專利名稱：用于治療過敏反應(yīng)的合成肽免疫原的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用這是1994年3月28日提交的未決申請(qǐng)系列No.08/218,461的部分繼續(xù)申請(qǐng)，No.08/218,461是1993年5月10日提交的未決申請(qǐng)系列No.08/060,798的繼續(xù)申請(qǐng)，No.08/060,798是現(xiàn)在已放棄的1992年3月6日提交的未決申請(qǐng)系列No.07/847,745的部分繼續(xù)申請(qǐng)，No.07/847,745是現(xiàn)在已放棄的1991年1月4日提交的申請(qǐng)系列No.07/637,364的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及線型或放射型分枝多聚體形式的合成肽的組合物用作免疫原誘導(dǎo)在包括人類的健康哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗人IgE重鏈ε-鏈CH4區(qū)效應(yīng)物部位的高滴度抗體，并涉及使用該組合物作為疫苗對(duì)治療過敏反應(yīng)提供免疫療法。
本發(fā)明的背景自從本世紀(jì)早期以來(lái)，已知并實(shí)踐的用于防止諸如氣喘和枯草熱的IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的免疫療法都是經(jīng)過去過敏作用或脫敏作用進(jìn)行的，其中給病人的過敏原的量逐漸增加，以減小隨后接觸該過敏原的效應(yīng)(1)。這種以過敏原為基礎(chǔ)的免疫療法的局限性包括鑒定所涉及的過敏原存在困難以及如果鑒定了過敏原，使用鑒定的過敏原時(shí)常常引起有害反應(yīng)(2)。
緩解過敏反應(yīng)的其它療法是使用藥品阻斷負(fù)責(zé)過敏反應(yīng)的細(xì)胞事件級(jí)聯(lián)。這些藥品包括抗組胺、減充血?jiǎng)?、?拮抗劑和皮質(zhì)甾類?？?組胺、減充血?jiǎng)┖挺?拮抗劑對(duì)過敏反應(yīng)級(jí)聯(lián)中IgE下游事件發(fā)生作用，稱它們?yōu)楣米运幬铮瑑H針對(duì)過敏癥狀。預(yù)防性治療必須作用于更接近IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)起始的細(xì)胞事件。這些姑息劑提供短期和部分的緩解。而且癥狀的減輕常伴隨著有害副作用，例如，抗-組胺可引起煩燥或瞌睡，β2拮抗劑有時(shí)與氣喘病人發(fā)病率增高有關(guān)。
皮質(zhì)甾類是有力的免疫抑制劑且對(duì)治療過敏反應(yīng)癥狀具有高效力。然而，它們刺激有害的激素活性并可能引起不良的廣泛免疫抑制。
為了避免已知治療藥品的缺點(diǎn)，更期望經(jīng)針對(duì)IgE的選擇性抑制來(lái)預(yù)防過敏反應(yīng)。這可經(jīng)過抑制IgE合成來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如經(jīng)過不方便的脫敏方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，或經(jīng)過阻斷IgE-過敏原復(fù)合物刺激肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞伴隨釋放過敏性化學(xué)介質(zhì)的去顆粒作用過程來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在更基礎(chǔ)的水平上，Stanworth等(3-7)和其他人(8-13)使用合成IgEε鏈肽和相應(yīng)的抗體研究了嗜細(xì)胞肽在細(xì)胞信號(hào)作用過程中的作用，試圖解釋肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞免疫學(xué)觸發(fā)的分子基礎(chǔ)。
在過去二十年研究的許多IgE肽(表1)中，人ε鏈FcCH4區(qū)內(nèi)的潛在效應(yīng)物部位(Iys497一Phe506，在表2中以下面劃雙線表示)是十肽。已將它人工合成并用于結(jié)構(gòu)/活性研究(3)。發(fā)現(xiàn)這種來(lái)自IgECH4區(qū)的十肽能夠以類似于IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞觸發(fā)過程的非溶胞方式從分離的大鼠腹膜肥大細(xì)胞中激活劑量依賴性組胺釋放(4)。通過使用ε-鏈?zhǔn)牡亩鄠€(gè)合成類似物進(jìn)行的結(jié)構(gòu)-活性研究推斷該肽效應(yīng)物部位需要精確的結(jié)構(gòu)(3，4，5)。
用ε鏈有關(guān)的“肽-載體蛋白質(zhì)連接物”免疫產(chǎn)生的抗-IgECH4肽抗體也用于經(jīng)觀察抑制活性對(duì)IgE致敏的細(xì)胞之去顆粒作用進(jìn)行結(jié)構(gòu)作用研究(5，11，12)。
Stanworth等(14，15)建議了使用以肽為基礎(chǔ)的疫苗對(duì)具有IgE介導(dǎo)的敏感性病人提供免疫療法的可能性。他使用以前鑒定的具有序列Lys-Thr-Iys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Va1-Phe-NH2(3)(SEQ ID No1)的ε-鏈?zhǔn)呐c諸如鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)或結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)的“載體蛋白”連接，并發(fā)現(xiàn)“肽-載體蛋白”連接物誘導(dǎo)十肽特異性抗體。例如，根據(jù)其高于平均抗肽滴度選擇的兔抗肽血清以滴度依賴性方式減少?gòu)拇笫蟾鼓し蚀蠹?xì)胞中釋放十肽誘導(dǎo)的組胺。這種抑制活性在大鼠被動(dòng)皮膚過敏性(PCA)模型系統(tǒng)的體內(nèi)試驗(yàn)中被進(jìn)一步證實(shí)。當(dāng)在用過敏原進(jìn)行過敏性攻擊前將這種兔抗肽血清給予預(yù)先應(yīng)用多種過敏原致敏的大鼠時(shí)經(jīng)過測(cè)量變藍(lán)面積和評(píng)價(jià)顏色深度來(lái)估測(cè)兔抗肽血清對(duì)過敏反應(yīng)的效應(yīng)。
在相同研究中，在使用含這種“十肽蛋白質(zhì)載體連接物”的免疫原的大鼠中獲得的結(jié)果初步顯示了它們用作疫苗治療過敏反應(yīng)的可能性。
然而，這一方法遇到了相當(dāng)大的困難。這種原型“十肽-蛋白質(zhì)載體連接物”疫苗的主要缺陷包括不太理想的免疫刺激能力和由載體蛋白質(zhì)的組份難以限定和連接反應(yīng)的不均一性引起的生產(chǎn)困難。還發(fā)現(xiàn)由這類肽-蛋白質(zhì)連接物產(chǎn)生的所得抗血清通常含有比抗目的肽更多的抗蛋白載體(例如鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)上抗原決定基的抗體(5)。
表1用于結(jié)構(gòu)-活性研究的IgE重鏈肽
小肽是較差的免疫原，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。為了使小肽具有免疫原性，通常經(jīng)化學(xué)連接或經(jīng)基因融合將它們與大載體蛋白質(zhì)連接。然而，這些方法一般在肽上產(chǎn)生不可預(yù)料的構(gòu)象改變。而且常常誤導(dǎo)針對(duì)有免疫優(yōu)勢(shì)的載體的免疫反應(yīng)。因此，期待進(jìn)一步設(shè)計(jì)免疫原形成有效的疫苗以提供對(duì)過敏反應(yīng)的長(zhǎng)期緩解。
在表2中，將大鼠IgEε-鏈(16)和小鼠ε-鏈(17)CH2到CH4區(qū)域的氨基酸序列與人ε-鏈(18)(SEQ ID NoS2-4)的氨基酸序列進(jìn)行了序列對(duì)比以提供以前報(bào)道的1gE相關(guān)性肽片段的指導(dǎo)。應(yīng)注意到在人IgEε重鏈上靠近252位Q的L在原始IgE骨髓瘤ND序列中不存在。導(dǎo)入缺口(以短條表示)以擴(kuò)大同源性。匹配的同源性殘基位置在方框內(nèi)。已研究過結(jié)構(gòu)活性的ε序列上的位置(表1)在表2中下面劃線。在人IgECH4區(qū)中在結(jié)構(gòu)上有活性的IgE CH4十肽序列下面劃雙線(SEQ ID No1)。本表中使用的氨基酸代碼是A，丙氨酸；R，精氨酸；N，天冬酰胺；D，天冬氨酸；C，半胱氨酸；Q，谷氨酰胺；E，谷氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；L，亮氨酸；K，賴氨酸；M，甲硫氨酸；F，苯丙氨酸；P，脯氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；V，纈氨酸。
表2
表2(續(xù))
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本發(fā)明的目的本發(fā)明的一個(gè)目的是將放射狀分枝形式或含有線型T輔助細(xì)胞抗原決定基形式的化學(xué)合成的一組以IgEε鏈為基礎(chǔ)的肽免疫原用于在導(dǎo)入包括人類的哺乳動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)抗人ε鏈CH4區(qū)十肽效應(yīng)物部位的高滴度抗體。
另一個(gè)目的是設(shè)計(jì)最佳肽免疫原，它具有取自人IgE重鏈CH4區(qū)(IgECH4)的特定氨基酸序列，以特定的取向附著到含有任意人輔助T細(xì)胞抗原決定基的肽上，當(dāng)導(dǎo)入包括人類的哺乳動(dòng)物中時(shí)，會(huì)刺激產(chǎn)生抗人IgE CH4效應(yīng)物部位的高滴度的有效抗體。這些抗體應(yīng)抑制肥大細(xì)胞激活，減少負(fù)責(zé)過敏反應(yīng)癥狀的諸如組胺的化學(xué)介質(zhì)釋放，抑制IgE介導(dǎo)的被動(dòng)皮膚過敏(PCA)反應(yīng)并抑制過敏原誘導(dǎo)的由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IgE。
還有一個(gè)目的是形成有效的以IgEε-鏈肽為基礎(chǔ)的疫苗，利用含有這類分枝多聚體的或線型的免疫原的組合物為治療過敏反應(yīng)提供免疫療法。
本發(fā)明的概述根據(jù)本發(fā)明，以固相合成制備肽免疫原。肽免疫原包含一系列放射狀分枝的含十個(gè)氨基酸IgE CH4肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物的多聚體肽；一系列含IgE CH4肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物以及一個(gè)輔助T細(xì)胞抗原決定基(Th抗原決定基)的多聚體分枝的肽；和一系列含IgE CH4肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物以及部分輔助T細(xì)胞抗原決定基(Th抗原決定基)的線型單體肽。IgE CH4肽取自IgE重鏈Fc區(qū)域，即ε-鏈CH4區(qū)(IgECH4)。在這三個(gè)系列的肽免疫原中，優(yōu)選線型肽。含這些肽的組合物用于免疫健康哺乳動(dòng)物，例如豚鼠，大鼠和人以誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)IgECH4效應(yīng)物部位(SEQ ID No1)具有特異性且不含無(wú)關(guān)抗體的高滴度抗血清。
根據(jù)本發(fā)明，也可用有效量的多聚體分枝肽或線型肽在合適的佐劑和/或傳遞載體存在的條件下制備含合成肽作為關(guān)鍵免疫原的疫苗。預(yù)期這種疫苗組合物會(huì)誘發(fā)比Stanworth等(14)通常使用的那些肽-載體蛋白質(zhì)連接物更集中的抗IgE肽反應(yīng)，從而為治療過敏反應(yīng)提供了更好的免疫療法。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及使用一組新的以肽為基礎(chǔ)的免疫原在包括人類的健康哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗人IgE ε重鏈CH4區(qū)效應(yīng)物部位(SEQ ID No1)的高滴度抗體用于治療IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)疾病。
已普遍接受過敏癥狀，即IgE-依賴性過敏性的直接結(jié)果是由肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞釋放的化學(xué)介質(zhì)引起的。當(dāng)用表面結(jié)合的IgE致敏的肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞與表面結(jié)合IgE對(duì)其具有特異性的過敏原結(jié)合時(shí)觸發(fā)釋放。經(jīng)過過敏原與表面結(jié)合IgE的Fab′部分以抗原-抗體型相互作用進(jìn)行結(jié)合來(lái)啟動(dòng)觸發(fā)。過敏原/抗體結(jié)合交聯(lián)二價(jià)表面結(jié)合的IgE并誘導(dǎo)IgE遠(yuǎn)端Fc區(qū)的構(gòu)象改變，該IgE區(qū)直接與在細(xì)胞表面的高親和力Fc受體接觸。經(jīng)過一種尚未準(zhǔn)確了解的機(jī)制，構(gòu)象改變激活細(xì)胞-IgE-過敏原復(fù)合物，結(jié)果細(xì)胞釋放包括組胺的介質(zhì)。據(jù)信IgE上的效應(yīng)物部位參與觸發(fā)事件?？惯@種“效應(yīng)物部位”的特異性抗IgE抗體的存在通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫可經(jīng)過干擾IgE“效應(yīng)物部位”和細(xì)胞表面之間的相互作用導(dǎo)致在患有過敏反應(yīng)的宿主中抑制細(xì)胞激活過程。
通過使用特異性抗IgE抗體的這類調(diào)節(jié)(即一種免疫療法)可通過用抗IgE的特異性“定點(diǎn)”抗體進(jìn)行的預(yù)防性治療來(lái)被動(dòng)地或更優(yōu)選的是經(jīng)過給宿主提供包含定點(diǎn)肽免疫原的疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生自身定點(diǎn)抗IgE抗體來(lái)主動(dòng)地實(shí)現(xiàn)。據(jù)信主動(dòng)免疫將提供更有效和更長(zhǎng)期的保護(hù)。
