuǎn)錄和翻譯成一個(gè)蛋白質(zhì)的DNA序列。一個(gè)“啟動(dòng)子序列”是一個(gè)在細(xì)胞中能夠結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3’方向)0密碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。啟動(dòng)子是DNA序列的一部分。這個(gè)序列區(qū)在其3’末端有一個(gè)起始密碼子。啟動(dòng)子序列包括最小數(shù)目的堿基，其啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄必需的元件在本底之上的可檢測(cè)水平。然而，在RNA聚合酶與序列結(jié)合且轉(zhuǎn)錄自起始密碼子(帶有啟動(dòng)子的3’末端)開始后，轉(zhuǎn)錄以3’方向向下游進(jìn)行。在啟動(dòng)子序列中可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(方便地用核酸酶S1作圖確定)和負(fù)責(zé)與RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)(交感序列)。
除了在本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體如細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)外，還可使用桿狀病毒載體。在這些無脊椎動(dòng)物病毒表達(dá)載體中表達(dá)外源基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以表達(dá)較高水平的重組蛋白，該蛋白在抗原性和功能上與其天然對(duì)象是相似的。桿狀病毒載體和與載體聯(lián)合使用的合適的昆蟲宿主細(xì)胞將被本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知。宿主細(xì)胞表達(dá)的本發(fā)明多肽的分離和純化可以通過任何傳統(tǒng)的方法，如初步的色譜分離和那些涉及使用單克隆或多克隆抗體的免疫學(xué)分離。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行。宿主為原核細(xì)胞時(shí)，如大腸桿菌，可攝取DNA的感受態(tài)細(xì)胞可從指數(shù)生長(zhǎng)后收獲的細(xì)胞中制備，然后通過本領(lǐng)域已知的步驟用CaCl2法處理?？梢赃x擇的是，可用MgCl2或RbCl。
所用宿主為真核細(xì)胞時(shí)，可使用各種DNA轉(zhuǎn)移方法。這些方法包括DNA轉(zhuǎn)染，通過磷酸鈣沉淀法、傳統(tǒng)的機(jī)械方法如微注射、插入包被于脂質(zhì)體的質(zhì)粒，或使用病毒載體。
真核宿主細(xì)胞也包括酵母。例如，通過將DNA插入到合適的表達(dá)載體中，并將產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，DNA即可在酵母中表達(dá)。許多在酵母中表達(dá)外源基因的穿梭載體已經(jīng)被報(bào)道(Heinemann，J等，Nature，340205，1989；Rose，M.等，Gene，60237，1987)。
CTGF抗體本發(fā)明提供了特異地與CTGF多肽或其片斷反應(yīng)的抗體。盡管這個(gè)多肽可能與PDGF或CTGF抗體有交叉反應(yīng)，但不是所有的CTGF抗體都與PDGF反應(yīng)，也不是所有CTGF抗體都會(huì)與CTGFs反應(yīng)。還提供了主要由不同抗原決定簇特異的單克隆抗體匯集而成的抗體，及獨(dú)特的單克隆抗體制劑。單克隆抗體可用本領(lǐng)域熟知的方法(Kohler等，Nature256495，1975；分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel等，主編，1989)，自含有蛋白片斷的抗原制備而成。也包括采用本領(lǐng)域中普遍的方法(見Harlow和Lane，1988，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，紐約，目前版)制備的本發(fā)明CTGFs的多克隆抗體。CTGFs特異的單克隆抗體可以，例如，通過篩選與CTGF多肽反應(yīng)、但不與PDGF反應(yīng)的雜交瘤上清液來選擇。針對(duì)本發(fā)明相應(yīng)的CTGFs產(chǎn)生的抗體，可以通過直接將多肽注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)，或通過將多肽給予一個(gè)動(dòng)物，優(yōu)選地非人類，而獲得。這樣獲得的抗體然后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，即使僅編碼多肽的一個(gè)片斷的序列也可用來產(chǎn)生與來源多肽結(jié)合的抗體。這些抗體然后可以用來從表達(dá)該多肽的細(xì)胞中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，任何通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供抗體產(chǎn)生的技術(shù)都可使用。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler等，Nature256495，1975)、trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472)，和EBV雜交瘤技術(shù)，以產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等，1985，在單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(yè))。
所描述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可被采用以生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性肽產(chǎn)物的單鏈抗體。生產(chǎn)和使用針對(duì)CTGF多肽或其片斷的“人”和“人化”抗體應(yīng)用于診斷和治療是另外包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。人化抗體是具有與根源抗體(如，典型地鼠源性)相同的結(jié)合特異性，但增加了人的特性的抗體或其片斷。人化抗體可以通過鏈移動(dòng)或噬菌體顯示技術(shù)來獲得。例如，由CTGF特異的非人抗體的一條重鏈或一條輕鏈可變區(qū)組成的多肽，與人互補(bǔ)的(輕或重)鏈可變區(qū)的組分結(jié)合。所需抗原特異的雜交配對(duì)被選擇。來自所選配對(duì)的人鏈然后被人的互補(bǔ)可變區(qū)(重或輕)組分結(jié)合，人化抗體多肽二聚體然后可以抗原結(jié)合特異性被選擇。這個(gè)技術(shù)在美國(guó)專利5,565,332中描述或可經(jīng)商業(yè)渠道獲得(Scotgene，Scotland或Oxford Molecular，PaloAlto，CA，USA)。此外，描述在轉(zhuǎn)基因鼠中生產(chǎn)“人”抗體(即，具有人固有區(qū)序列的新生抗體)的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)5,545,806和美國(guó)專利號(hào)5,569,825)也可被采用以生產(chǎn)“人”CTGF抗體或抗體片斷，或者也可商業(yè)訂購(gòu)(GenPharm International，Inc.，Mountain View，CA，USA)。
產(chǎn)生的抗本發(fā)明多肽的抗體可被用于從其他生物體和標(biāo)本中篩選的相似CTGF多肽。這種篩選技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。
治療的方法發(fā)明也公開了一種通過用有效量的CTGF反應(yīng)劑治療疾病部位以緩解疾病的方法，這些疾病以細(xì)胞增殖紊亂為特征。術(shù)語(yǔ)“緩解”表示在接受治療的患者中減輕疾病誘導(dǎo)反應(yīng)的有害效應(yīng)。當(dāng)疾病是由于細(xì)胞過度生長(zhǎng)時(shí)，CTGF多肽的拮抗劑對(duì)于減少可與細(xì)胞上CTGF特異受體結(jié)合的生長(zhǎng)因子的量是有效的。這種拮抗劑可以是一個(gè)CTGF特異的抗體或其功能片斷(如Fab，F(xiàn)(ab’)2)。治療需要將拮抗劑與疾病的部位接觸。當(dāng)細(xì)胞增殖性疾病是由于細(xì)胞生長(zhǎng)量減少時(shí)，具有刺激作用的CTGF反應(yīng)劑與疾病的部位接觸。例如，TGF-β就是一個(gè)這樣的反應(yīng)劑。其它藥物將被本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員知道。
