專利名稱:肽抗生素的制作方法
本發(fā)明涉及新的肽抗生素及它們作為抗微生物和抗腫瘤藥物的使用。本發(fā)明還涉及到這些抗生素及其中間產(chǎn)物的制備方法和通過發(fā)酵制備這些物質(zhì)的新微生物。
從土壤樣品中分離到了各種微生物，并在合成培養(yǎng)基中對它們進行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們能合成具有抗生素活性的產(chǎn)物。從在希臘雅典的巴臺農(nóng)神廟附近收集的土壤樣品中，我們分離到了一種新的細(xì)菌，K481-B101，并發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生一種具有抗生素活性的混合肽類。
本發(fā)明的主要目的是提供可特別作為抗真菌和抗腫瘤藥物使用的新的肽抗生素。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備這些抗生素的合適的方法。
本發(fā)明進一步的目的是提供含有這些抗生素的藥物組合物。
根據(jù)上述目的，本發(fā)明是一個具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物
其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH(CH2)2或CH3-(CH2)8。
另一方面，本發(fā)明包括含有一定數(shù)量的單一的或組合的這些化合物的藥物組合物，這些化合物是抗真菌和/或抗腫瘤的有效藥劑，藥物組合物中還含有一種可作為藥物接受的載體。
在制備方面，本發(fā)明是一種制備具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物的方法
其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH(CH2)2或CH3-(CH2)8，該方法包括在好氧條件下，在含有可同化碳源和氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Polyangium brachysporum sp.nov.，分離產(chǎn)生的菌絲體及從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收化合物。
在組合物方面，本發(fā)明包括化合物
它們可作為中間產(chǎn)物用于本發(fā)明化合物的制備中，還包括制備這些中間產(chǎn)物化合物的方法。
圖1、2和3分別為Bu-2867TA、B和C的紅外光譜。
圖4和5為Bu-2867TA的1H-核磁共振譜和13C-核磁共振譜。
K481-B101的形態(tài)、培養(yǎng)及生理特征是通過Mc Curdy，Jr.H.D.粘細(xì)菌目(Myxobacterales)的分類學(xué)研究Ⅱ，多囊粘菌屬(Polang-ium)和堆囊粘菌科(Sorangiaceae)的死亡Intl.J.Syst.Bacteriol.20∶283～296，1970;Reichenbach，H.∶Nannocystis exedens gen.nov.、sp.nov.，堆囊粘細(xì)菌科的一種新的粘細(xì)菌Arch.Mikrobiol.70∶119～138，1970;Christensen，P.和F.D.CookLysobacter，一種具有高堿基比率的無子實粘滑細(xì)菌的新屬Intl.J.Syst.Bacteriol.28∶367～393，1978;Christensen，P.Flavobacterium pectinovo-rum Dorey和Cytophage johnsonae Stanier的同物異名性Intl.J.Syst.Bacteriol.27∶122～132，1977等文中所述方法確定的。通過Peterson，J.E.