在已研究了功能活性的循環(huán)IgE Fc區(qū)域的位點(diǎn)中，已將IgE分子CH4區(qū)的區(qū)域(Lys497-Phe506)鑒定為涉及肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞觸發(fā)的構(gòu)象效應(yīng)物(3-8，14)見表1和表2中下面劃線的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)具有序列Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-G1y-Phe-Phe-Val-Phe-NH2(SEQ ID No1)的來(lái)自該部位的十肽近似這一效應(yīng)物部位的構(gòu)象。這可經(jīng)過該十肽以相似于免疫學(xué)觸發(fā)過程的方式從大鼠肥大細(xì)胞中誘發(fā)劑量依賴性組胺釋放的能力來(lái)證明(4)。
Stanworth等(14，15)證實(shí)通過使用與載體蛋白質(zhì)，鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)耦聯(lián)的IgE CH4十肽(SEQ ID No1)作免疫原的實(shí)驗(yàn)疫苗給具有IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的病人提供免疫療法的可能性。Stanworth等(14，15)發(fā)現(xiàn)從這類免疫獲得的動(dòng)物免疫血清以滴度依賴方式中度減少?gòu)拇笫蟾垢狗蚀蠹?xì)胞的十肽誘導(dǎo)的組胺釋放。在多個(gè)過敏原應(yīng)用的條件下以體內(nèi)被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(PCA)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了由免疫血清產(chǎn)生的抑制活性。
由Stanworth等建立的原型“IgE CH4肽”疫苗的主要缺陷是其免疫原性差，即一個(gè)與幾乎全部自身抗原內(nèi)在相關(guān)的問題。
在本發(fā)明中，提供了特異性免疫原，其中合成免疫刺激成份以特定的取向與IgE CH4十肽(SEQ ID No1)相連以便在遺傳上不一樣的宿主群體中可廣泛地產(chǎn)生抗IgE上這一效應(yīng)物部位的有效抗體。接著，這些抗體阻斷IgE對(duì)肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的刺激作用，從而引起對(duì)預(yù)防IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)疾病的有效治療。
本發(fā)明的肽免疫原能誘導(dǎo)與IgE Fc區(qū)靶氨基酸序列(SEQ IDNo1)具有血清學(xué)交叉反應(yīng)性的抗體而基本上不能介導(dǎo)非溶胞性細(xì)胺釋放。
經(jīng)注射，優(yōu)選肌肉內(nèi)注射施用起始劑量，例如0.2-2.5mg；優(yōu)選1mg的免疫原，接著施用重復(fù)(加強(qiáng))劑量。劑量取決于病人的年齡，體重和一般健康狀況，這是治療領(lǐng)域所熟知的。
盡管對(duì)適于生產(chǎn)抗體的哺乳動(dòng)物種類沒有具體限制，但一般優(yōu)選使用小鼠、兔、豚鼠、豬、山羊、大鼠或綿羊等作為宿主。
對(duì)于主動(dòng)免疫，本文提到的術(shù)語(yǔ)“免疫原”涉及能誘導(dǎo)抗IgECH4十肽(SEQ ID No1)之抗體的合成肽，其中抗體導(dǎo)致IgE介導(dǎo)的嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞去顆粒作用受抑制。本發(fā)明的免疫原包括具有分枝的賴氨酰核心基質(zhì)結(jié)構(gòu)的多聚體肽或其類似物。
這些分枝的多聚體肽具有在宿主動(dòng)物中獨(dú)立誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力。IgE CH4十肽(SEQ ID No1)類似物包括Stanworth等(3，4，5)描述的合成的十肽類似物，本文引用以供參考。為合適起見，免疫原分子量應(yīng)高于5,000；優(yōu)選高于10,000肽的重復(fù)分枝單位應(yīng)等于或高于4 。
雙功能氨基酸，如后面附著一個(gè)具有優(yōu)選是非帶電側(cè)鏈之氨基酸(如Gly或Ala)的賴氨酸在核心基質(zhì)結(jié)構(gòu)的制備中有用。經(jīng)過將在一個(gè)額外耦聯(lián)循環(huán)中的氨基酸插入到兩個(gè)雙Boc-賴氨酸耦聯(lián)循環(huán)中，該氨基酸充當(dāng)肽分枝間的間隔子，允許最大的自由度以達(dá)到最佳呈遞所必需的構(gòu)象。
本發(fā)明提及的免疫原還包括含有任意輔助T細(xì)胞抗原決定基(Th抗原決定基)的線型肽。這些Th抗原決定基以限定的方式共價(jià)附著到十肽效應(yīng)物序列(SEQ ID No1)上，具有或沒有間隔子，以便與十肽N末端相鄰，從而激發(fā)有效的抗體反應(yīng)。免疫原還可包括與諸如細(xì)菌Yersinia spp(19)侵襲素蛋白質(zhì)區(qū)域相應(yīng)的免疫刺激序列。侵襲素功能區(qū)還可通過間隔子附著到Th抗原決定基上。
本發(fā)明的“免疫原”減小了無(wú)關(guān)抗體的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)了更集中的抗“靶序列”即所需IgE CH4交叉反應(yīng)性(SEQ ID No1)的免疫反應(yīng)而不產(chǎn)生會(huì)使治療過敏反應(yīng)的免疫治療過程復(fù)雜化的不良的副作用。
然而，當(dāng)短的靶序列，例如10個(gè)氨基酸的IgE CH4片段Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-G1y-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No1)用于設(shè)計(jì)無(wú)載體蛋白免疫原時(shí)，會(huì)面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。短肽抗原通常是T細(xì)胞依賴性抗原，即T輔助抗原決定基的存在是導(dǎo)致短“靶”肽具有免疫原性所需要的。短的IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物不含T輔助細(xì)胞抗原決定基。本文設(shè)計(jì)了包含短IgE CH4十肽的分枝的多聚體和線型免疫原以提供人工內(nèi)在功能性輔功T-細(xì)胞抗原決定基。
本發(fā)明的肽免疫原由下式代表(A)n-(Th)m-(B)o-(IgE CH4肽)p其中A是氨基酸，α-NH2，脂肪酸，脂肪酸衍生物，或侵襲素功能區(qū)；B是氨基酸；Th是輔助T細(xì)胞抗原決定基或增強(qiáng)免疫類似物或其片段；
IgE CH4肽是Iys-Thr-Lys-G1y-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQID No1)或其免疫原性類似物；n是從1到10；m是從1到4；o是從0到10；p是從1到3。
本發(fā)明的肽免疫原包含大約20到大約100個(gè)氨基酸殘基；優(yōu)選大約20到大約50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選大約20到大約35個(gè)氨基酸殘基。
當(dāng)A是氨基酸時(shí)，它可以是任何非天然存在或任何天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，甲狀腺素，γ-氨基丁酸，高絲氨酸，瓜氨酸和類似物。天然存在的氨基酸包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。而且，當(dāng)n是大于1，2個(gè)或多個(gè)A基團(tuán)是氨基酸時(shí)；各氨基酸獨(dú)立地相同或不同。
當(dāng)A是脂肪酸，如硬脂酸或軟脂酸或脂肪酸衍生物，如三軟脂酰半胱氨酸(Pam3Cys)基團(tuán)時(shí)，它經(jīng)過增強(qiáng)Th抗原決定基的免疫刺激特性而充當(dāng)一種佐劑(20)。當(dāng)A是脂肪酸或其衍生物時(shí)，它通常位于肽的氨基末端。而且，當(dāng)一個(gè)A是脂肪酸時(shí)，有2個(gè)或3個(gè)額外氨基酸A部分。本發(fā)明中有用的脂肪酸具有8到24個(gè)碳原子的碳?xì)滏?，它可以是飽和的或不飽和的?br> 當(dāng)A是侵襲素功能區(qū)時(shí)，它是來(lái)自Yersinia菌種的侵襲素蛋白質(zhì)的免疫刺激抗原決定基。這一免疫刺激特征來(lái)自這種侵襲素功能區(qū)與T細(xì)胞，特別是激活的免疫或記憶T細(xì)胞上的β1整合素分子相互作用的能力。發(fā)現(xiàn)與β1整合素相互作用的侵襲素功能區(qū)的具體序列已由Brett等(19)描述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接到任意Th抗原決定基上的侵襲素功能區(qū)(Inv)具有序列Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQ ID No25)或者是來(lái)自另一Yersinia菌種侵襲素蛋白質(zhì)相應(yīng)區(qū)域的其免疫刺激類似物。該類似物可含有取代，缺失或插入，以提供菌株間的變異，前提是類似物保留了免疫刺激特性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，n是4，A是α-NH2，賴氨酸，賴氨酸和賴氨酸并按此順序排列。在另一實(shí)施方案中；n是1，A是α-NH2。還有一個(gè)實(shí)施方案中，n是4，A是α-NH2，侵襲素功能區(qū)(Inv)，甘氨酸和甘氨酸，并以此順序排列。
B包含如上所述的天然存在的或非天然存在的氨基酸。每個(gè)B可以獨(dú)立地相同或不同。當(dāng)B是賴氨酸時(shí)，可形成分枝的多聚體。例如，如果0是7且所有7個(gè)B基團(tuán)是賴氨酸，那么當(dāng)不保護(hù)賴氨酰側(cè)鏈ε氨基基團(tuán)進(jìn)行肽合成時(shí)形成分枝的K核心(K4K2K)。具有K核心的肽有8個(gè)分枝臂，每個(gè)分枝臂相同并以“(A)n-(Th)m-”或“(具有內(nèi)在Th的IgE CH4肽)-”代表。另外，B氨基酸可形成彈性鉸合，或間隔區(qū)以增強(qiáng)對(duì)Th抗原決定基和IgE CH4十肽或其類似物的免疫反應(yīng)。編碼彈性鉸合序列的例子可見于免疫球蛋白重鏈鉸合區(qū)。彈性鉸合序列常富含脯氨酸。所提供的一個(gè)特別有用的彈性鉸合是序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID No24)，其中Xaa是任意氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸。也可通過在任意Th抗原決定基和IgE CH4十肽或其類似物之間加入間隔序列殘基(例如Gly-Gly)改善免疫原性。除了將Th抗原決定基與B細(xì)胞抗原決定基(即IgECH4十肽位點(diǎn)或其類似物)物理分隔外，甘氨酸殘基可破壞由Th抗原決定基與IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其類似物連接所產(chǎn)生的任何人工二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而消除T和/或B細(xì)胞反應(yīng)間的干擾。因此，輔助細(xì)胞和抗體誘導(dǎo)區(qū)之間的構(gòu)象分離允許在所提供的免疫原和合適的Th和B細(xì)胞間產(chǎn)生更有效的相互作用。
Th是包含天然或非天然氨基酸的Th抗原決定基。Th抗原決定基可由連續(xù)或不連續(xù)的抗原決定基組成；不是Th每一個(gè)氨基酸都必須是抗原決定基的一部分。適用于本發(fā)明的Th抗原決定基，包括其類似物和片段能夠增強(qiáng)或刺激對(duì)IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其類似物的免疫反應(yīng)。具有免疫優(yōu)勢(shì)和任意的Th抗原決定基在大范圍的各種不同MHC類型的動(dòng)物和人類群體中具有高度和廣泛的反應(yīng)性(21-23)。適于本發(fā)明的Th區(qū)具有大約10到大約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選大約10到大約30個(gè)氨基酸。當(dāng)存在多個(gè)Th抗原決定基時(shí)(即m≥2)，各Th抗原決定基可獨(dú)立相同或不同。
Th抗原決定基類似物包括在Th抗原決定基上取代，加入，缺失和插入一到大約10個(gè)氨基酸殘基。Th片段是足以增強(qiáng)或刺激對(duì)IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其類似物的Th抗原決定基的連續(xù)部分。
本發(fā)明的抗原決定基包括肝炎B表面和核心抗原輔助T細(xì)胞抗原決定基(HBsTh和HBcTh)，有日咳毒素輔助T細(xì)胞抗原決定基(PT Th)，破傷風(fēng)毒素輔助T細(xì)胞抗原決定基(TT Th)，麻疹病毒F蛋白質(zhì)輔助T細(xì)胞抗原決定基(MVFTh)，Chlamy dia trachomatis主要外膜蛋白輔助T細(xì)胞抗原決定基(CT Th)，白喉毒素輔助T細(xì)胞抗原決定基(DT Th)，Ploasmodium Falciparum環(huán)子孢于輔助T細(xì)胞抗原決定基(PF Th)，Schistosoma mansoni磷酸丙糖異楊酶輔助T細(xì)胞抗原決定基(SM Th)，大腸桿菌TraT輔助T細(xì)胞抗原決定基(SM Th)，大腸桿菌TraT輔助T細(xì)胞抗原決定基(TraT Th)和免疫增強(qiáng)類似物和這些Th抗原決定基的任意片段。