這里使用的“治療”、“治療措施”等是指獲得所需要的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。效果可能是預(yù)防性的，即完全或部分地防止疾病或其體征或癥狀，和/或可能是治療性的，即部分或完全治愈疾病和/或由于疾病引起的不利效應(yīng)。這里使用的“治療”覆蓋了在哺乳動(dòng)物中對(duì)疾病的任何治療措施，包括(a)在可能易感的患者中防止疾病的發(fā)生，但使用時(shí)疾病尚未被診斷；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解或減輕疾病，如引起疾病回退。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖性疾病”指以細(xì)胞數(shù)目異常為特征的狀態(tài)。該病變可包括肥大性(在一個(gè)組織內(nèi)細(xì)胞的持續(xù)倍數(shù)增加導(dǎo)致細(xì)胞群體的過度生長(zhǎng))和萎縮性(在一個(gè)組織內(nèi)細(xì)胞缺少或缺失)細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞過多內(nèi)流或遷移到機(jī)體的一個(gè)部位。細(xì)胞群體不必是轉(zhuǎn)化的、致瘤的或惡性的細(xì)胞，也可包括正常的細(xì)胞。例如，CTGFs可涉及在動(dòng)脈壁的內(nèi)膜層誘導(dǎo)增殖性損害的病理病變，而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明的CTGF多肽抑制劑或拮抗劑將用于干預(yù)體內(nèi)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的CTGF活性，而不是試圖降低該病變的危險(xiǎn)因素，如降低血壓或降低升高的膽固醇水平。CTGF多肽拮抗劑也可用于治療與結(jié)締組織過度生長(zhǎng)有關(guān)的其它疾病，如各種纖維化病變，包括硬皮病、關(guān)節(jié)炎和肝硬化。
與CTGF有關(guān)的疾病、紊亂和狀態(tài)包括但不限于，急性或多次創(chuàng)傷導(dǎo)致的過度瘢痕，創(chuàng)傷包括手術(shù)或放射治療，如腎、肺、肝、眼、心和皮膚的器官纖維化，包括硬皮病、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕。CTGF的異常表達(dá)與一般的組織瘢痕、腫瘤樣皮膚生長(zhǎng)物和血管的持續(xù)性瘢痕有關(guān)，導(dǎo)致血液運(yùn)輸能力損害、高血壓、機(jī)能性增生等。還與CTGF有關(guān)的是各種由血管內(nèi)皮細(xì)胞增生或游走導(dǎo)致的疾病，如癌癥，包括皮膚纖維瘤，與內(nèi)皮細(xì)胞異常表達(dá)有關(guān)，乳腺癌desmosplasis、血管脂瘤和血管平滑肌瘤。其他相關(guān)的病變包括動(dòng)脈粥樣硬化和全身性硬化，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑、炎性腸病、克隆氏病，在動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癌癥和其他疾病中起中心作用的血管發(fā)生和其他增殖性過程，青光眼中的新血管形成，由于疾病或損傷引起的炎癥，包括關(guān)節(jié)炎癥，腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，間質(zhì)性疾病，皮膚性疾病，關(guān)節(jié)炎，包括慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈硬化，糖尿病，包括糖尿病性腎病，高血壓，和其他腎臟疾患，和由化療、放療、透析和同種移植和移植排斥導(dǎo)致的纖維化。
細(xì)胞增殖性疾患也包括纖維增殖性疾患，例如其中涉及細(xì)胞外基質(zhì)的過度生長(zhǎng)。這些病變包括但不限于肝纖維化、腎纖維化、動(dòng)脈硬化、心臟纖維化、粘連和手術(shù)瘢痕。
這些由CTGF調(diào)節(jié)的疾病、紊亂或病痛，包括創(chuàng)傷性損害或包括關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥和其他骨骼疾患的病變和燒傷后的組織修復(fù)。由于這些問題是因?yàn)槌衫w維細(xì)胞、干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或損傷部位的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)反應(yīng)不足引起的，添加刺激或誘導(dǎo)這些細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性劑是有益的。這里使用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”或“誘導(dǎo)反應(yīng)”是指激活、刺激、增強(qiáng)、啟動(dòng)和或維持對(duì)于上述的形成任何組織、修復(fù)過程或發(fā)育必須的細(xì)胞機(jī)制或過程。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”表示一個(gè)已存在的病變或生物學(xué)狀態(tài)的調(diào)整。如上所述的病變的調(diào)節(jié)包括增加或降低影響已存在病變的決定因素。例如，給予CTGFs可用來增強(qiáng)。
本發(fā)明也公開了一種治療以細(xì)胞增殖性異常為特征的疾病的方法，該法通過采用治療有效量的CTGF反應(yīng)劑治療該病變。術(shù)語(yǔ)“治療”表示在接受反應(yīng)劑的患者中減輕病變的有害效應(yīng)。當(dāng)疾病是由于細(xì)胞過度生長(zhǎng)時(shí)，CTGF多肽的拮抗劑對(duì)于減少可與細(xì)胞上CTGF特異受體結(jié)合的生長(zhǎng)因子的量是有效的。這種拮抗劑可以是一個(gè)CTGF特異的抗體或其功能片斷(如Fab，F(xiàn)(ab)2)。治療需要將拮抗劑與疾病的部位接觸或傳輸?shù)讲∽儾课?。?dāng)細(xì)胞增殖性疾病是由于細(xì)胞生長(zhǎng)量減少時(shí)，具有刺激作用的CTGF反應(yīng)劑與疾病的部位接觸或傳輸?shù)讲∽儾课?。例如，TGF-β(或TGF-β超家族的其它成員)就是一個(gè)這樣的反應(yīng)劑。其它藥物將被本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員知道。
在本發(fā)明的方法中所用的治療藥物可通過注射或長(zhǎng)時(shí)間逐漸輸注的方法胃腸外給予。給藥可以經(jīng)靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、或經(jīng)皮。
胃腸外給藥的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和可注射的有機(jī)酯類如油酸乙酯。水性載體包括水、乙醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外媒介包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏靜脈注射媒介包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏葡萄糖的液體)，等。也可以有防腐劑和其他添加物，例如，抗微生物、抗氧化劑、絡(luò)合劑和惰性氣體等。
在本發(fā)明中包含的另一種治療方法涉及將藥物或含有本發(fā)明的CTGFs的組合物通過任何傳統(tǒng)的給藥技術(shù)(例如但不限于，局部注射、吸入，或全身給藥)直接給予具有纖維化性、硬化性或細(xì)胞增殖性疾患，動(dòng)脈粥樣硬化的患者。如上所述，應(yīng)用CTGF加速創(chuàng)傷的愈合，可誘導(dǎo)組織修復(fù)或再生的形成，或子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)和發(fā)育。試劑、制劑或成分也可通過任何這里所描述的方法或本領(lǐng)域任何已知的輸送、靶向和表達(dá)編碼CTGF的基因的方法，靶向特異的細(xì)胞或受體。調(diào)節(jié)纖維化性疾患、硬化性疾患、細(xì)胞增殖性疾患、動(dòng)脈粥樣硬化或創(chuàng)傷愈合的試劑、制劑或成分的實(shí)際劑量依賴許多因素，包括生物體的大小和健康狀況。但本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員可用下面教材所描述的方法和技術(shù)確定臨床劑量(Spilker B.，臨床研究的指導(dǎo)和發(fā)展草案，RavenPress Books，Ltd.，紐約，1984，7-13頁(yè)，54-60頁(yè)；Spilker B.，臨床實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，Raven Press，Ltd.，紐約，1991，93-101頁(yè)；Craig C.，和R.Stitzel，eds.，現(xiàn)代藥學(xué)，2d ed.，Little，Brown和Co.，波士頓，1986，127-33頁(yè)；T.Speight，ed.，Avery’s藥物治療臨床藥學(xué)和治療學(xué)的原理和實(shí)踐，3d ed.，Williams和Wilkins，巴爾的摩，1987，50-56頁(yè)；R.Tallarida，R.Raffa和P.McGonigle，基本藥學(xué)原理，Spring-Verlag，紐約，1988，18-20頁(yè))或確定使用的合適劑量；但一般來說，可以任何藥學(xué)可接受的載體每天給予一個(gè)成人含有大約0.5μg/ml～500μg/ml終濃度范圍的藥物。
