專利名稱：一種增強(qiáng)肽段免疫活性的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用多肽合成的方法建立一種多肽結(jié)構(gòu)，即將多拷貝抗原肽片段 與一個(gè)VKGFY多肽片段相連。按照這種方式制備而成的多肽分子具有提高機(jī)體免 疫系統(tǒng)對(duì)抗原肽片段的免疫反應(yīng)?？勺鳛槊庖咧苿┯糜趯?duì)疾病的預(yù)防和對(duì)疾病的 生物(免疫)治療，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物體的遺傳基因被存儲(chǔ)在多聚核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執(zhí)行生物學(xué)功 能的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，它們行使著各種生物學(xué)功能維持生命 活動(dòng)。蛋白質(zhì)的種類雖然多不勝舉，但它們都是由20個(gè)自然界存在的天然氨基 酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的千差萬別。 一般來 說，含有50個(gè)以上氨基酸的分子被稱為蛋白質(zhì)，50個(gè)以下的被稱為短肽。目前 發(fā)現(xiàn)最小的功能小肽是只含有3個(gè)氨基酸的3肽物質(zhì)"促甲狀腺素釋放激素" (TRH)。
由于人類基因組計(jì)劃的完成和人類蛋白組計(jì)劃的開展，將會(huì)有越來越多的蛋 白質(zhì)功能片段被發(fā)現(xiàn)并被作為藥物應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域中來?，F(xiàn)己開發(fā)并在臨床 上得到應(yīng)用的多肽藥物有"催產(chǎn)素"、"胸腺肽ci 1"、"胸腺五肽"等，有在天 然肽鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改構(gòu)制備成為用于治療消化道出血和肢端肥大癥的多 肽藥物"奧曲肽"等。蛋白質(zhì)中的功能片段常常能篩選到含有幾十個(gè)或小到只有 三個(gè)氨基酸組成的多肽片段，它們?yōu)槿斯ず铣傻鞍踪|(zhì)功能片段并將它們投入應(yīng)用 奠定了基礎(chǔ)。
按照人為的預(yù)先設(shè)計(jì)將具備特定生物學(xué)功能的短肽連接在一起，經(jīng)過人為加 工改造而產(chǎn)生的多功能多肽片段達(dá)到預(yù)期的目的。這是繼"基因工程"后時(shí)代拓展而出的又一項(xiàng)生物技術(shù)——"多肽工程"。"多肽工程"在應(yīng)用領(lǐng)域中具備如下 的優(yōu)勢(shì)-
1. 多肽產(chǎn)物可企業(yè)話大規(guī)模地合成，產(chǎn)量高，純度高。
2. 多肽藥物的用量小，生物活性高，毒性低。
3. 生產(chǎn)多肽藥物的企業(yè)占地小，設(shè)備簡(jiǎn)單，設(shè)備周轉(zhuǎn)利用率高，企業(yè)屬低能耗， 低排放、低污染的綠色環(huán)保型企業(yè)。
多肽制藥是一個(gè)新興的制藥領(lǐng)域，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和"多肽工 程"的深入發(fā)展，必將會(huì)有更多的多肽藥物面市。

發(fā)明內(nèi)容
人體的免疫器官主要有胸腺、骨髓、脾臟、淋巴結(jié)等。脾臟是人體最大的伊 疫器官，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞都在脾臟內(nèi)部發(fā)育成熟，如果脾臟被摘除會(huì)導(dǎo) 致機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能的紊亂，發(fā)生暴發(fā)性感染。
美國Tufts大學(xué)教授Najjara于1970年發(fā)現(xiàn)一種脾臟來源的四肽物質(zhì)TKPR 具有顯著的抗腫瘤、抗病毒的活性并被命名為Tuftsin,中文名為"促吞噬素"。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tuftsin能使脾內(nèi)脾小體增多，生發(fā)中心生長活躍。Tuftsin能夠提高粒 細(xì)胞，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的趨化、游離、吞噬活性，提高免疫細(xì)胞 分泌細(xì)胞因子IL-1、IL-2、TNF- a 、IFN- y 、INF- e等，提高T淋巴細(xì)胞的TH1/Th2 平衡向TH1方向偏移，提高細(xì)胞毒的作用，增強(qiáng)機(jī)體淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞免疫活性。