Th抗原決定基序列的例子提供如下HBaThPhe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO5)PT1ThLys-Lys-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-Met-Ile-Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr(SEQ ID NO6)TT1ThLys-Lys-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu(SEQ ID NO7)TT2ThLys-Lys-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr-Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu(SEQ ID NO8)PT1AThTyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO9)TT3Th Tyr-Asp-Pro-Asn-Tyr-Leu-Arg-Thr-Asp-Ser-Asp-Lys-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Arg-Ile-Lys (SEQ ID NO10)PT2Th Gly-Ala-Tyr-Ala-Arg-Cys-Pro-Asn-Gly-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu(SEQ ID NO11)MVF1ThSer-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly (SEQ ID NO12)andLeu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val (SEQ ID NO61)HBCTh Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu(SEQ ID NO14)MVF2ThGly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Val-Asp-Thr-Glu-Ser-Tyr (SEQ ID NO26)TT4Th Trp-Val-Arg-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp-Phe-Thr-Asn-Glu-Ser-Ser-Gln-Lys-Thr (SEQ ID NO27)TT5Th Asp-Val-Ser-Thr-Ile-Val-Pro-Tyr-Ile-Gly-Pro-Ala-Leu-Asn-His-Val (SEQ ID NO28)CT Th Ala-Leu-Asn-Ile-Trp-Asp-Arg-Phe-Asp-Val-Phe-Cys-Thr-Leu-Gly-Ala-Thr-Thr-Gly-Tyr-Leu-Lys-Gly-Asn-Ser (SEQ ID NO29)DT1Th Asp-Ser-Glu-Thr-Ala-Asp-Asn-Leu-Glu-Lys-Thr-Val-Ala-Ala-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro-Gly-Ile-Gly-Cys(SEQ ID NO30)DT2Th Glu-Glu-Ile-Val-Ala-Gln-Ser-Ile-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Met-Val-Ala-Gln-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Ile-Gly-Phe-Ala-Ala-Thr-Asn-Phe-Val-Glu-Ser-Cys (SEQ ID NO31)PF Th Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser(SEQ ID NO32)SM Th Lys-Trp-Phe-Lys-Thr-Asn-Ala-Pro-Asn-Gly-Val-Asp-Glu-Lys-Ile-Arg-Ile (SEQ ID NO33)TraT1ThGly-Leu-Gln-Gly-Lys-Ile-Ala-Asp-Ala-Val-Lys-Ala-Lys-Gly (SEQ ID NO34)TraT2ThGly-Leu-Ala-Ala-Gly-Leu-Val-Gly-Met-Ala-Ala-Asp-Ala-Met-Val-Glu-Asp-Val-Asn (SEQ ID NO35)TraT3ThSer-Thr-Glu-Thr-Gly-Asn-Gln-His-His-Tyr-Gln-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Asn-Ala-Asn-Lys (SEQ ID NO36)優(yōu)選的是，Th抗原決定基為BHsTh，PT1Th，PT2Th，TT1Th，TT3Th，或MVF1Th。
在本發(fā)明的單體線型肽中，如式(A)n-(Th)m-(B)。-(IgECH4肽)所述，Th抗原決定基通過間隔區(qū)B共價(jià)附著到IgE CH4十肽(SEQ ID No1)的N末端上。IgE CH4肽是Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No1)十肽。IgE CH4肽可用一個(gè)免疫原性類似物替代。其免疫原性類似物可含有一至大約4個(gè)氨基酸殘基的取代，添加，缺失或插入，前提是該類似物能誘導(dǎo)與IgECH4十肽(SEQ ID No1)交叉反應(yīng)的免疫反應(yīng)。可對(duì)本文限定的天然或非天然氨基酸進(jìn)行取代，增加和插入。Stanworth等(3，4，5)限定了IgE CH4肽(SEQ ID No1)的免疫原性類似物，本文引用以供參考。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的肽免疫原是含IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物和Th的單體肽。更具體地說(shuō)，優(yōu)選的肽免疫原是那些含IgE CH4(SEQ ID NO1)或其免疫原性類似物；間隔子(例如Gly-Gly)；選自BHsTh，PT1Th，PT2Th，TT1Th，TT3Th和MVF1Th(分別為SEQ ID Nos5，6，11，7，10，61)的Th抗原決定基；任選的InV區(qū)(SEQ ID No25)的線型構(gòu)建體。優(yōu)選的肽免疫原組合物包括例如，肽Nos.19-23和28(表5和6，SEQ ID Nos51-55，62)。
本發(fā)明的肽免疫原可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的化學(xué)合成法制備。例如，見Grant ed.Synthetic Peptides(24)。因此，肽免疫原的合成可使用固相合成的自動(dòng)Merrifield技術(shù)，以t-Boc或F.moc化學(xué)法保護(hù)α-NH2，使用側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸在例如應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀430A或431型上進(jìn)行。為了合成K核心部分以便在其上合成肽分枝，使用Di-α，ε(t-Boc)賴氨酸殘基代替用2，4-二氯芐基保護(hù)ε-氨基的t-Boc賴氫酸。
當(dāng)A是脂肪酸時(shí)，可用熟知的碳化二亞胺方法很容易地加到樹脂結(jié)合肽的N末端。為了加上Pam3Cys，化學(xué)合成脂氨基酸S-〔2，3-雙(軟脂酰氧)-(2R)-丙基-N-軟脂酰-(R)-半胱氨酸(Pam3Cys)〕。然后可用固相合成法將Pam3Cys耦聯(lián)到肽N端，在最后耦聯(lián)步驟中使用Pam3Cys-OH將脂氨基酸連接到樹脂結(jié)合的肽鏈上。
為了提高最終耦聯(lián)的脂肽產(chǎn)物的可溶性，可在N端用另一絲氨酸和賴氨酸殘基延長(zhǎng)固相肽。
完成所需肽免疫原的裝配后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法處理樹脂，從樹脂上裂解肽并對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的功能性基團(tuán)去保護(hù)。游離肽的純化使用HPLC并進(jìn)行生化鑒定，例如，進(jìn)行氨酸分析或測(cè)序。肽的純化和鑒定方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。
產(chǎn)生本發(fā)明的線型Th-IgE CH4十肽構(gòu)建體的其它化學(xué)方法包括通過形成“硫醚”鍵連接鹵代乙?；桶腚装滨ｋ?。例如，半胱氨酸可加到含Th的肽C末端，半胱氨酸的巰基用于與諸如Nα氯乙?；揎椀幕蝽樁∠┒啺费苌馁嚢彼釟埢?或ε-NH2基的親電子基團(tuán)形成共價(jià)鍵，該賴氨酸殘基附著到IgE CH4十肽(SEQID No1)或其免疫原性類似物的N-末端。
這些肽也可以聚合起來(lái)?？山?jīng)過使用常規(guī)方法用戊二醛與賴氨酸殘基的NH2基團(tuán)之間的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)聚合。線型“A-Th-間隔子-IgE CH4”肽構(gòu)建體(例如，肽Nos，19-23和28，SEQ ID Nos51-55和62)也可以經(jīng)過使用一個(gè)額外的半胱氨酸加到線型“A-Th-間隔子-IgE CH4”構(gòu)建體的N端進(jìn)行聚合或共聚。N-端半胱氨酸巰基可用于與賴氨酸殘基的鹵代氯乙酰修飾或順丁烯二酰亞胺衍生的α-或ε-NH2基形成“硫醚”鍵，該賴氨酸殘基附著到分枝的多聚賴氨酰核心分子(例如，K2K，K4K2K，K8K4K2K)的N端。
作為選擇，可用熟知的重組DNA技術(shù)合成更長(zhǎng)的線型肽免疫原。關(guān)于DNA技術(shù)的任何標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)都可提供生產(chǎn)本發(fā)明肽的詳細(xì)方案。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明肽的基因，氨基酸序列可逆向翻譯成核酸序列，優(yōu)選使用表達(dá)該基因的生物的最適密碼子使用。接著，如果必要，可制備合成基因，典型地經(jīng)過合成編碼肽和任意調(diào)節(jié)成份的重疊寡核苷酸。將合成基因插入合適的克隆載體中，獲得并鑒定重組子。然后在合適的適于選擇表達(dá)系統(tǒng)和宿主的條件下表達(dá)該肽。以標(biāo)準(zhǔn)方法純化和鑒定肽。
本發(fā)明的肽免疫原的效力可經(jīng)過將免疫原注射給動(dòng)物，然后監(jiān)測(cè)對(duì)IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其免疫原性類似物的體液免疫應(yīng)答來(lái)建立，如實(shí)施例中所進(jìn)行的詳細(xì)描述。合適的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、山羊、綿羊或類似動(dòng)物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明的有效量的一種或多種肽免疫原在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的疫苗組合物。這些疫苗組合物用于預(yù)防包括過敏性鼻炎，食物過敏反應(yīng)，氣喘，過敏反應(yīng)和其它諸如病毒誘導(dǎo)的氣喘的其它IgE誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)的特應(yīng)性過敏反應(yīng)。
因此，本肽免疫原可使用佐劑，藥用上可接受的載體或其它在疫苗組合物中常規(guī)提供的其它成份配制成疫苗組合物。這類配方本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員易于確定并且包括用于立即釋放和/或持久釋放，和用于誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫和/或誘導(dǎo)定位的粘膜免疫的配方，它可以經(jīng)過例如用微粒包埋的免疫原來(lái)實(shí)現(xiàn)。配方還可包括佐劑或乳化劑，如明礬，不完全Freund氏佐劑，Liposyn，皂草苷，角鯊烯，L121，乳化劑和ISA720及類似物。
本發(fā)明的疫苗可經(jīng)過包括皮下，口服，肌肉內(nèi)或其它腸胃外或腸途徑的任何常規(guī)途徑用藥。可作為單個(gè)劑量或多個(gè)劑量用藥。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員易于確定免疫方法。
本發(fā)明的疫苗組合物包含有效量的一種或多種含有IgE CH4十肽或其免疫原性類似物的合成肽免疫原及藥用上可接受的載體。劑量單位形式可配制成每千克體重含有大約0.5μg至大約1mg的每種肽。當(dāng)以多劑量釋放時(shí)，可方便地將有效劑量分成每單位劑量形式含有合適的量。
本發(fā)明的疫苗組合物可配成含兩種或多種該肽免疫原的混合物以增強(qiáng)在更大群體中的免疫效力，從而提供更好的抗IgE CH4十肽的免疫反應(yīng)。例如，肽Nos.19，20，21，23和4的混合物是有用的。該組合物也可配成含有脂肽以提供內(nèi)在佐劑。對(duì)含免疫原的合成IgE CH4十肽的免疫反應(yīng)也可以通過包埋在O′Hagan等(25)所述類型的生物可降解微粒內(nèi)或其上傳遞來(lái)改進(jìn)。免疫原可制成膠囊，使用或不使用佐劑，包括共價(jià)附著的Pam3Cys，該微顆?？蓴y帶免疫刺激佐劑，如Freund氏不完全佐劑或明礬。微顆粒發(fā)揮功能，刺激對(duì)免疫原包括定位的粘膜免疫性的免疫反應(yīng)。這種定位的免疫性對(duì)例如粘膜定位的過敏反應(yīng)特別需要。微顆粒形式的疫苗組合物也可配成提供持續(xù)或周期性反應(yīng)的時(shí)間控制釋放，用于口服用藥，和表面用藥(25-26)。
下面提供具體肽免疫原的實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明并用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1八聚體肽免疫原的合成合成下面八聚體肽肽No.1〔LysThrLysGlySerGlyPhePheValPheGlyProGlyLysThrLysGlySerGlyPhePheValPheGlyLysMet〕8Lys4Lys2Lys， (SEQ ID No23)肽No.2〔LysThrLysGlySerGlyPhePheValPheGlyProGlyLysThrLysGlySerGlyPhePheValPheGlyProGlyLysThrLysGlySerGlyPhePheValPheGlyLysMet〕8Lys4Lys2Lys，(SEQ ID No13)經(jīng)過三功能性氨基酸的有限順序增殖進(jìn)行多聚體肽的合成，三功能性氨基酸用作低分子量基質(zhì)核心，它是形成分枝多聚體肽抗原系統(tǒng)的基礎(chǔ)。三功能性氨基酸Boc-Lys(Boc)或雙-(Boc)-Lys最合適，因?yàn)镹α-和Nε-氨基酸基團(tuán)可作為反應(yīng)性末端獲得。因此，雙-(Boc)-Lys的順序增殖可產(chǎn)生2n反應(yīng)性未端。
例如，雙-(Boc)-Lys第一次耦聯(lián)到固相樹脂上可產(chǎn)生結(jié)合兩個(gè)肽鏈的兩個(gè)反應(yīng)性氨基末端。因此對(duì)于雙-(Boc)-Lys順序產(chǎn)生第二，第三和第四步分別產(chǎn)生四價(jià)，八價(jià)和十六價(jià)末端用來(lái)結(jié)合多聚體肽鏈抗原。這類多聚體肽作為免疫原有用。合成上面所述分枝的八聚體肽Nos.1和2用作免疫原。分枝抗原含有一個(gè)小的七賴氨酰核心，該核心被環(huán)繞著核心基質(zhì)的一層高密度的均勻肽抗原所包圍。這一設(shè)計(jì)區(qū)別于含有諸如PPD或KLH的大型蛋白質(zhì)載體和以許多未限定形式隨機(jī)分布于蛋白質(zhì)載體表面的小肽抗原的常規(guī)肽-載體連接物抗原。