用于治療用途的多肽在另一個(gè)實(shí)施方案中，在患者中抑制CTGF表達(dá)的方法，包括給予可抑制這種表達(dá)的治療有效量的多肽。術(shù)語(yǔ)“患者”指任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。因此，當(dāng)細(xì)胞增殖性病變與CTGFs的表達(dá)有關(guān)時(shí)，直接干擾CTGF轉(zhuǎn)錄為RNA或CTGF mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的治療方法是可能的。如這里所使用的“CTGF靶向核酸序列”包括了任何編碼CTGF蛋白的核酸，或其片斷。例如，可以與CTGF轉(zhuǎn)錄體RNA結(jié)合或?qū)⑵淝袛嗟姆戳x核酸或核酸代酶，也包括在本發(fā)明內(nèi)。反義RNA或DNA分子特異性地與靶基因RNA信息結(jié)合，中斷該基因產(chǎn)物的表達(dá)。反義鏈與轉(zhuǎn)錄體RNA結(jié)合形成一個(gè)不能被細(xì)胞翻譯的雙鏈分子。優(yōu)選的是大約15-25個(gè)核苷酸的反義對(duì)核苷酸，因?yàn)樗鼈兒苋菀妆缓铣桑⒂信c反義RNA分子一樣的抑制效應(yīng)。另外，化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，如鐵連接的乙二胺四乙酸(EDTA-Fc)可與反義核苷酸相附著，導(dǎo)致雜交部位RNA的斷裂。這些和其它一些應(yīng)用反義在體內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄的方法在本領(lǐng)域中是為人熟知的(如，De Mesmaeker等，1995。多核苷酸和肽核酸系統(tǒng)的主鏈修飾。Curr.Opin.Struct.Biol.5343-355；Gewirtz，A.M.等，1996b.促進(jìn)反義寡脫氧核苷酸的輸送幫助反義輸送到目的地；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.933161-3163；Stein，C.A.1996年G-tetrads的討論。開發(fā)反義的潛能除寡脫氧核苷酸硫逐磷酸酯之外。Chem.andBiol.3319-323)。
這里使用的“轉(zhuǎn)錄體RNA”是含有編碼一個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的核苷酸序列的RNA。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄RNA是信使RNA(mRNA)。這里所使用的“mRNA”是一個(gè)指定一個(gè)或多個(gè)多肽鏈氨基酸序列的單鏈RNA分子。另外，轉(zhuǎn)錄體RNA可以是異源性核RNA(hnRNA)或偽裝RNA。如這里所使用的術(shù)語(yǔ)“hnRNA”，代表RNA聚合酶II的主要轉(zhuǎn)錄體，包括所有信使RNA的前體，其中內(nèi)含子通過剪接去掉了。hnRNA廣泛地進(jìn)行處理以產(chǎn)生mRNA，后者被外運(yùn)到合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞漿中。這個(gè)過程包括在5’末端添加5’連接的7-甲基-鳥苷酸“帽”，在3’末端添加一個(gè)腺苷酸基團(tuán)的序列，多個(gè)A“尾”，以及去掉任何內(nèi)含子和一起剪接外顯子。這里所使用的“偽裝RNA”是以無活性形式存在的任何mRNA的形式。更為特殊的是，在形態(tài)發(fā)生的早期偽裝RNA構(gòu)成了未偽裝(去抑制)的蛋白合成的母系信息儲(chǔ)備。
反義核酸是與一個(gè)特異的轉(zhuǎn)錄體RNA分子的至少一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子(Weintraub，科學(xué)的美國(guó)，26240，1990)。在細(xì)胞中，反義核酸與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄體RNA雜交，形成一個(gè)雙鏈分子。例如，反義核酸干擾mRNA的翻譯，因?yàn)榧?xì)胞不能翻譯雙鏈的mRNA。涉及反義治療方法的機(jī)制包括，例如雜交捕獲機(jī)制(Miller等，抗癌藥物設(shè)計(jì)2117-128，1987)或通過細(xì)胞酶核糖酶H(Rnase H)裂解雜交的RNA(Walder，R.等，PNAS USA855011-5015，1988和Stein等，核酸研究163209-3221，1998)。優(yōu)選的反義寡聚體大約為15個(gè)核苷酸，因?yàn)樗鼈円子诤铣桑冶却蠓肿虞^少產(chǎn)生問題。應(yīng)用反義方法在體外抑制基因翻譯是本領(lǐng)域中已知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172289，1988)。
應(yīng)用多核苷酸阻止轉(zhuǎn)錄被認(rèn)為是三重策略，因?yàn)楣丫垠w纏繞雙螺旋DNA，形成一個(gè)三鏈螺旋體。因此，可以設(shè)計(jì)三重化合物以在所選擇的基因上識(shí)別一個(gè)特定的位點(diǎn)(Maher等，Antisense Res.and Dev.，1(3)227，1991；Helene C.，抗癌藥物設(shè)計(jì)，6(6)569，1991.)核酸代酶是能夠特異性地裂解其它單鏈RNA的RNA分子，其裂解方式類似于DNA限制性內(nèi)切酶。通過修飾編碼這些RNAs的核苷酸序列，有可能控制分子識(shí)別RNA分子內(nèi)特異性的核苷酸序列并裂解之。(Cech，J.Amer.Med.Assn.，2603030，1988)此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是，由于它們是序列特異性的，因此僅具有特殊序列的mRNAs被失活。
有兩類基本核酸代酶稱為，四膜蟲型(Hasselhoff，Nature，334585，1988)和“錘頭”型。四膜蟲型核酸代酶識(shí)別4個(gè)堿基長(zhǎng)度，而“錘頭”型核酸代酶識(shí)別11-18個(gè)堿基長(zhǎng)度。識(shí)別序列越長(zhǎng)，序列專有地出現(xiàn)在靶mRNA種屬中的可能性越大。因此，錘頭型核酸代酶對(duì)于失活特異性mRNA種屬是優(yōu)于四膜蟲型核酸代酶的，18堿基的識(shí)別序列優(yōu)于較短的識(shí)別序列。
這些和其它用反義方法在體內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄是本領(lǐng)域內(nèi)廣為人知的(如，De Mesmaeker，等，1995.Backbone modifications inpolynucleotides and peptide nucleic acid systems.Curr.Opin.Struct.Biol.5343-355；Gewirtz，A.M.，等，1996b.Facilitating delivery of antisenseoligodeoxynucleotidesHelping antisense deliver on its promise；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.933161-3163；Stein，C.A.A discussion of G-tetrads1996.Exploiting the potential of antisensebeyond phosphorothioateoligodeoxynucleotides.Chem.and Biol.3319-323)。
用于抑制CTGF表達(dá)的反義多核苷酸序列可以得到，例如通過比較直系同源基因的序列或直系同源基因的轉(zhuǎn)錄物，并鑒定直系同源序列中的高度保守區(qū)。從而，對(duì)編碼大鼠、人和小鼠CTGF的核酸序列中的高度保守區(qū)的鑒定可用于設(shè)計(jì)抑制CTGF表達(dá)的多核苷酸。如這里所用的，一個(gè)“直系同源序列”是指在種屬間其序列同源性是保留或保守的序列。如果來自不同生物的兩種基因序列起源于他們最接近的祖先的同一基因，那么它們是直系同源的。例如，所有脊椎動(dòng)物球蛋白基因是同源的，因?yàn)樗鼈儊碓从谠缙诩棺祫?dòng)物的一個(gè)單一球蛋白基因。因此，人和馬的球蛋白基因及按其編碼的轉(zhuǎn)錄物是直系同源的，因?yàn)樗麄冇泄餐淖嫦炔⒕哂酗@著的序列同源性。于是，多核苷酸可被設(shè)計(jì)成含有的核酸序列，例如，與從直系同源序列中鑒定的保守序列全部或部分互補(bǔ)。
用于本方法的反義寡核苷酸實(shí)例包括S10839 5’-tga cct cag cua gua ccu guc uuu c-3’(SEQ ID NO7)；
S10840 tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g(SEQ ID NO8)；S10841 ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u(SEQ ID NO9)；S10842 tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c(SEQ ID NO10)；S10843 tca ctc agg uua cag uuu cca cug c(SEQ ID NO11)；和S10844 ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a(SEQ ID NO12).
典型的反義寡聚物抑制可測(cè)得的CTGF mRNA水平約50-100％、65-100％、70-100％或80-100％，如所述實(shí)例顯示的。