Tuftsin對(duì)肺癌、肝癌、胃癌、黑色素細(xì)胞瘤、膽管癌等多種惡性腫瘤具有較 明顯的治療效果。Tuftsin抗腫瘤的機(jī)制主要與它既能促進(jìn)粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞 的游走、吞噬、抗原遞呈和細(xì)胞毒功能外，又能增加白細(xì)胞的數(shù)目并刺激提高T 淋巴細(xì)胞的功能有關(guān)。Tuftsin作為一個(gè)參與免疫調(diào)節(jié)的體液因子具有顯著的抗腫 瘤、抗感染和抗病毒的生物學(xué)活性。據(jù)報(bào)道國外已開始將Tuftsin用于對(duì)晚期惡 性腫瘤和AIDS的治療。機(jī)體內(nèi)的專職抗原遞呈細(xì)胞，包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì) 胞等都是從同一個(gè)始祖細(xì)胞分化發(fā)育而來，它們具有對(duì)外來抗原的胞飲吞噬，抗 原加工和遞呈的功能。Tuftsin本身是一個(gè)僅含有4個(gè)氨基酸TKPR的小肽(4 肽)，無抗原性，它可以特異性的結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞表面的受體，促進(jìn)細(xì)胞的吞 噬，抗原加工和遞呈。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以Tuftsin作為抗原肽載體共價(jià)連接人工合成的 抗原小肽能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)無抗原性，或抗原性很低的小肽的免疫反應(yīng)，提高抗體 滴度和體內(nèi)細(xì)胞因子N0、 TNF、 IL-1、 IL-2、 IFN-y的分泌水平，能夠誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，激發(fā)CD4， Thl類型的免疫反應(yīng)。因此Tuftsin不僅具有激發(fā) T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，同時(shí)還有激發(fā)B淋巴細(xì)胞的體液免疫的活性。
以Tuftsin的功能為模板，經(jīng)過篩選尋找到VKGFY是一個(gè)具有較強(qiáng)生物活性 的5肽分子。將多拷貝抗原肽片段以(抗原肽片段-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，(抗原 肽片段-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY，或(抗原肽片段-Xn) 8— (K-Xn) 4— (K-Xn) 2-K-Xn-VKGFY的形式與一個(gè)VKGFY多肽片段連接，形成的產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)為借助在C 端VKGFY的幫助把與之相連的多拷貝抗原肽片段帶進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞，通過在細(xì)胞 內(nèi)的加工和遞呈將抗原信息傳遞給淋巴細(xì)胞。增強(qiáng)抗原肽片段的抗原性，提升抗 體滴度，提高細(xì)胞免疫因子的分泌水平，提高T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞對(duì)抗原肽 片段產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
按照本發(fā)明闡述的制備方式，合成產(chǎn)生的免疫制劑能夠提高機(jī)體針對(duì)抗原 肽片段產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。合成產(chǎn)物可以作為藥物或多肽疫苗應(yīng)用在疾病預(yù)防或疾 病的生物(免疫)治療。
具體設(shè)計(jì)方式
多肽合成常用的方法為固相合成法，多肽合成的原理是根據(jù)氨基酸兩端的氨 基和羧基之間的縮合反應(yīng)形成酰胺鍵(肽鍵)連接延長肽鏈。首先將多肽片段的 羧基端氨基酸的羧基與固相樹脂共價(jià)相連，合成的順序是從肽段的羧基端(c-端)向氨基端(N-端)方向延長，多肽合成完成后再將合成的多肽產(chǎn)物從固相樹 脂由于一個(gè)賴氨酸(K)有兩個(gè)氨基可供縮合聯(lián)接氨基酸并延長肽鏈。所以在賴 氨酸的2個(gè)氨基上可以繼續(xù)往下連接氨基酸或延長肽鏈形成分支肽，通過賴氨酸 的這個(gè)特性可將多拷貝的抗原肽片段并聯(lián)起來形成如下結(jié)構(gòu)序列的多肽產(chǎn)物
1 一種多肽分子結(jié)構(gòu)，它由多拷貝抗原肽片段和一個(gè)VKGFY多肽片段兩部分 組成，其中多拷貝并聯(lián)的抗原肽片段的C端與一個(gè)VKGFY片段的N端相連。 抗原肽片段可以是任意一個(gè)需要激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的抗原肽片段。