八聚體肽免疫原的合成采用Boc氨基酸樹脂結(jié)合的苯基羥胺與tBoc-化學(xué)結(jié)合。例如，8分枝的七賴氨酰核心樹脂經(jīng)將雙-t-BocLys耦聯(lián)到極低負(fù)荷的0.14nmol/g MBHA(4-甲基苯基羥胺)樹脂上在Biosearch 9500儀器上制備。在雙-(Boc)-Lys的兩個(gè)偶聯(lián)循環(huán)后，每循環(huán)中接著使用溶于二甲基甲酰胺中的0.3M乙酰咪唑進(jìn)行兩次加帽反應(yīng)。
另外兩個(gè)，雙-(Boc)-Lys偶聯(lián)物加到第一個(gè)雙(NH2)Lys樹脂上。然后經(jīng)過茚三酮試驗(yàn)測(cè)定合成八聚體樹脂的取代水平，根據(jù)理論偶聯(lián)產(chǎn)率發(fā)現(xiàn)具有合適水平的自由-NH2基，隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)t-Boc程序用于合成八聚體肽免疫原。
酸不穩(wěn)定性叔丁氧羰基(t-Boc)用于保護(hù)N-α氨基酸。使用下面的功能性側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)O-芐基用于Thr，Ser，Glu和Tyr；Nδ-甲苯磺?；糜贏rg；BOM即BOC-Nim-芐氧基甲基用于His，Nε-二氯芐氧羰基用于Lys；S-4-甲基芐基用于Cys；O-環(huán)己基用于Asp，CHO用于Trp。
按肽Nos.1和2(SEQ ID Nos23，13)的序列所述從C到N端加上肽No.1和No.2的連續(xù)氨基酸。肽No.1和肽No.2的所得八聚體肽樹脂在10％v/v茴香醚存在的條件下在0℃用無(wú)水HF裂解1小時(shí)。釋放的多聚體抗原用乙酸提取，用乙醚洗兩次并凍干至干燥。凍干的多聚體肽用作免疫原。
實(shí)施例2使用CFA和IFA作佐劑用分枝的八聚體肽免疫原進(jìn)行主動(dòng)免疫(a)免疫方法根據(jù)下面方法，用兩個(gè)IgE CH4-相關(guān)的多聚體肽免疫原(肽Nos.1和2)和與KLH連接的肽No.3(SEQ ID No1)免疫各組豚鼠(每組N＝3)給各動(dòng)物經(jīng)皮下注射肽免疫原混合物(200μL)或用等體積的完全Freund氏佐劑(CFA)乳化的連接物(100μg/ml)與不完全Freund氏佐劑(IFA)混合的肽免疫原的皮下注射在第21，42，和63天重復(fù)。
(b)經(jīng)過測(cè)量其抗-IgE CH4相關(guān)的肽反應(yīng)試驗(yàn)豚鼠免疫血清使用以相應(yīng)免疫原覆蓋的96孔平底微滴定板經(jīng)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))測(cè)定抗肽抗體活性。濃度為5μg/ml的肽免疫原溶液的等份的試樣(100μL)在37℃保溫1小時(shí)。用3％明膠/PBS溶液在37℃再保溫1小時(shí)封閉平板。然后干燥封閉的平板并用于試驗(yàn)。在樣品稀釋緩沖液中以1∶10稀釋度開始隨后10倍系列稀釋的試驗(yàn)豚鼠血清的等份試樣(100μL)加入到肽覆蓋的平板上。平板在37℃保溫1小時(shí)。正常豚鼠血清用作對(duì)照。
用0.05％PBS/Tween_緩沖液洗滌平板6次。加入在連接稀釋緩沖液(含0.5MNaCl，和正常山羊血清的磷酸鹽緩沖液)中1∶1,000稀釋的100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豚鼠抗體。在按上述洗滌前平板在37℃保溫1小時(shí)。然后加入鄰苯二胺底物溶液的等份試樣(100μL)。顯色5-15分鐘后加入50μL2N H2SO4終止酶促顏色反應(yīng)。在平板閱讀器上讀取各孔內(nèi)容物的A492nm。
通過ELISA抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分枝多聚體形式的免疫原，肽No.1和其密切相關(guān)的衍生肽No.2在誘導(dǎo)對(duì)IgE CH4靶序列(SEQ ID No1)特異性的抗體中有效。這些結(jié)果與對(duì)照免疫原，單體肽No.3(IgE CH4十肽SEQ ID No1)的KLH連接物相比顯示，這兩個(gè)多聚體肽抗原產(chǎn)生比KLH連接物更高水平的抗體滴度。
這些免疫實(shí)驗(yàn)的成功結(jié)果表明由于在肽序列C端插入Cly-Lys-Met而在多聚體系統(tǒng)中產(chǎn)生了Th抗原決定基(見SEQ ID Nos23和13，肽Nos.1和2)并且表明某些取向?qū)τ行С蔬f給免疫系統(tǒng)是重要的。其它的實(shí)驗(yàn)表明僅僅以其它取向生產(chǎn)8或甚至16-分枝的含IgE CH4十肽(SEQ ID No1)或其多個(gè)重復(fù)的IgE肽免疫原在誘導(dǎo)抗IgE CH4反應(yīng)中無(wú)效。事實(shí)上，在總共19個(gè)分枝的多聚體構(gòu)建體中，肽Nos.1和2是唯一表現(xiàn)出免疫原性增強(qiáng)的肽。關(guān)于這點(diǎn)，用多聚體肽Nos.1和2觀察的高免疫原性需要實(shí)驗(yàn)，且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員不可預(yù)料的。
另外，所得結(jié)果表明插入短IgE CH4片段之間的間隔序列，即Gly-Pro-Gly對(duì)于允許亞基序列提供的抗原決定基自由呈遞是必需的。還發(fā)現(xiàn)在連接到分枝的賴氨酸核心樹脂之前在C端插入間隔子即Gly-Lys-Met對(duì)多聚體分枝的IgE CH4十肽(SEQ ID No1)合成構(gòu)建體的免疫原性是必需的。
實(shí)施例3用線型免疫原(SEQ ID Nos15-22)免疫大鼠A.免疫原制備經(jīng)固相合成法合成肽免疫原A-H(表3)，根據(jù)廠家說(shuō)明使用F-moc化學(xué)法在應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀430A或431型上進(jìn)行。完成肽的裝配后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法處理樹脂，從樹脂上裂解肽并使氨基酸側(cè)鏈上的功能性基團(tuán)去保護(hù)。從氨基末端到羰基末端的肽免疫原結(jié)構(gòu)如下肽免疫原A是有3個(gè)功能區(qū)的線型肽3個(gè)賴氨酸殘基(3K)，肝炎B表面抗原輔助T細(xì)胞抗原決定基(HBsTh抗原決定基)和IgE CH4肽。因此，肽免疫原A以3K-HBsTh-IgE CH4肽表示。肽免疫原A和肽免疫原B-H的實(shí)際序列在表5中表示(SEQ ID Nos15-22)。
為了在第0，2和5周免疫，溶解各肽免疫原并與佐劑溶液(完全Freund氏佐劑，不完全Freund氏佐劑，或0.2％明礬)合并產(chǎn)生0.5mg/ml的終濃度。溶液貯存于4℃?zhèn)溆?，注射前旋轉(zhuǎn)3到5分鐘。每只大鼠每次注射接受100μg。
B.免疫程序和血清收集皮下(S.C.)免疫Sprague-Dawley大鼠(n＝5)。在第2周和第5周給予S.C加強(qiáng)注射。在第3，6，7和11周收集血液。
經(jīng)腹膜內(nèi)注射1mL，在0.9％NaCl中稀釋1到10倍的戊巴比妥鈉(64.8mg/mL；Anthony Products Co.，Accadia，(A)麻醉大鼠后，從中央尾動(dòng)脈進(jìn)行血液收集。尾巴在48℃±0.5℃水中靜置2分鐘并迅速用紙巾按摩(即擠壓)。將血液立即收集進(jìn)裝有23號(hào)針頭的5ml注射器中。典型地，獲得2到2.5ml血液。以3000rpm離心25分鐘收集血清。血清分成300μL體積的等份并冷凍貯存直到用于ELISA試驗(yàn)。
表3肽免疫原A-H序列肽免疫原 氨基酸序列A 3K-HBsTh-IgECH4Lys-Lys-Lys-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No15)B PT1Th-IgECH4Lys-Lys-Leu Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-Mel-Ile-Tye-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No16)C PT1ATh-IgECH4Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No17)D TT1Th-IgECH4Lys-Lys-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No18)E TT2Th-IgECH4Lys-Lys-Phe-Asn Asn-Phe-Thr Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu-Lys-Thr-Lys GLy-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No19)F TT3Th-IgECH4Tyr-Asp-Pro-Asn-Tyr-Leu-Arg-Thr-Asp-Ser-Asp-Lys-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Arg-Ile-Lys-Lys-Thr-Lys Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No20)G PT2Th-IgECH4Gly-Ala-Tyr-Ala-Arg-Cys-Pro-Asn-Gly-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No21)H MVF1Th-IgECH4Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-Leu-Lys-Thr-LysGly Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No22)實(shí)施例4用線型免疫原(SEQ ID Nos37-50)免疫大鼠線型肽免疫原以A-Th-GG-IgE CH4表示，其中A可以是NH2-，Lys-Lys(2K)，Lys-Lys-Lys(3K)或侵襲素功能區(qū)(Inv)(SEQID No25)，Th是T輔助肽，GG是Gly-G1y間隔子，IgE CH4是靶十肽(SEQ ID No1)，按實(shí)施例3所述合成A-Th-GG-IgE CH4。這此肽免疫原在表4中以肽免疫原Nos.4-17(SEQ ID Nos37-50)表示。這些合成的且裂解的肽用于免疫大鼠以試驗(yàn)藥效。
以下面列出的實(shí)驗(yàn)免疫方案評(píng)價(jià)對(duì)各組中5只大鼠的藥效。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)免疫原肽Nos.4-17(每次試驗(yàn)1個(gè))劑量每次免疫100μg途徑肌肉內(nèi)。
佐劑Freund氏完全/不完全佐劑劑量方案第0(FCA)，3和6(IFA)周抽血方案第0，3，6，8，10周種類Sprague-Dawley大鼠組大小5只試驗(yàn)抗肽活性的ELISA，固相免疫吸附劑是IgE CH4十肽序列(SEQ ID No1)的單體肽No.3。
收集血液，加2成血清，貯存至按實(shí)施例2所述經(jīng)ELISA進(jìn)行滴定，除了使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-大鼠IgG抗體代替山羊抗豚鼠IgG作示蹤物。
表4肽免疫原Nos.4-17序列肽免疫原 氨基酸序列4 TT1Th-GG-IgECH4Lys-Lys-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No37)5 TT2Th-GG-IgECH4Lys-Lys-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val Phe
(SEQ ID No38)6 PT1ATh-GG-IgECH4Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No39)7 MVF2Th-GG-IgECH4Gly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Val-Asp-Thr-Glu-Ser-Tyr-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No40)8 TT4Th-GG-IgECH4Trp-Val-Arg-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp-Phe-Thr-Asn-Glu-Ser-Ser-Gln-Lys-Thr-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No41)9 TT5Th-GG-IgECH4Asp-Val-Ser-Thr-Ile-Val-Pro-Tyr-Ile-Gly-Pro-Ala-Leu-Asn-His-Val-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No42)10 CTTh-GG-lgECH4Ala-Leu-Asn-Ile-Trp-Asp-Arg-Phe-Asp-Val-Phe-Cys-Thr-Leu-Gly-Ala-Thr-Thr-Gly-Tyr-Leu-Lys-Gly-Asn-Ser-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-SerGly Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No43)11 DT1Th-GG-IgECH4Asp-Ser-Glu-Thr-Ala-Asp-Asn-Leu-Glu-Lys-Thr-Val-Ala-Ala-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro-Gly-Ile-Gly-Cys-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No44)12 DT2Th-Gg-IgECH4Glu-Glu-Ile-Val-Ala-Gln-Ser-Ile-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Met-Val-Ala-Gln-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Ile-Gly-Phe-Ala-Ala-Thr-Asn-Phe-Val-Glu-Ser-Cys Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-(SEQ ID No45)13 PFTh-GG-IgECH4Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val Val-Asn-Ser-Gly-Gly-Lys
Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No46)14 SMTh-GG-IgECH4Lys-Trp-Phe-Lys-Thr-Asn-Ala-Pro-Asn-Gly-Val-Asp-Glu-Lys-Ile-Arg-lle-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No47)15 TraT1Th-GG-IgECH4Gly-Leu-Gln-Gly-Lys-Ile-Ala-Asp-Ala-Val-Lys-Ala-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No48)16 TraT2Th-GG-IgECH4Gly-Leu-Ala-Ala-Gly-Leu-Val-Gly-Met-Ala-Ala-Asp-Ala-Met-Val-Glu-Asp-Val-Asn-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No49)17 TraT3Th-GG-IgECH4Ser Thr-Glu-Thr-Gly-Asn-Gln-His-His-Tyr-Gln-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Asn-Ala-Asn-Lys-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-(SEQ ID No50)實(shí)施例5用線型免疫原(SEQ ID Nos51-56，62)和反極性的線型免疫原(SEQ ID Nos57-60)免疫大鼠按實(shí)施例3所述合成表5所示的肽免疫原Nos18-23(SEQ IDNos51-56)。肽免疫原NoS·18-23的通式可用A-Th-GG-IgECH4代表，其中A是N端Lys-Lys(2K)，Lys-Lys-Lys(3K)或是被間隔區(qū)GG與Th序列分開的侵襲素功能區(qū)(Inv)(SEQ ID No25)；Th選自HBsTh，PT1Th，PT2Th，MVF1Th，或TT3Th；GG是Gly-Gly間隔區(qū)；IgECH4是IgE CH4十肽(SEQ ID No1)。
也在表5中作為肽號(hào)24-27所示的具有SEQ ID Nos57-60的肽免疫原按與肽號(hào)18-23相同的方式合成。這些肽可用IgECH4-GG-Th表示。這些肽就IgECH4十肽，間隔區(qū)和Th序列而言相當(dāng)于肽號(hào)19，20，21，23(表5)，除了十肽/Th極性相反，即IgECH4十肽(SEQ ID No1)在N端，而Th位于C端。
這些肽免端原按下面實(shí)驗(yàn)方案所述用于免疫大鼠，用于比較和證實(shí)其藥效。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)免疫原肽號(hào)18-28(每組1個(gè))(SEQ ID No51-60和62)劑量每次免疫100μg途徑肌肉內(nèi)佐劑Freund氏完全/不完全佐劑用于肽號(hào)18-27，0.4％明礬用于肽號(hào)28劑量方案在第0(FCA)，3和6周(IFA)用肽號(hào)8-27，在第0，3，和6周將明礬用于肽號(hào)28。
抽血方案第0，3，6，8，10周。
種類Sprague-Dawley大鼠組大小5只用于肽號(hào)27-28，4只用于肽號(hào)28試驗(yàn)抗肽活性的ELISA，固相底物是肽號(hào)3(SEQ ID No1)。
收集血液，加工成血清，貯存至按實(shí)施例2所述以ELISA滴定，除了用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體取代抗豚鼠IgG作為示蹤物。以抗肽ELISA試驗(yàn)全部血清，以1∶100稀釋時(shí)產(chǎn)生的A492nm值≥0.2的那些樣品被記錄為血清陽(yáng)性。
以抗肽ELISA評(píng)價(jià)肽免疫原Nos.1 8-28(SEQ ID Nos51-60，和62)的免疫效力并在表6中以在對(duì)實(shí)驗(yàn)免疫的反應(yīng)中，每組4或5只大鼠在第6和8周轉(zhuǎn)變成對(duì)IgE CH4肽No.3產(chǎn)生血清陽(yáng)性反應(yīng)(即，以1∶100稀釋時(shí)A492mm≥0.2)的數(shù)目表示。
本實(shí)施例的極性Th-GG-IgE CH4的肽免疫原(肽號(hào)18-23和28SEQ ID Nos51-56和62)對(duì)誘導(dǎo)抗IgE CH4十肽(肽No.3，SEQID No1)的抗體顯示出明顯的效力。用該極性肽免疫原(肽號(hào)18-23，28)免疫的所有6組大鼠與對(duì)照相比顯示出明顯轉(zhuǎn)變?yōu)檠尻?yáng)性。到第6周為止，各組血清轉(zhuǎn)變流行率范圍為1/5到5/5，在第6周和8周之間對(duì)第三次劑量的免疫原的反應(yīng)中血清轉(zhuǎn)變流行率持續(xù)上升。含HBsTh肽序列的肽免疫原No.18，具有MVF1Th肽的肽免疫原No.19和含PT1Th肽序列的肽號(hào)28最有效，到第8周為止，其血清轉(zhuǎn)變流行率分別為4/5，5/5和4/4。比較肽免疫原Nos.21和22(SEQ ID Nos54，55)的免疫原性證實(shí)Inv區(qū)肽到第8周為止對(duì)含PT2Th肽(表6)的免疫刺激能力明顯提高。
與此相反，具有相反Th極性的類似肽免疫原(肽免疫原號(hào)24-27，SEQ ID Nos57-60)對(duì)大鼠血清轉(zhuǎn)變未顯示出明顯的免疫效力。這種較弱的免疫效力表明Th-GG-IgE CH4氨基到羧基端極性對(duì)于本發(fā)明的線型肽免疫原的免疫原性是關(guān)鍵的。靶肽和Th的一種取向優(yōu)于另一種取向的效力的確定是本領(lǐng)域的技術(shù)人員推測(cè)不出的，且是不可預(yù)料的。
表5肽免疫原Nos.18-28的序列肽免疫原 氨基酸序列18 3K-HBsTh-GG-IgECH4Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No51)19 MVF1Th-GG-IgECH4Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No52)20 PT1Th-GG-IgECH4Lys-Lys-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-MeL-Ile-Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr-Gly-Gly-Lys-Thr Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No53)21 PT2Th-GG-IgECH4Gly-Ala-Tyr-Ala-Arg-Cys-Pro-Asn-Gly-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No54)22 Tnv-GG-PT2Th-GG-IgECH4Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe-Gly-Gly-Gly-Ala-Tyr-Ala-Arg-Cys-
Pro-Asn-Gly-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No55)23 TT3Th-GG-IgECH4Tyr-Asp-Pro-Asn-Tyr-Leu-Arg-Thr-Asp-Ser-Asp-Lys-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Arg-Ile-Lys-GlyGly-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe(SEQ ID No56)24 IgECH4-GG-MVF1Th Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-Gly-Gly-Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val(SEQ ID No57)25 IgECH4-GG-PT1Th Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-Gly-Gly-Lys-Lys-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-Met-Ile-Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-His-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr(SEQ ID No58)26 IgECH4-GG-PT2Th Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-Gly-Gly-Gly-Ala-Tyr-Ala-Arg-Cys-Pro-Asn-Glu-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu(SEQ ID No59)27 IgECH4-GG-TT3Th Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-Gly-Gly-Tyr-Asp-Pro-Asn-Tyr-Leu-Arg-Thr-Asp-Ser-Asp-Lys-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Mel-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Arg-Ile-Lys(SEQ ID No60)28 PT1Th-IgECH4Lys-Lys-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-Met-Ile-Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-
(SEQ ID No62)表6血清轉(zhuǎn)變的動(dòng)物/組*肽免疫原第6周 第8周18 3K-HBSTh-GG-IgECH444(SEQ ID No51)19 MVF1Th-GG-IgECH455(SEQ ID No52)20 PT1Th-GG-IgECH423(SEQ ID No53)21 PT2Th-GG-IgECH411(SEQ ID No54)22 Inv-GG-PT2-GG-IgECH413(SEQ ID No55)23 TT3Th-GG-IgECH433(SEQ ID No56)24 IgECH4-GG-MVF1Th 00(SEQ ID No57)25 IgECH4-GG-PT1Th 11(SEQ ID No58)26 IgECH4-GG-PT2Th 00(SEQ ID No59)27 IgECH4-GG-TT3Th 00(SEQ ID No60)28 PT1Th-IgECH444(SEQ ID No62)Control Immunization 00(No peptide)*每組5只動(dòng)物用于肽Nos.18-27，4只動(dòng)物用于肽No.28
實(shí)施例6進(jìn)一步擴(kuò)大反應(yīng)群體的線型免疫原混合物許多不同的含IgE CH4十肽和Th(實(shí)施例3-5)的線型構(gòu)建體的相對(duì)效力的建立允許選擇有用的肽免疫原配制混合疫苗組合物。攜帶來(lái)自麻疹病毒F蛋白質(zhì)，破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素的免疫優(yōu)勢(shì)任意Th肽的各個(gè)Th-GG-IgECH4構(gòu)建體(肽號(hào)19-23)經(jīng)實(shí)施例5的研究證實(shí)在誘導(dǎo)對(duì)IgECH4十肽SEQ ID No1)的抗體反應(yīng)中有效。含這些線型肽混合物的組合物可在遺傳多樣性群體中提供所需的最大免疫原性。
以實(shí)施例5所述的方法在大鼠中評(píng)價(jià)配成包含具有優(yōu)選的“A-Th-GG-IgECH4”極性的合成肽，肽免疫原號(hào)19，20，21，23(表5)和肽免疫原號(hào)4(表4，實(shí)施例4)之混合物的這些組合物的免疫效力。在5只大鼠一組中的每只動(dòng)物用100μg劑量的5種肽的等摩爾配制品，即每種肽20μg免疫。到第5周和第8周為止兩個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)檠尻?yáng)性反應(yīng)性的大鼠數(shù)目是5只中有5只(即100％)。
該結(jié)果表明含有本發(fā)明的肽免疫原的混合物的疫苗提供改進(jìn)的免疫原性。還顯示了該混合物和由不同有效肽組成的雞尾酒類似物在遺傳多樣性人類群體中誘導(dǎo)免疫治療抗體反應(yīng)的潛力。
實(shí)施例7用有效線型免疫原混合物免疫含IgE CH4十肽和Th的許多不同的線型的構(gòu)建體(實(shí)施例3-5)的相對(duì)效力的建立允許選擇有用的肽用于免疫原混合物。在免疫原混合物中的攜帶Gly-Gly間隔區(qū)和來(lái)自麻疹病毒F蛋白質(zhì)，肝炎病毒B表面抗原，破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素任意Th肽的各個(gè)構(gòu)建體證實(shí)是有效的(表6)。因此這些證實(shí)有效的具有特定極性的線型肽免疫原的混合物在遺傳多樣性群體中可提供最大免疫原性。設(shè)計(jì)下面的方案證實(shí)配制成含優(yōu)選“A-Th-GG-IgECH4”構(gòu)建體的合成肽免疫原混合物的本發(fā)明的組合物的效力。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)免疫原(1)混合物1肽號(hào)18，19，20
(2)混合物2肽號(hào)18，19，22(3)陽(yáng)性對(duì)照-肽3的KIH連接物(每組大鼠一種免疫原)劑量每次免疫等于100μg等摩爾的各合成肽或IgE CH4等價(jià)物，或33.3μg各肽。
途徑肌肉內(nèi)佐劑(1)Freund氏完全/不完全佐劑(2)0.4％明礬(氫氧化鋁)(每組每個(gè)免疫原用一種佐劑)劑量方案第0，2和4周(CFA/IFA組第0周接受CFA，第2和4周接受IFA。明礬組所有3種劑量接受明礬配制品)。
抽血方案第0，3，6和8周種類Sprague-Dawley大鼠/組組大小5，6組試驗(yàn)抗肽活性ELISA，固相免疫吸附劑量肽No.3(SEQ ID No1)收集血液，加工成血清，并貯存至按實(shí)施例5所述經(jīng)ELISA滴定。
設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的免疫原與現(xiàn)有技術(shù)的已知免疫原(14，15)相比性能的改進(jìn)。該結(jié)果對(duì)評(píng)價(jià)各含三種Th肽的有效肽免疫原的兩種混合物有用，證實(shí)了免疫刺激Inv功能區(qū)的有用性(混合物2含Inv，混合物1不含)，和佐劑，明礬在本發(fā)明的疫苗組合物中的效力。