粘細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和保持，見于《Methods in Microbiology》3B∶185～210，1969，J.R.Norris及D.W.Ribbons主編，Academic Press(London and New York);Reichenbach，H.及M.Dworkin粘細(xì)菌目，見于《Prokaryotes》，卷Ⅰ∶328～355，1981，M，P，Starr等人主編，Springer-Verlag(Berlin，Heidelberg and New York)等文中所述的方法進行保持和純化。分類位置根據(jù)《Bergey′s Manual》，第八版，1974及《The Prokarytes》，卷Ⅰ中的描述確定。
形態(tài)學(xué)利用casitone-Mg
瓊脂、幾丁質(zhì)瓊脂、酵母細(xì)胞瓊脂和兔糞顆粒-水瓊脂進行形態(tài)學(xué)研究。K481-B101是一種革蘭氏陰性、沒有鞭毛的細(xì)菌。營養(yǎng)細(xì)胞是兩端為鈍圓頭的圓柱體(0.6～0.8×2～10微米)。在瓊脂培養(yǎng)基或軟瓊脂培養(yǎng)基的潮濕表面上，營養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)出柔性的緩慢滑動。粘孢子與營養(yǎng)細(xì)胞明顯不同，它們是橢圓體或球形的，0.6～0.8×0.6～1.5微米，不可屈折或可屈折，有時成對存在。K481-B101在大多數(shù)所述瓊脂培養(yǎng)基上形成由無柄孢子囊包裹的粘孢子。孢子囊為橢圓體、球形或枕形，大小差別較大，為12×20至80×120微米不等，通常由一層共同的包膜或粘液層包裹，雙波狀輪廓，以單個或成串(sori)的形式存在。表1給出了K481-B101的形態(tài)學(xué)特征。
培養(yǎng)特征K481-B101在casitone-Mg
瓊脂(Mc Curdy，1969)和酵母細(xì)胞瓊脂(Christensen和Cook，1978)上能正常生長，但不能在Bacto-營養(yǎng)瓊脂或Bacto-心浸液瓊脂上正常生長。在YP-軟瓊脂上(0.3%酵母提取物、0.1%蛋白胨、0.01%NaCl、0.3%瓊脂、pH6.6～6.8)可觀察到假根或羽狀菌群，但在casitone-Mg
瓊脂上不行。casi-tone-Mg
瓊脂上的菌落為圓形的，半透明或呈淺綠黃色，在瓊脂中蝕刻、侵入和穿透較輕微。表2給出了培養(yǎng)特征。
生理特征K481-B101水解淀粉、幾丁質(zhì)、白明膠、酪蛋白，但不水解纖維素和瓊脂。它溶解經(jīng)過高壓殺死的酵母細(xì)胞，但不溶解藤黃細(xì)球菌(Micrococcus leteus)的活細(xì)胞。K481-B101適于常溫，并對于2%Na Cl敏感。表3給出了生理特征。
鞭毛細(xì)菌的共存及自發(fā)變種的產(chǎn)生在最初培養(yǎng)中觀察到革蘭氏陰性、桿狀鞭毛細(xì)菌的共存。利用粘孢子或子實體，結(jié)合使用常規(guī)的稀釋及用聲處理、熱休克處理或抗生素敏感性處理(如用50微克/毫升的pipemidic acid)分離單個細(xì)胞的技術(shù)，使K481-B101得到了相當(dāng)好的純化。未純化的K481-B101的培養(yǎng)物產(chǎn)生粘液狀變種，它們形成帶白色的具菌群環(huán)的圓丘形菌落。這些粘液狀變種的營養(yǎng)細(xì)胞比母本菌株略大，為0.8～1.0×2.0～3.5微米。孢子囊串(sorus)主要是由粘液狀變種形成。
分類位置
K481-B101是一種具子實的粘滑細(xì)菌，從土壤樣品中分離得到。該菌株的主要鑒別性狀如下營養(yǎng)細(xì)胞1)直徑一致的圓柱體狀2)頂端不逐漸變細(xì)3)可透入瓊脂基質(zhì)4)不吸附剛果紅粘孢子1)從營養(yǎng)細(xì)胞分化而來2)橢圓體或球形3)不可屈折或可屈折孢子囊1)無柄2)橢圓體、球形或不規(guī)則的3)通常由一層共同包膜或粘液層包裹4)雙波狀輪廓5)淺黃色(缺乏清晰可辨的顏色)6)以單個或成串(sori)的形式存在培養(yǎng)及生理性狀1)金黃色至蒼白色的菌落2)菌落在瓊脂中蝕刻、侵入及穿透較輕微3)水解幾丁質(zhì)，但不水解纖維素4)溶解酵母細(xì)胞，但不溶解藤黃細(xì)球菌K481-B101的上述形態(tài)、培養(yǎng)和生理性狀表明，K481-B101應(yīng)分入粘細(xì)菌目。