2 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由2個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段與一個(gè)VKGFY片段連 接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY,其中n代表由n個(gè)天 然氨基酸(X)連接成的肽鏈，n為自然數(shù)，X代表任意L型或D型天然氨 基酸，以下各項(xiàng)多肽結(jié)構(gòu)中的解釋與此相同。
3 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由4個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段與一個(gè)VKGFY片段連 接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由8個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段與一個(gè)VKGFY片段連 接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)8-(K-Xn)4-(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5 按照以上權(quán)利要求的方式合成的多肽產(chǎn)物可制備成為藥物原料或醫(yī)藥制 劑。
6 按照以上權(quán)利要求的方式合成的多肽產(chǎn)物可制成多肽疫苗或藥品用于對(duì)疾 病的預(yù)防和對(duì)疾病的生物(免疫)治療。
根據(jù)以上設(shè)計(jì)并通過多肽合成的方式制備而成的合成產(chǎn)物在體內(nèi)具有顯 著提高抗原肽片段的免疫學(xué)活性的作用。制備的合成產(chǎn)物可以作為多肽疫苗或藥 物對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防或治療。
實(shí)施例1
按照(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY的設(shè)計(jì)方式，將2個(gè)拷貝并聯(lián)的癌胚抗 原肽CEA (YLSGADLNL) 9肽的C端與VKGFY片段的N端連接，合成產(chǎn)物為 (YLSGADLNL)2-K-VKGFY。經(jīng)過分離純化使得合成產(chǎn)物純度達(dá)到98%以上用于制備 免疫制劑。一.劑型
注射用凍干粉針。規(guī)格
lmg/安瓿。
處方組成
原輔料 用量
制備工藝-
溶液配制:
合成產(chǎn)物lg
甘露醇50g
磷酸二氫鈉(NaH2P04-2H20)0. 796g
磷酸氫二鈉(Na2HP(V 12H20)1. 755g
注射用水加至1000ml
共制成1000瓶
在100級(jí)無菌室內(nèi)操作。
磷酸緩沖液的配制
① 0.2mol/L NaH2P04:準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鈉(Na跳.2柳17.8g，加注射 用水溶解并定溶至500ml，搖勻，備用；
② 0. 2mol/L Na2HP04:準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20 ) 35. 82g，加注 射用水溶解并定溶至500ml，搖勻，備用；
③ 10鵬ol/L磷酸緩沖液(p服.8 ):取51ml 0. 2mol/L NaH2P04溶液、 49ml0. 2mol/L化2冊(cè)04溶液混勻，并定溶至2000ml ，用磷酸調(diào)pH值至6. 8備用。
藥液配制-
按照配方準(zhǔn)確稱取處方量的甘露醇和合成產(chǎn)物，用10ramol/L磷酸緩沖液 (pH6.8)溶解并定溶至lOOOtnl。準(zhǔn)確稱取配制液體積0. 2% (W/V)的活性碳，
加入上述溶液中，攪拌15分鐘；取上述溶液粗濾兩遍脫炭，再用0.2口m微孔濾膜進(jìn)行正壓無菌過濾，4'游放備用。 分裝與冷凍
在無菌室內(nèi)操作；取上述精濾液測(cè)定含量，調(diào)整裝量，取lml分裝于3ml 藥用安瓿瓶中；制品2(TCX冷凍干燥機(jī)，預(yù)凍3小時(shí)使制品溫度至-40'C(板溫預(yù)
先冷至-20°0，保溫1小時(shí)，制冷冷凝器溫度至-55'G開啟真空泵，使干燥箱內(nèi)
真空度達(dá)到8.0xl(T2mBar左右，對(duì)板層加熱升溫，每小時(shí)升溫5°G 6小時(shí)后板
溫至-10Tg定，品溫隨板溫約每小時(shí)升溫3°C真空度維持在6.0x10—2mBar左右，
約干燥8小時(shí)，品溫至共熔點(diǎn)-15T2E右，制品水層消失；而后對(duì)板層繼續(xù)加熱升
溫，速率為每小時(shí)5°C 7小時(shí)后板溫至25°C品溫約經(jīng)14小時(shí)至25°C保溫3