實(shí)施例8使用免疫原混合物的臨床試驗(yàn)含IgE CH4十肽和Th的許多不同構(gòu)建體(實(shí)施例3-5)的相對(duì)效力的建立允許選擇代表性肽用于免疫原混合物。在免疫原混合物中攜帶Gly-Gly間隔子和來(lái)自麻疹病毒F，肝炎B表面抗原，破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素Th肽序列的各個(gè)構(gòu)建體證實(shí)為有效(表6)且對(duì)多種人HLA DR抗原是隨意的，以便在遺傳多樣性人群體中提供最大免疫原性。而且，由于這些Th肽來(lái)自兒童疫苗，童年接種在免疫的人類群體中是Th記憶的有效來(lái)源。因此，兒童疫苗對(duì)賦予由這類Th肽混合物組成的抗過敏反應(yīng)疫苗更高的免疫效力具有潛力。設(shè)計(jì)下面的臨床方案證實(shí)在廣泛可接受的佐劑(明礬)中配制成這類線型“A-Th-間隔子-IgE CH4十肽”肽免疫原之混合物的本發(fā)明的組合物的效力。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)受試者枯草熱病人季節(jié)和期間枯草熱季節(jié)，8周組4組，1組/免疫原/劑量，每組N＝15，12個(gè)接受免疫原，3個(gè)接受安慰劑。
免疫原混合物1肽號(hào)18，19，20，23佐劑0.2％明礬劑量每劑量等摩爾的各合成肽等于500μg，或每種肽125μg。
途徑肌肉內(nèi)劑量時(shí)間第0和4周估測(cè)時(shí)間第0，4和0，6周收集血液，加工成血清，并貯存至按實(shí)施例5所述經(jīng)ELISA滴定。
以血清評(píng)價(jià)疫苗組合物“雞尾酒1”的效力和安全性，通過皮膚反應(yīng)試驗(yàn)，病人使用枯草熱藥療法的使用率，病人的過敏癥狀和有害反應(yīng)的身體檢查，訪問病人以獲得對(duì)使用該產(chǎn)品效果的主觀評(píng)價(jià)來(lái)實(shí)現(xiàn)。血清學(xué)評(píng)價(jià)包括前述對(duì)抗肽滴度的ELISA，測(cè)定組胺水平減少的標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)分光熒光試驗(yàn)以及確定產(chǎn)品不觸發(fā)組胺釋放。皮膚試驗(yàn)是皮內(nèi)試驗(yàn)，其中將過敏原標(biāo)準(zhǔn)溶液注射進(jìn)皮膚上層。經(jīng)測(cè)定在對(duì)過敏原的反應(yīng)中產(chǎn)生的典型“水泡和亮斑”面積定量對(duì)過敏原的反應(yīng)。期望的結(jié)果包括在研究終止時(shí)過敏癥狀明顯改進(jìn)，沒有本發(fā)明的疫苗組合物觸發(fā)組胺釋放的跡象。
設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的臨床效果。這些結(jié)果對(duì)用藥用上可接受的佐劑(明礬配制的含4種Th肽序列的“A-Th-間隔子-IgE CH4十肽”免疫原的混合物進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
實(shí)施例9體外試驗(yàn)證實(shí)IgE CH4十肽特異性抗體的效力用于熟知的組胺釋放試驗(yàn)的被動(dòng)致敏的人嗜堿細(xì)胞用于體外評(píng)價(jià)經(jīng)過用IgECH4十肽免疫原免疫誘導(dǎo)的抗體。從自愿者靜脈血制備人類嗜堿細(xì)胞，然后用對(duì)芐基青霉素-人血清白蛋白連接物(BPO-HSA)特異的IgE被動(dòng)致敏，它從對(duì)BPO-HSA特異性IgE有超免疫球蛋白結(jié)合性的供體血液中制備。致敏嗜堿細(xì)胞的組胺釋放受加入BPO-HSA或IgE CH4肽No.3(SEQ ID No1)的影響。在加入誘導(dǎo)組胺釋放的試劑前，嗜堿細(xì)胞與系列稀釋的抗IgE CH4十肽(SEQ ID No1)的抗血清或免疫前對(duì)照血清合并。用自動(dòng)熒光技術(shù)分析樣品的組胺釋放。從兩者中減去自發(fā)釋放后從樣品與總嗜堿細(xì)胞組胺含量的比率計(jì)算組胺釋放百分?jǐn)?shù)。(27)體外效力證實(shí)了實(shí)驗(yàn)性抗血清抑制組胺釋放的能力。
本試驗(yàn)證實(shí)了IgE CH4肽No.(SEQ ID No1)以濃度依賴性方式誘導(dǎo)組氨酸釋放的能力。結(jié)果在表7中提供，表明了IgE CH4肽號(hào)3(SEQ ID No1)誘導(dǎo)人嗜堿細(xì)胞的組胺釋放并用于證實(shí)SEQ IDNo1和相應(yīng)抗體與人過敏反應(yīng)的相關(guān)性。
表7誘導(dǎo)物 ％凈組胺釋放*肽No.31 50μg/mL(1.3×10-4M)30％60μg/mL(7×10-5M)136μg/mL(7×10-6M) 2BPO-HSA0.1μg/mL 63％*用減去自發(fā)組胺釋放9％來(lái)校正序列表一般資料(i)申請(qǐng)人United Biomedical，Inc.&WANG，Chang Yi(ii)發(fā)明題目用于治療過敏反應(yīng)的合成肽免疫原(iii)序列數(shù)62(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系A(chǔ)Maria C.H.Lin(B)街道345 Park Avenue(C)城市New York(D)州NY(E)國(guó)家USA(F)郵編10154(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect 5.1(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1995年3月24日(C)分類(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/328,912(B)申請(qǐng)日1994年10月25日(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/218,461(B)申請(qǐng)日1994年3月28日(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/060,798(B)申請(qǐng)日1993年5月10日(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S07/847,745(B)申請(qǐng)日1992年3月6日(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S07/637,364(B)申請(qǐng)日1991年1月4日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Maria C.H.Lin(B)登記號(hào)29,323(C)參考/摘要號(hào)1151-4061US4(ix)電訊資料(A)電話212-758-4800(B)傳真212-751-6849(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(x)文獻(xiàn)資料(A)作者Stanworth et al.(B)題目The Role of Non-antigen ReceptorsIn Mast Cell Signalling Processes(C)期刊Molecular Immunology(D)卷21(E)期號(hào)12(F)頁(yè)1183-1190(G)時(shí)間1984(J)
公開日(K)相關(guān)殘基497 to 506(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe1 5 10(3)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型Polypeptideε-chain of human IgE(x)文獻(xiàn)資料(A)作者Dorrington and Bennich(B)題目(C)期刊Immunology Review(D)卷41(E)期號(hào)12(F)頁(yè)3-25(G)時(shí)間1978(xi)序列描述SEQ ID NO2Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln5 10 15Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu20 25 30Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr35 40 45Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala50 55 60Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Gln Leu65 70 75Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys80 85 90Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Gln Asp Ser Thr Lys Lys95 100 105Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg110 115 120Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr125 130 135Cys Leu Val Leu Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu140 145 150Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn Asn Ser Thr Arg155 160 165Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr170 175 180Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln185 190 195Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser200 205 210Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala215 220 225Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu230 235 240Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln245 250 255Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr260 265 270Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser275 280 285Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Gln Glu Lys Asp Glu Phe290 295 300Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val305 310 315Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys320 325(4)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度175個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型Polypeptide ε-chain of rat IgE(x)文獻(xiàn)資料(A)作者Kindsrogel et al.(B)題目(C)期刊DNA(D)卷1(E)期號(hào)(F)頁(yè)335-343(G)時(shí)間1982(xi)SEQ ID NO3Asn Leu Asn Ile Thr Gln Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser Thr Phe5 10 15Thr Cys Lys Val Thr Ser Gln Gly Glu Asn Tyr Trp Ala His Thr20 25 30Arg Arg Cys Ser Asp Asp Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu35 40 45Ile Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Glu Asn Gly Thr Pro Lys50 55 60Leu Thr Cys Leu Val Leu Asp Leu Glu Ser Glu Glu Asn Ile Thr65 70 75Val Thr Trp Val Arg Glu Arg Lys Lys Ser Ile Gly Ser Ala Ser80 85 90Gln Arg Ser Thr Lys His His Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser95 100 105Ile Leu Pro Val Asp Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Glu Gly Tyr110 115 120Gln Cys Arg Val Asp His Pro His Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg125 130 135Ser Ile Thr Lys Ala Leu Gly Leu Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr140 145 150Val Phe Leu Pro Pro Glu Glu Glu Glu Lys Asn Lys Arg Thr Leu155 160 165Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu170 175(5)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度315個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型小鼠IgE多肽ε鏈(x)文獻(xiàn)資料(A)作者Ishida et al.