本發(fā)明中確定的反義寡聚物識(shí)別的靶序列實(shí)例包括3’-acu gga guc gau cau gga cag aaa g-5’ (SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c (SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a (SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g (SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g (SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u (SEQ ID NO18)可以理解，關(guān)于SEQ ID NOs7-12，當(dāng)靶序列是DNA或RNA序列時(shí)，u可被t替換。進(jìn)一步地，關(guān)于SEQ ID NOs13-18，當(dāng)靶序列是DNA序列時(shí)，t可被替換為u。此外，可以理解的是，只要結(jié)合到靶部位的反義寡核苷酸，如這里的實(shí)例所顯示的在大約50-100％、65-100％、70-100％或80-100％范圍內(nèi)抑制可測(cè)定的CTGF mRNA水平時(shí)，典型的靶在長(zhǎng)度上可以短一些或長(zhǎng)一些，。核酸序列的相似程度可用本領(lǐng)域熟知的步驟和算法確定。這些步驟和算法包括，例如BLAST程序(BasicLocal Alignment Search Tool在the National Center for BiologicalInformation)，ALIGN，AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences)，AMPS(Protein Multiple Sequence Alignment)，ASSET(Aligned SegmentStatistical Evaluation Tool)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(BiologicalSequence Comparative Analysis Node)，BLIMPS(Blocks IMProvedSearcher)，F(xiàn)ASTA，Intervals&Points，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，F(xiàn)NAT(Forced Nucleotide AlignmentTool)，F(xiàn)ramealign，F(xiàn)ramesearch，DYNAMIC，F(xiàn)ILTER，F(xiàn)SAP(FristenskySequence Analysis Package)，GAP(Global Alignment Program)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(Sensitive Sequence Comparison)，LALIGN(Local Sequence Alignment)，LCP(Local Content Program)，MACCAW(Multiple Alignment Construction&Analysis Workbench)，MAP(Multiple Alignment Program)，MBLKP，MBLKN，PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)，SAGA(Sequence Alignmentby Genetic Algorithm)和WHAT-IF。
在選擇特定多核苷酸的優(yōu)選長(zhǎng)度時(shí)，應(yīng)考慮各種因素以獲得最優(yōu)特性。一方面，本發(fā)明的多核苷酸長(zhǎng)度至少為15bp，優(yōu)選長(zhǎng)度大約15至大約100bp。更優(yōu)選地，多核苷酸長(zhǎng)度大約為15至大約80bp，再優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸長(zhǎng)度為大約15至大約60bp。較短的多核苷酸如10-15mers以下者，雖然有較高的細(xì)胞通透性，但基因特異性較低。相反，雖然20-30個(gè)堿基的較長(zhǎng)多核苷酸有較好的特異性，但它們吸收進(jìn)細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)顯示下降。見Stein等，“寡脫氧核苷酸基因表達(dá)的反義抑制劑”Cohen主編，McMillan Press，London(1998)。RNA靶序列轉(zhuǎn)錄的可達(dá)到性也是重要的，因此，靶RNAs中的環(huán)形區(qū)和直系同源序列提供了有希望的靶標(biāo)。本公告中的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括，自然界中發(fā)現(xiàn)的寡核酸部分，如DNA或RNA的脫氧核糖核酸和核糖核酸結(jié)構(gòu)，以及人工合成的能與自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸結(jié)合的類似物。重要的是，本發(fā)明的多核苷酸包括自然存在的寡核苷酸及其任何修飾和取代的形式以增加所需要的特性，如增加細(xì)胞攝取、增加與靶序列的親和力和在核酸酶存在的情況下增加寡核苷酸的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的多核苷酸可基于磷酸二酯鍵連接的核糖核酸或脫氧核糖核酸單體，或是通過甲基磷酸鹽、硫逐磷酸酯(phosphorothioate)或其它鍵連接的類似物。它們也包括改變了堿基結(jié)構(gòu)或其它修飾，但仍保留了與自然存在的轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)構(gòu)結(jié)合能力的單體部分。這些多核苷酸可用本領(lǐng)域熟知的方法制備，例如應(yīng)用商業(yè)銷售的機(jī)器和試劑，如可從Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)得到的。例如對(duì)靶轉(zhuǎn)錄特異的寡核苷酸是按照標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)合成的。硫逐磷酸酯修飾的DNA多核苷酸典型地是在可從若干廠家得到的自動(dòng)DNA合成儀上合成的。這些設(shè)備能夠合成毫微摩爾數(shù)量的100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸。用現(xiàn)代設(shè)備合成的較短多核苷酸通常不用進(jìn)一步純化即適用。如果必要，多核苷酸可用聚丙烯酰胺凝膠電泳或反相色譜法進(jìn)行純化。見Sanbrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Vol.2，11章，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
磷酸二酯連接的多核苷酸對(duì)血清和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶的作用特別敏感，因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是硫逐磷酸酯或甲基磷酸鹽連接的類似物，它們顯示是耐核酸酶的。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可容易地選擇其它連接用于本發(fā)明。這些修飾也可設(shè)計(jì)用以改善多核苷酸的細(xì)胞攝取和穩(wěn)定性。
用于給予多核苷酸的合適載體包括，例如載體(vector)、抗體、藥學(xué)成分、結(jié)合或歸巢蛋白，或病毒傳遞系統(tǒng)以將序列富集進(jìn)靶細(xì)胞或組織。例如，本發(fā)明的多核苷酸可被偶聯(lián)到一個(gè)識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤組織的結(jié)合蛋白上。給藥后，本發(fā)明的多核苷酸可被靶向到受體細(xì)胞或組織，使得發(fā)生例如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、G-蛋白偶聯(lián)的受體、腫瘤抑制蛋白和細(xì)胞凋亡啟動(dòng)蛋白的表達(dá)增高。
應(yīng)用重組的表達(dá)載體如嵌合病毒或膠態(tài)分散系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)反義、三倍體物質(zhì)、核酸代酶、競(jìng)爭(zhēng)性抑制物和類似物的傳遞。這里所講的可用于基因治療的各種病毒載體包括，腺病毒、皰疹病毒、牛痘，或優(yōu)選一個(gè)RNA病毒，如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體是鼠類或鳥類逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的衍生物。單一外源基因可插入其中的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體實(shí)例包括但不限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)，和魯斯氏肉瘤病毒(RSV)。另外幾個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體可插入多個(gè)基因。所有這些載體可傳遞或插入給基因一個(gè)可選擇的標(biāo)記，使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可被鑒定和生產(chǎn)。通過將目的多核苷酸序列插入病毒載體，同時(shí)插入另一個(gè)例如編碼特異靶細(xì)胞受體的配體的基因，載體就是靶向特異的了。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體可通過插入一個(gè)例如，編碼糖、糖脂和蛋白的多核苷酸而具有靶向特異性。為靶向逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，優(yōu)選的定向是通過應(yīng)用一個(gè)抗體實(shí)現(xiàn)的。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員會(huì)知道，或不必過度試驗(yàn)可容易地確定能夠插進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒基因組的特異性多核苷酸序列，使得含反義多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體靶向特異地傳遞。