小時(shí)，干燥箱極限真空度為6.0x10—2mBar左右；停機(jī)，將安瓿封口即得。
工藝驗(yàn)證
按照處方制備工藝，制備三批注射用凍干粉針，考察成品的合格率需大于
90%。隨機(jī)抽樣檢測(cè)成品的理化性質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)、含量、熱源、細(xì)菌的含量。
要求不同批次的制劑含量與標(biāo)示量基本一致，有關(guān)物質(zhì)在制備前后無明顯變 化，無菌、無熱源、血管刺激性、溶血性及過敏性試驗(yàn)均為陰性。
原輔料的來源及質(zhì)量規(guī)格:_
原輔料 質(zhì)量規(guī)格 來源 用途
合成產(chǎn)物 符合暫定標(biāo)準(zhǔn) 自制 主藥
甘露醇 CP. 2000 89頁 北京制藥廠 支撐劑
磷酸二氫鈉 CP. 2000 1058頁 蘇州中化藥品有限公司 緩沖鹽
磷酸氫二鈉 GB1263-86 蘇州中化藥品有限公司 緩沖鹽
注射用水 CP. 2000 428頁 北京制藥廠 溶劑
針用活性炭 CP. 2000 465頁 北京大力活性炭廠 吸附劑包裝規(guī)格-儲(chǔ)存
成品為白色凍干粉針，lmg/安瓿，10安瓿/盒 2-8'C避光保存，有效期3年。
二.劑型
注射用水針。
規(guī)格
lmg/ml/安瓿。
處方組成:
原輔料
用量
合成產(chǎn)物
注射用水加至
共制成
1000瓶
制備工藝
溶液配制在100級(jí)無菌室內(nèi)操作。
精確稱量合成產(chǎn)物，取無菌注射用水將其溶解并定溶在1000ml。用0.2ym微孔 濾膜進(jìn)行正壓無菌過濾后取lml分裝于3ml藥用安瓿瓶中封口。
成品在包裝時(shí)目測(cè)封口是否整齊光滑，做內(nèi)容物的外觀、色澤、澄明度檢查。 隨機(jī)抽査成品的裝量、含量、有關(guān)物質(zhì)，細(xì)菌、熱源的檢査需達(dá)到質(zhì)檢標(biāo) 準(zhǔn)。局部刺激試驗(yàn)、溶血性及過敏性試驗(yàn)均需為陰性。
包裝規(guī)格 lmg/ml/安瓿，10支安瓿/盒。 保存方式 4'C避光保存，有效期1年。
使用方式 取lmg/安瓿用注射用水溶解內(nèi)容物，做皮下注射。每周1次，連 續(xù)6次一個(gè)療程。 制備和使用方法可做適當(dāng)變通而不必拘泥于此。
實(shí)施例2
合成產(chǎn)物可用于對(duì)病人外周血中分離提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行刺激，病人自身的 免疫細(xì)胞經(jīng)過刺激能夠提高識(shí)別和殺傷外來致病體或腫瘤細(xì)胞的能力，加強(qiáng)病人 抵抗疾病的能力。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,縮寫DC)是唯一能夠觸發(fā)靜息T淋巴細(xì)胞 并啟動(dòng)初始免疫反應(yīng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)。將分離培養(yǎng)的DC經(jīng)過與合成產(chǎn)物 的共同孵育，將經(jīng)過合成產(chǎn)物負(fù)載或沖擊的DC細(xì)胞重新回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)， 回輸?shù)腄C能夠提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。 1采集患者外周血細(xì)胞20ml，加入肝素20u/ml。 2用RPMI 1640培養(yǎng)液對(duì)血液進(jìn)行對(duì)半稀釋，混勻。
3在50ml離心管內(nèi)加入10ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，在其 上緩慢加入20ml血液稀釋液。在4。C， 2000 rpm ， 20分鐘離心分離外周單 核細(xì)胞(PBMCs)
4小心吸出層內(nèi)的PBMCs，用5X體積的PBS洗滌細(xì)胞2次，再用RPMI 1640
培養(yǎng)液洗滌一次。洗滌條件為4 °C， 1500 rpm ， 5分鐘。 5用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度在2x107ml (用0. 2%臺(tái)盤藍(lán)進(jìn)行活
細(xì)胞計(jì)數(shù))然后種植在12孔板，2xl07孔，或種植在25ml塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，
置37 °C ， 5% C02培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。 6吸出未貼壁的細(xì)胞，用溫的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次。而貼壁細(xì)胞體積小，
多為圓形。