(B)題目(C)期刊EMBO(D)卷1(E)期號(hào)(F)頁(yè)1117-1123(G)時(shí)間1982(xi)序列描述SEQ ID NO4Val Arg Pro Val Thr His Ser Leu Ser Pro Pro Trp Ser Tyr Ser5 10 15Ile His Arg Cys Asp Pro Asn Ala Phe His Ser Thr Ile Gln Leu20 25 30Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly His Ile Leu Asn Asp Val Ser Val Ser35 40 45Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp Thr Leu Ala Gln Thr50 55 60Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser Thr Cys Ser Lys65 70 75Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser Thr Phe Thr80 85 90Cys Arg Val Thr Ser Gln Gly Cys Asp Tyr Leu Ala His Thr Arg95 100 105Arg Cys Pro Asp His Glu Pro Arg Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Ile110 115 120Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Lys Leu125 130 135Thr Cys Leu Val Leu Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val140 145 150Thr Trp Asn Gln Glu Lys Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp155 160 165Tyr Thr Lys His His Asn Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile170 175 180Leu Pro Val Val Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Gln185 190 195Cys Ile Val Asp Arg Pro Asp Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg Ser200 205 210Ile Thr Leu Pro Gln Val Ser Gln Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr215 220 225Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Glu Asp Lys Arg Thr Leu230 235 240Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln245 250 255Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser Asn Ser Gln His Ser Thr260 265 270Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn Gln Gly Phe Phe Ile275 280 285Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp Thr Gln Arg Lys290 295 300Gln Phe Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln Lys Pro Arg305 310 315(6)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15(7)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述 SEQ ID NO6Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu1 5 10 15Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr20 25 30(8)SEQ ID N07資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述 SEQ ID NO7Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr1 5 10 15Glu Leu(9)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro1 510 15Lys Val Ser Ala Ser His Leu20(10)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu1 510 15(11)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe1 510 15Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys20 25(12)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val1 510 15Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu20(13)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Leu1 510 15(14)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Pro Gly Lys Thr5 10 15Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Pro Gly Lys Thr Lys Gly20 25 30Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Lys Met35(15)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro1 5 10 15Pro Asn Ala Pro Ile Leu20(16)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10 15Ser Leu Asp Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(17)SEQ ID NO16資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu1 5 10 15Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr20 25 30Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe35 40(18)SEQ ID NO17資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu1 5 10 15Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(19)SEQ ID NO18資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr1 5 10 15Glu Leu Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(20)SEQ ID NO19資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro1 5 10 15Lys Val Ser Ala Ser His Leu Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe20 25 30Val Phe(21)SEQ ID NO20資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe1 5 10 15Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Lys Thr Lys20 25 30Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe35(22)SEQ ID NO21資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val1 5 10 15Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Lys Thr Lys Gly Ser Gly20 25 30Phe Phe Val Phe(23)SEQ ID NO22資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Leu1 5 10 15Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(24)SEQ ID NO23資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Pro Gly Lys Thr5 10 15Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Lys Met20 25(25)SEQ ID NO24資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型連接基團(tuán)(xi)序列描述SEQ ID NO24Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro5(2)SEQ ID NO25資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO26資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr20(2)SEQ ID NO27資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15Thr(2)SEQ ID NO28資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO28Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO29資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO29Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser20 25(2)SEQ ID NO30資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO30Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Gly Ile Gly Cys20(2)SEQ ID NO31資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO31Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys35(2)SEQ ID NO32資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 21個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO32Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser20(2)SEQ ID NO33資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO33Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys Ile Arg1 5 10 15Ile(2)SEQ ID NO34資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO34Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly1 5 10(2)SEQ ID NO35資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)(B)類型氨基酸(C)鏈型不合適(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述 SEQ ID NO35Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn(2)SEQ ID NO36資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO36Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys20(2)SEQ ID NO37資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO37Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Leu Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO38資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO38Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 5 10 15Val Ser Ala Ser His Leu Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe20 25 30Val Phe(2)SEQ ID NO39資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO39Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gly1 5 10 15Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO40資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO40Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25 30(2)SEQ ID NO41資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO41Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15Thr Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO42資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO42Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 15Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO43資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO43Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser20 25 30Gly Phe Phe Val Phe35(2)SEQ ID NO44資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO44Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Gly Ile Gly