由于重組逆轉(zhuǎn)錄酶病毒是有缺陷的，為產(chǎn)生傳染性載體顆粒它們需要輔助。這一輔助可通過例如應(yīng)用含質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系提供，該質(zhì)粒在長(zhǎng)終端重復(fù)(LTR)內(nèi)調(diào)控序列的控制下編碼逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的所有結(jié)構(gòu)基因。這些質(zhì)粒缺少一個(gè)核酸序列，它可為進(jìn)行殼體包裹啟動(dòng)包裹程序以識(shí)別RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。具有包裹信號(hào)缺失部分的輔助細(xì)胞系包括但不限于2個(gè)，例如PA317和PAl2。由于基因組沒有被包裹，這些細(xì)胞系產(chǎn)生空的病毒粒子。假如一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體被引導(dǎo)進(jìn)這種細(xì)胞，其中包裹信號(hào)是完整的，但結(jié)構(gòu)基因被其它目的基因替代，這樣載體被包裝，并產(chǎn)生了載體病毒粒子。
可選擇地，NIH3T3或其它組織培養(yǎng)細(xì)胞可通過常規(guī)的鈣磷轉(zhuǎn)染法，直接轉(zhuǎn)染編碼逆轉(zhuǎn)錄酶病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒。這些細(xì)胞然后被轉(zhuǎn)染含目的基因的載體質(zhì)粒。得到的細(xì)胞釋放逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體進(jìn)培養(yǎng)基中。
另一個(gè)反義多核苷酸的靶向傳遞系統(tǒng)是膠態(tài)分散系統(tǒng)。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括高分子復(fù)合物、毫微膠囊、微球體、小珠和脂類基礎(chǔ)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、微膠粒、混合微膠粒和脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠態(tài)系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工合成的膜性小泡用于體外和體內(nèi)傳遞的運(yùn)輸工具。已有顯示，大小范圍從0.2-0.4um的大單層小泡(LUV)可以包裹相當(dāng)百分比的含較大高分子的含水緩沖液。RNA、DNA和完整的病毒粒子可被包裹進(jìn)含水的內(nèi)部并以生物學(xué)活性形式傳遞給細(xì)胞(Fraley，等，Trends Biochem.Sci.，677，1981)。除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，脂質(zhì)體也被用于給植物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞傳遞多核苷酸。脂質(zhì)體為了成為一個(gè)有效的基因轉(zhuǎn)移工具應(yīng)當(dāng)具有下列特性(1)用殼體高效包裹目的基因而不損害其生物活性；(2)同非靶細(xì)胞相比，優(yōu)選的和基本上與靶細(xì)胞結(jié)合；(3)高效傳遞小泡的含水內(nèi)容物到靶細(xì)胞；和(4)準(zhǔn)確和有效的表達(dá)基因信息(Mannino，等，Biotechniques，6682，1988)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“有效劑量”或“治療有效劑量”是指足以獲得所需生理學(xué)效果，如治療疾病的劑量。載體表達(dá)，如本發(fā)明的多核苷酸的有效劑量，通常是由內(nèi)科醫(yī)生決定的，在每個(gè)病例中，根據(jù)本領(lǐng)域一般考慮的因素確定合適的劑量，包括年齡、性別、接受治療者的體重和要治療的疾病及要治療醫(yī)學(xué)疾病的嚴(yán)重度。
給與患者多核苷酸，或者是未修飾的合成多核苷酸，或者是表達(dá)載體的一部分，可以通過任何普通的途徑(口、鼻、頰、直腸、陰道或局部)發(fā)生作用，或通過皮下、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。然而，本發(fā)明的藥物成分是以可注射的制劑形式便利地給藥的。為此用途的典型處方含有藥理學(xué)可接受的溶劑或稀釋劑和其它適合的生理化合物。例如，處方可含有多核苷酸和每毫升含NaCl的磷酸鹽緩沖液中有約10mg人血清白蛋白。曾經(jīng)在10天中靜脈內(nèi)給與病人700毫克之多的多核苷酸(即，0.05mg/kg/h)，無毒性表現(xiàn)。Sterling，“全身反義治療報(bào)告”，Genetic Engineering News121，28(1992)。
脂質(zhì)體組合物通常是磷脂的混合物，特別是高相變溫度的磷脂，一般與類固醇結(jié)合，特別是膽固醇。其它磷脂或其它脂類也可應(yīng)用。脂質(zhì)體的生理特性依賴于pH、離子強(qiáng)度和存在二價(jià)陽(yáng)離子。
用于產(chǎn)生脂質(zhì)體的脂類實(shí)例包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂類。特別有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂質(zhì)部分含14-18個(gè)碳原子，特別地16-18個(gè)碳原子，并被飽和。作為例證的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
脂質(zhì)體的靶向根據(jù)解剖學(xué)和機(jī)械因素分類。解剖學(xué)分類根據(jù)選擇性的水平，例如器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性。機(jī)械靶向可根據(jù)其是被動(dòng)或主動(dòng)區(qū)分。被動(dòng)靶向應(yīng)用脂質(zhì)體分布于含有竇狀隙毛細(xì)管的器官中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞的自然傾向。另一方面，主動(dòng)靶向涉及脂質(zhì)體的改變，通過脂質(zhì)體與特異性配體如單克隆抗體、糖、糖脂和蛋白的偶聯(lián)，或通過改變脂質(zhì)體的組成和大小以獲得對(duì)器官和細(xì)胞的靶向而非自然發(fā)生的定位。
靶向傳遞系統(tǒng)的表面可用各種方法修飾。對(duì)脂質(zhì)體靶向傳遞系統(tǒng)而言，脂基可被摻入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層中以保持靶向配體與脂質(zhì)體雙層的穩(wěn)定聯(lián)系。各種連接基團(tuán)可被用于將脂質(zhì)鏈加入靶向配體。一般，連接到靶向傳遞系統(tǒng)表面的化合物是配體和受體，它使靶向傳遞系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并“歸巢”到所需細(xì)胞上。配體可以是將與另一個(gè)化合物如受體結(jié)合的感興趣的任何化合物。
研究和診斷用途本發(fā)明的寡核苷酸也可被用作研究和診斷的工具。例如，本發(fā)明的寡核苷酸可用于在細(xì)胞或組織樣本中探測(cè)CTGF蛋白特異性核酸的存在，如采用通過多核苷酸激酶在5’末端標(biāo)記32P制備的放射標(biāo)記的寡核苷酸，正如Sambrook等，在分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，Volume 2，pg.10.59中所描述的，這里引用了該文獻(xiàn)作為參考。放射標(biāo)記的寡核苷酸與可疑含有CTGF信使RNAs從而含有CTGF蛋白的細(xì)胞或組織接觸，并沖洗樣本以去除未結(jié)合的寡核苷酸。保留在樣本上的放射活性提示存在結(jié)合的寡核苷酸，反過來提示存在與寡核苷酸互補(bǔ)的核酸。這些核酸可用閃爍計(jì)數(shù)器或其它常規(guī)方法定量。編碼這些蛋白的核酸表達(dá)也因此得到測(cè)定。
為研究、診斷或治療用途，本發(fā)明的放射標(biāo)記寡核苷酸也可用來進(jìn)行組織的放射自顯影，以確定CTGF蛋白的定位、分布和數(shù)量。這里研究中，組織切片用放射標(biāo)記的寡核苷酸處理并如上所述沖洗，然后按常規(guī)的放射自顯影方法暴露于攝影感光乳劑。當(dāng)乳劑形成時(shí)，在表達(dá)CTGF蛋白基因的區(qū)域出現(xiàn)銀色顆粒圖象。對(duì)銀色顆粒的定量可測(cè)定編碼這些蛋白的mRNA分子的表達(dá)，并使寡核苷酸定向至此區(qū)域。