7加入含有粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF ) 1000 U/ml (杭州九源公司， P印rotech公司)，白介素-4(rhlL-4 ) 1000U/ml (P印rotech公司)，20%FCC 的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)6天，每3天換一次培養(yǎng)液。在倒置顯 微鏡下培養(yǎng)3天的細(xì)胞可見體積變大，有大突起。培養(yǎng)7天可見細(xì)胞已形成 毛刺狀突起，第9天細(xì)胞突起變細(xì)，變?yōu)榈湫偷腄C細(xì)胞。
8免疫沖擊刺激向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入合成的多肽產(chǎn)物10ug/lxl(fcells/ml， 繼續(xù)孵育24-48小時(shí)。
9收獲細(xì)胞。
10回輸給患者，回輸?shù)腄Cs細(xì)胞量在lxl06-l(f之間，治療方式為1-3月1次。 經(jīng)過合成產(chǎn)物負(fù)載或沖擊處理過的患者自體DC細(xì)胞具有加快細(xì)胞增殖，提 高DC細(xì)胞特異性捕捉和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，具有提高患者對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫 抵抗能力。
以上方式僅供參考而不必拘泥于此。
權(quán)利要求
1.一種多肽分子結(jié)構(gòu)，它由多拷貝抗原肽片段和一個(gè)VKGFY多肽片段兩部分組成，其中多拷貝并聯(lián)的抗原肽片段的C端與一個(gè)VKGFY多肽片段的N端相連?？乖钠慰梢允侨我庖粋€(gè)需要激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的抗原肽片段。
2. 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由2個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段并聯(lián)與一個(gè)VKGFY 片段連接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)2-K-Xn-VKGFY，其中n代表 由n個(gè)天然氨基酸(X)連接成的肽鏈，n為自然數(shù)，X代表任意L型或D 型天然氨基酸，以下各項(xiàng)多肽結(jié)構(gòu)中的解釋與此相同。
3. 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由4個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段與一個(gè)VKGFY片段連 接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)廠(K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
4. 本多肽分子結(jié)構(gòu)可以是由8個(gè)拷貝并聯(lián)的抗原肽片段與一個(gè)VKGFY片段連 接組成，其結(jié)構(gòu)為(抗原肽片段-Xn)s-(K-Xn)f (K-Xn)2-K-Xn-VKGFY。
5. 按照以上權(quán)利要求的方式合成的多肽產(chǎn)物可制備成為藥物原料或醫(yī)藥制 劑。
6. 按照以上權(quán)利要求的方式合成的多肽產(chǎn)物可制成多肽疫苗或藥品用于對(duì)疾病的預(yù)防和對(duì)疾病的生物(免疫)治療。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種增強(qiáng)肽段免疫活性的制備方法和用途，涉及應(yīng)用多肽合成的方法建立一種多肽分子結(jié)構(gòu)方式，將一種含有多拷貝并聯(lián)的抗原肽分子的C端與一個(gè)VKGFY多肽片段的N端相連的結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。本方式制備的產(chǎn)物具有提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原肽片段的免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，按照此方式制備的合成產(chǎn)物可用于對(duì)疾病的預(yù)防和疾病的生物(免疫)治療。
文檔編號(hào)C07K14/005GK101307098SQ200710099348
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2007年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者蘇 韓 申請(qǐng)人:北京中天康泰生物科技有限公司