Cys Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe20 25 30Phe Val Phe35(2)SEQ ID NO45資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO45Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe35 40 45Phe Val Phe50(2)SEQ ID NO46資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO46Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val20 25 30Phe(2)SEQ ID NO47資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO47Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys Ile Arg1 5 10 15Ile Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO48資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO48Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly Gly Gly1 5 10 15Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO49資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO49Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25 30(2)SEQ ID NO50資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO50Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25 30(2)SEQ ID NO51資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO51Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly1 5 10 15Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO52資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO52Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly1 5 10 15Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe20 25(2)SEQ ID NO53資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO53Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly20 25 30Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe35 40(2)SEQ ID NO54資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO54Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly20 25 30Phe Phe Val Phe35(2)SEQ ID NO55資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO55Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe1 5 10 15Gly Gly Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr20 25 30Val Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Lys Thr Lys Gly35 40 45Ser Gly Phe Phe Val Phe50(2)SEQ ID NO56資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO56Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu1 5 10 15Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val20 25 30Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Gly Gly Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe35 40 45Phe Val Phe50(2)SEQ ID NO57資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO57Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Gly Leu Ser Glu Ile1 5 10 15Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val20 25(2)SEQ ID NO58資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO58Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Gly Lys Lys Leu Arg1 5 10 15Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His20 25 30Val His Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr35 40(2)SEQ ID NO59資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO59Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Gly Gly Ala Tyr Ala1 5 10 15Arg Cys Pro Asn Glu Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly20 25 30Asn Ala Glu Leu35(2)SEQ ID NO60資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO60Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Gly Gly Tyr Asp Pro1 5 10 15Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met20 25 30Val Lys Leu Phe Asn Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe35 40 45Asn Arg Ile Lys50(2)SEQ ID NO61資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO61Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO62資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO62Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Lys Thr20 25 30Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe35 40
權(quán)利要求
1.以通式(A)n-(Th)m-(B)o-(IgECH4肽)p表示的肽免疫原，其中A是氨基酸，α-NH2，脂肪酸或其衍生物，或侵襲素；B是氨基酸；Th是輔助T細(xì)胞抗原決定基，其類似物或片段；IgE CH4肽是SEQ ID No1或其免疫原性類似物；n是從1到10；m是從1到4；o是從0到10；p是從1到3。
2.權(quán)利要求1的肽免疫原；其中p是1。
3.權(quán)利要求1的肽免疫原；其中Th選自SEQ ID Nos5-12，14，26-36，61和其免疫原性類似物或其片段。
4.權(quán)利要求2的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID Nos5-12，14，26-36，61和其免疫原性類似物或片段。
5.權(quán)利要求1的肽免疫原，選自SEQ ID Nos13，15-23，37-50，51-56和62。
6.權(quán)利要求3的肽免疫原，選自SEQ ID Nos51-56和62。
7.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中A是脂肪酸。
8.權(quán)利要求2的肽免疫原，其中A是脂肪酸。
9.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中A是脂肪酸衍生物。
10.權(quán)利要求2的肽免疫原，其中A是脂肪酸衍生物。
11.權(quán)利要求9的肽免疫原，其中脂肪酸衍生物是Pam3 Cys。
12.權(quán)利要求10的肽免疫原；其中脂肪酸衍生物是Pam3 Cys。
13.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求1的肽免疫原。
14.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求2的肽免疫原。
15.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求3的肽免疫原。
16.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求4的肽免疫原。
17.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求5的肽免疫原。
18.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求6的肽免疫原。
19.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求7的肽免疫原。
20.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求8的肽免疫原。
21.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求9的肽免疫原。
22.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求10的肽免疫原。
23.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求11的肽免疫原。
24.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求12的肽免疫原。
25.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求9的肽免疫原的混合物。
26.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求10的肽免疫原的混合物。
27.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求11的肽免疫原的混合物。
28.一種疫苗組合物，包含在藥用上可接受的傳遞系統(tǒng)中的有效量的權(quán)利要求12的肽免疫原的混合物。
29.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求13的疫苗組合物。
30.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗組合物。
31.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物。
32.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求16的疫苗組合物。
33.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求17的疫苗組合物。
34.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗組合物。
35.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗組合物。
36.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求20的疫苗組合物。
37.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21的疫苗組合物。
38.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗組合物。
39.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗組合物。
40.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求24的疫苗組合物。
41.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求25的疫苗組合物。
42.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求26的疫苗組合物。
43.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗組合物。
44.一種治療過敏反應(yīng)的方法，經(jīng)過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求28的疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過使用以放射狀分枝的多聚體形式(如分枝的八聚體或十六聚體肽)或線型排列的單體形式的合成肽免疫原組合物來(lái)抑制肥大細(xì)胞激活和減少過敏原誘導(dǎo)的IgE產(chǎn)生在包括人類的健康動(dòng)物中誘導(dǎo)抗人IgE重鏈中的效應(yīng)物部位，即ε-鏈CH
文檔編號(hào)C07K16/00GK1146772SQ95192778
公開日1997年4月2日 申請(qǐng)日期1995年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月28日
發(fā)明者C·Y·王 申請(qǐng)人:美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司