CTGF蛋白核酸表達(dá)的熒光測(cè)定類似實(shí)驗(yàn)，可用與熒光素或其它熒光標(biāo)記結(jié)合而非放射標(biāo)記的本發(fā)明寡核苷酸進(jìn)行。這種結(jié)合通常在用熒光標(biāo)記的amidites或可控孔級(jí)(CPG)柱的固相合成期間完成。其它標(biāo)記寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域所熟知。見如，Ruth，分子生物學(xué)方法，Vol.26寡核苷酸結(jié)合方法，第6章，Agrawal，主編，Human PressInc.，Totowa，N.J.，1994，167-185頁(yè)。
本發(fā)明的原料理想地適合于制備試劑盒。這種試劑盒包括一個(gè)載體工具(means)，它被分收在一個(gè)或多個(gè)容器工具如小瓶、小管，以及類似物中，每個(gè)容器工具內(nèi)含有一個(gè)將用于本方法的不同成分。
例如，容器工具之一含有被標(biāo)記而可測(cè)定的反義寡核苷酸。如果存在，第二個(gè)容器可含有雜交緩沖液。試劑盒也可有含核苷酸的容器，以擴(kuò)增靶核酸序列，它們可以被標(biāo)記或未被標(biāo)記，和/或有一個(gè)含指示工具的容器，諸如生物素結(jié)合蛋白，如抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，結(jié)合到一個(gè)指示分子上，如酶、熒光素和放射性核素標(biāo)記。
這種試劑盒包括一個(gè)定向于適當(dāng)基因，即編碼CTGF蛋白的基因，的寡核苷酸。合適的試劑盒和測(cè)試方式，正如“夾心”測(cè)試法，是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，且是容易適應(yīng)本發(fā)明的寡核苷酸應(yīng)用的。本發(fā)明的寡核苷酸與編碼CTGF蛋白的核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定，例如包括結(jié)合一個(gè)酶到寡核苷酸上，放射性標(biāo)記寡核苷酸或任何其他合適的檢測(cè)系統(tǒng)。
為提供給本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員有關(guān)如何制造和使用本發(fā)明的CTGFs的一個(gè)完全公告和描述，列出了下面的實(shí)例，其并不傾向于，也不構(gòu)成限制發(fā)明者認(rèn)為的發(fā)明范圍。在所用數(shù)據(jù)上(如劑量、時(shí)間、溫度等)已經(jīng)做了努力以保證準(zhǔn)確性，但一些試驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差應(yīng)當(dāng)考慮。除非另外指出，份數(shù)指重量份數(shù)，分子量指重均分子量，溫度為攝氏度，壓力為在或接近大氣壓。
實(shí)例1此方法為通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆大鼠CTGF克隆。根據(jù)鼠和人CTGF間的同源區(qū)設(shè)計(jì)了4個(gè)寡核苷酸，2個(gè)正義(F1和F2)和2個(gè)反義(R1和R2)。F2寡核苷酸的序列是5’-GAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGG-3’(SEQ ID NO5)。R1寡核苷酸的序列是5’-ATGTCTCCGTACATCTTCCTGTAGT-3’(SEQ IDNO6)。用這些寡核苷酸結(jié)合進(jìn)行PCR以從NRK庫(kù)(正常大鼠腎纖維母細(xì)胞)擴(kuò)增大鼠CTGF區(qū)。PCR產(chǎn)物被分析，且來自引物結(jié)合體F2/R1和F2/R2的產(chǎn)物按照說明書被克隆進(jìn)pCR載體(InVitrogen)。從F2/R1反應(yīng)得到的兩個(gè)克隆被測(cè)序并顯示與人CTGF和fisp12同源。來自原始的NRK庫(kù)的全長(zhǎng)cDNA通過有限的稀釋進(jìn)行克隆。盤狀溶菌產(chǎn)物由NRK庫(kù)的1/50,000稀釋物制成。這些盤狀溶菌產(chǎn)物中的兩個(gè)是F2/R1PCR陽(yáng)性，#2和#4。這些溶菌產(chǎn)物被鍍層，10個(gè)斑塊中的10個(gè)池被挑出并用F2/R1 PCR篩選。來自溶菌產(chǎn)物#2的兩個(gè)池為陽(yáng)性，#2和#4。池2-2和2-4被鍍層，單個(gè)斑被挑出并用F2/R1 PCR篩選。單斑2-4-7為PCR陽(yáng)性并按廠家說明書(Stratagene)的方法轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒。制備DNA并測(cè)序，圖1?？寺?-4-7的序列與人CTGF和鼠CTGF(fisp12)同源，圖2。
實(shí)例2反義寡聚體的設(shè)計(jì)定向CTGF的反義寡聚體是用生物信息程序設(shè)計(jì)的，以確定可能的接近位點(diǎn)。指定的寡聚體標(biāo)號(hào)為S10839(SEQ ID NO7)，S10840(SEQID NO8)，S10841(SEQ ID NO9)，S10842(SEQ ID NO10)，S10843(SEQ ID NO11)和S10844(SEQ ID NO12)。
用反義CTGF寡聚體轉(zhuǎn)染NRK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天，NRK細(xì)胞以每孔120K的密度(60mm器皿，每板0.36百萬(wàn)細(xì)胞)在6孔板內(nèi)接種。其后1天，用熒光寡聚體(S10532)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。NRK細(xì)胞在存在oligofectin G(2.5μg/ml)和反義寡聚體40nM的情況下轉(zhuǎn)染4小時(shí)。制備10X oligofectin G溶液(在1mlOpti-MEM(無血清培養(yǎng)基)中稀釋12.5μloligofectin G母液以制成10X溶液)。另外制備10X寡聚體溶液(在1ml Opti-MEM中加入4μl寡聚體至終濃度為400nM)。等容積的10X oligofectin G溶液和10X寡聚體溶液混合在一起并置室溫15分鐘以形成絡(luò)合物。得到的混合物是5X。然后在60mm器皿中的培養(yǎng)基用2ml全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM，有5％胎牛血清，高糖和2mML-谷氨酰胺)替換。寡聚體/oligofectin混合物然后加進(jìn)細(xì)胞中(每孔內(nèi)0.5ml 5X寡聚體/oligofectin G混合物)并在37℃孵育4小時(shí)。細(xì)胞用TGF-beta刺激。2.5ml在全生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)的2X TGF-beta(50ng/ml)加入每板并在37℃孵育過夜。加入TGF-beta溶液使脂質(zhì)和寡聚體的濃度下降了50％。
用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染的效率。用熒光寡聚體的轉(zhuǎn)染作為陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞用溴化乙啶二聚體染色以評(píng)價(jià)活力。溴化乙啶二聚體是紅色熒光染料，積聚在死亡細(xì)胞中但被活細(xì)胞排出。大約90％細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)染且寡聚體濃集在核內(nèi)，總細(xì)胞存活為-95％。
在用反義寡聚體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)對(duì)CTGF的Northern斑點(diǎn)分析一個(gè)CTGF-特異的探針片段用XhoI和EcoRI通過限制性消化從載體中切出。此片段然后進(jìn)行凝膠純化并用隨機(jī)引物啟動(dòng)以32P-dCTP標(biāo)記。隨機(jī)引物啟動(dòng)是采用Stratagenes Prime-It，根據(jù)廠家的詳細(xì)說明書進(jìn)行的。然后標(biāo)記的探針與NRK細(xì)胞總RNA的Northern斑點(diǎn)雜交?？俁NA是采用Ambions RNAqueous試劑盒，按廠家的詳細(xì)說明書從細(xì)胞中制備的。
圖3顯示了反義寡聚體處理后，CTGF表達(dá)的Northern斑點(diǎn)分析的結(jié)果?？俁NA在轉(zhuǎn)染反義寡聚體后24小時(shí)從NRK細(xì)胞中制備。Northern斑點(diǎn)是通過在1％變性瓊脂糖凝膠上對(duì)5ug每個(gè)處理的總RNA電泳而制備的。電泳后，RNA轉(zhuǎn)移到正電極膜，與膜交聯(lián)，并用放射標(biāo)記的CTGF和GAPDH(內(nèi)參照)探針探察。結(jié)果顯示，6個(gè)靶向CTGF的反義寡聚體中的6個(gè)引起目的mRNA的裂解。穩(wěn)定的CTGF5’裂解片段(箭頭)在斑點(diǎn)上清晰可見(圖3，A道)。作為上樣和轉(zhuǎn)移效率的內(nèi)參照，斑點(diǎn)用放射標(biāo)記的鼠GAPDH片段探測(cè)。僅觀察到GAPDH表達(dá)的輕度變異(圖3，B道)。通過比較CTGF和GAPDH的表達(dá)，顯示反義寡聚體S10843(SEQ ID NO11)是最有效的(還原全長(zhǎng)信息的80-85％)。
圖3所示數(shù)據(jù)顯示，定向CTGF的6個(gè)寡聚體(SEQ ID NO7-12)均引起靶RNA的顯著抑制。大約90％的NRK細(xì)胞群被轉(zhuǎn)染，且CTGF信息很容易通過Northern斑點(diǎn)分析測(cè)到。典型地，通過在一個(gè)可轉(zhuǎn)染細(xì)胞型的一個(gè)信息內(nèi)篩選3-6個(gè)寡聚體靶位，可獲得66-90％的抑制。如前面提到的，同非反義對(duì)照轉(zhuǎn)染相比，針對(duì)CTGF設(shè)計(jì)的6個(gè)反義寡聚體(SEQ ID NO7-12)中的6個(gè)均在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)抑制CTGFmRNA的表達(dá)。用反義寡聚體S10843(SEQ ID NO11)可觀察到對(duì)靶基因的最佳抑制(大約80％)。值得注意地，RNA酶H產(chǎn)生的RNA裂解片段可在Northern斑點(diǎn)上看到(通常裂解片段被細(xì)胞酶降解)。觀察到的裂解片段證實(shí)了反義(RNA酶H)的作用機(jī)制。
此外，下面表1所示的數(shù)據(jù)提示，將同樣定向編碼CTGF的核酸的寡聚體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起了可測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
表1反義寡聚物對(duì)CTGF表達(dá)的影響
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，各種改進(jìn)和變化可用于本發(fā)明的化合物和方法是顯而易見的。于是，在所附權(quán)利要求和同等的范圍內(nèi)，本發(fā)明涵蓋這些改進(jìn)和變化。因此，本發(fā)明僅受下列權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列或其功能片段的基本上純的CTGF多肽。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的分離的多核苷酸序列。
3.選自下列序列的分離多核苷酸a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO1，其中T也可以是U；c)與a)和b)互補(bǔ)的核酸序列；和d)至少有15個(gè)堿基長(zhǎng)度的a)、b)或c)片段，并將在中到高度嚴(yán)格的條件下與編碼SEQ ID NO1氨基酸序列的DNA雜交。
4.包括權(quán)利要求3所述多核苷酸的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體是一個(gè)質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體是來源病毒的。
7.用權(quán)利要求4所述的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.與SEQ ID NO2中列出的多肽或其片斷結(jié)合的抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體，其中所述抗體是多克隆的。
12.如權(quán)利要求10所述的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
13.如權(quán)利要求10所述的抗體，其中所述抗體是可測(cè)定標(biāo)記的。
14.如權(quán)利要求13所述的抗體，其中可測(cè)定標(biāo)記選自放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。
15.一種產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括a)培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；b)從權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽；和c)分離所述多肽。
16.抑制細(xì)胞內(nèi)CTGF表達(dá)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與細(xì)胞內(nèi)CTGF靶核酸序列互補(bǔ)的臨近核苷酸序列，其中多核苷酸與CTGF靶核酸序列雜交，因而與CTGF的未抑制表達(dá)水平相比，抑制了細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)。
17.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述CTGF靶核酸序列是CTGF基因。
18.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
19.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
20.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸至少有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
21.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的長(zhǎng)度從大約15個(gè)核苷酸到100個(gè)核苷酸。
22.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的長(zhǎng)度從大約15個(gè)核苷酸到80個(gè)核苷酸。
23.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的長(zhǎng)度從大約15個(gè)核苷酸到60個(gè)核苷酸。
24.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸選自tga cct cag cua gua ccu guc uuu c(SEQ ID NO7)；tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g(SEQ ID NO8)；ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u(SEQ ID NO9)；tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c(SEQ ID NO10)；tca ctc agg uua cag uuu cca cug c(SEQ ID NO11)；和ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a(SEQ ID NO12)。
25.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述CTGF靶核酸序列是CTGF轉(zhuǎn)錄RNA。
26.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中所述CTGF靶核酸序列選自acu gga guc gau cau gga cag aaa g(SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c(SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a(SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g(SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g(SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u(SEQ ID NO18)。
27.抑制細(xì)胞內(nèi)CTGF表達(dá)的方法，該方法包括用權(quán)利要求16所述的多核苷酸與細(xì)胞接觸，該多核苷酸與細(xì)胞內(nèi)的靶核酸結(jié)合，其中所述多核苷酸抑制細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述哺乳類動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述靶核酸選自acu gga guc gau cau gga cag aaa g(SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c(SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a(SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g(SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g(SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u(SEQ ID NO18)。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述接觸是在體內(nèi)的接觸。
33.緩解與CTGF相關(guān)的細(xì)胞增殖性疾病的方法，包括用權(quán)利要求16所述的多核苷酸在疾病部位治療患有疾病的個(gè)體，該多核苷酸與細(xì)胞內(nèi)的靶核酸結(jié)合，因而調(diào)節(jié)CTGF的活性并緩解疾病。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是由于細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是由于結(jié)締組織細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述CTGF活性的調(diào)節(jié)為下調(diào)。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的靶核酸選自acu gga guc gau cau gga cag aaa g(SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c(SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a(SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g(SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g(SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u(SEQ ID NO18)。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述多核苷酸是反義多核苷酸。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述反義多核苷酸選自tga cct cag cua gua ccu guc uuu c(SEQ ID NO7)；tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g(SEQ ID NO8)；ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u(SEQ ID NO9)；tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c(SEQ ID NO10)；tca ctc agg uua cag uuu cca cug c(SEQ ID NO11)；和ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a(SEQ ID NO12)。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述疾病選自硬皮病、關(guān)節(jié)炎、肝硬化、肝纖維化、腎纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、粘連和外科疤痕。
41.緩解與CTGF相關(guān)的細(xì)胞增殖性疾病的方法，包括用含有CTGF反義多核苷酸的有效治療量的藥物治療患有疾病的個(gè)體，因而抑制CTGF的產(chǎn)生。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是由于細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是由于結(jié)締組織細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述反義多核苷酸是由表達(dá)載體表達(dá)的。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述載體是病毒載體。
47.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述疾病選自硬皮病、關(guān)節(jié)炎、肝硬化、肝纖維化、腎纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、粘連和外科疤痕。
48.一種治療CTGF相關(guān)疾病的藥物組合物，包括一種藥學(xué)上可接受的載體；和治療有效劑量的寡核苷酸，它與核酸結(jié)合因而抑制CTGF的表達(dá)。
49.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中與寡核苷酸結(jié)合的核酸選自acu gga guc gau cau gga cag aaa g(SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c(SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a(SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g(SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g(SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u(SEQ ID NO18)。
50.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中寡核苷酸含有選自下列的核酸序列tga cct cag cua gua ccu guc uuu c(SEQ ID NO7)；tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g(SEQ ID NO8)；ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u(SEQ ID NO9)；tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c(SEQ ID NO10)；tca ctc agg uua cag uuu cca cug c(SEQ ID NO11)；和ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a(SEQ ID NO12)，或它們的任何組合。
51.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述疾病選自硬皮病、關(guān)節(jié)炎、肝硬化、肝纖維化、腎纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、心纖維化、粘連和外科疤痕。
52.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述疾疾病是由于細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
53.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述疾疾病是由于結(jié)締組織細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。
54.包含一個(gè)被分隔為一個(gè)或數(shù)個(gè)容器的載體工具的測(cè)定CTGF表達(dá)的試劑盒，，包括至少一個(gè)含有至少一個(gè)與CTGF結(jié)合的反義寡核苷酸的容器。
55.如權(quán)利要求54所述的試劑盒，其中與寡核苷酸結(jié)合的所述核酸選自acu gga guc gau cau gga cag aaa g(SEQ ID NO13)；agg acu gag ggc ugg uca cag uga c(SEQ ID NO14)；gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a(SEQ ID NO15)；aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g(SEQ ID NO16)；agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g(SEQ ID NO17)；和gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u(SEQ ID NO18)。
56.如權(quán)利要求54所述的試劑盒，其中所述寡核苷酸含有選自下列的核酸序列tga cct cag cua gua ccu guc uuu c(SEQ ID NO7)；tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g(SEQ ID NO8)；ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u(SEQ ID NO9)；tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c(SEQ ID NO10)；tca ctc agg uua cag uuu cca cug c(SEQ ID NO11)；和ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a(SEQ ID NO12)，或它們的任何組合。
57.一種測(cè)定樣本中CTGF表達(dá)的方法，包括將疑有CTGF表達(dá)的樣本與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸與編碼CTGF的核酸結(jié)合，并測(cè)定寡核苷酸與核酸的結(jié)合。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述寡核苷酸是可測(cè)定標(biāo)記的。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述CTGF核酸在與寡核苷酸結(jié)合之前被擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明提供了大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF),生產(chǎn)CTGF的方法和采用CTGF或其衍生物的治療方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)CTGF活性和緩解與CTGF相關(guān)的細(xì)胞增殖性疾病的方法。
文檔編號(hào)A61P13/00GK1332801SQ99815097
公開日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月6日
發(fā)明者B·F·施密特, M·L·阿倫, F·斯韋德魯普, D·F·卡邁克爾 申請(qǐng)人:法布羅根公司