根據(jù)營養(yǎng)細(xì)胞端頭逐漸變尖和子實體形態(tài)的性狀來看，粘細(xì)菌目中的粘球菌屬(Myxococcus)、原囊粘菌屬(Archangium)和孢囊桿菌屬(Cystobacter)與K481-B101有區(qū)別。蜂窩囊菌屬(Melittangium)、標(biāo)記菌屬(stigmatella)和軟骨霉?fàn)罹鷮?Chondromyces)由于孢子囊有柄而不同于K481-B101。
K481-B101與多囊粘菌屬和侏囊菌屬(Nannocystis)相似。在橢圓體和球形粘孢子、橢圓體或球形單孢子囊的形成方面，K481-B101與侏囊菌屬相似，K481-B101與囊菌屬的區(qū)別在于，直徑一致的圓柱體營養(yǎng)細(xì)胞和缺乏在瓊脂中蝕刻、侵入和穿透的能力。在具有鈍圓頭的圓柱體營養(yǎng)細(xì)胞、不可屈折的粘孢子和橢圓體或球形、雙波輪廓孢子囊的顯著形成方面，K481-B101與多囊粘菌屬相似。在對粘細(xì)菌目各屬進行比較研究所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，認(rèn)為K481-B101應(yīng)作為一個種分入多囊粘菌屬。在多囊粘菌屬的種中，P.leteum在營養(yǎng)細(xì)胞的大小、孢子囊的顏色和形狀以及營養(yǎng)菌落的顏色等方面與K481-B101相似。然而，K481-B101在非常緊縮的橢圓體或球形粘孢子以及不能溶解活細(xì)菌細(xì)胞如藤黃細(xì)球菌的細(xì)胞等方面，與P.leteum不同。
因此，K481-B101被斷定為粘細(xì)菌目、多囊粘菌科的多囊粘菌屬中的一個新種，并提議命名為Polyangium brachysporum sp.nov.。典型菌株編號為K481-B101(單細(xì)胞分離)，培養(yǎng)物已寄存于美國典型培養(yǎng)物收集中心，登記號為ATCC53080。
表1.K481-B101的形態(tài)學(xué)營養(yǎng)細(xì)胞革蘭氏陰性。兩端為鈍圓頭的圓柱體(0.6～0.8×2.0～10微米)。不吸附剛果紅。
粘孢子可與營養(yǎng)細(xì)胞相區(qū)別。收縮得多，變?yōu)闄E圓體成球形，0.6～0.8×0.6～1.5微米，不可屬折。長時間培養(yǎng)產(chǎn)生可屈折的粘孢子。
孢子囊無柄，以單個或成串形式存在。橢圓體、球形、枕形或無固定形狀。大小變化很大，12×20至80×120微米。由一層共同的包膜或粘液層包裹。雙波狀輪廓。包理于瓊脂之中。二至十個或更多的孢子囊串總長范圍為50至300微米。
小菌落在幾丁質(zhì)瓊脂上培養(yǎng)2星期之后。營養(yǎng)細(xì)胞鏈周邊為柵欄狀或鋸齒狀排列?？捎^察到單個細(xì)胞的滑動，但看不到細(xì)胞群的滑動。
表2.K481-B101菌落在casitone-Mg
瓊脂(Mc-Curdy，1969)上于28℃培養(yǎng)6天后的形狀形狀圓形表面光滑，后期有部分皺折正視隆起邊緣完全或部分不規(guī)則，沒有如舌形、羽毛形或假根形的明顯突出光學(xué)性質(zhì)半透明或不透明菌落顏色淡綠黃色可擴散色素?zé)o在幾丁質(zhì)瓊脂上于28℃下培養(yǎng)3星期以后。
薄的，半透明，淡黃或無色。厚的，不透明，周邊白中帶黃色。在周邊形成同心的孢子囊。在瓊脂中蝕刻、侵入和穿透較輕微。
表3.K481-B101的生理性狀水解性質(zhì)可溶淀粉 +土豆淀粉 +羧甲基纖維素鈉 +纖維素 -瓊脂 -幾丁質(zhì) +藻酸鈉 -聚果膠酸鈉 -白明膠 +
酪蛋白 +生長基質(zhì)Simon氏檸檬酸鹽瓊脂 -Christensen氏檸檬酸鹽瓊脂 -葡萄糖銨鹽瓊脂 -滅冬酰胺銨鹽瓊脂 +生成產(chǎn)物吲哚 -H2S +3-羥基-2-丁酮(VP-反應(yīng)) -脲酶 +氧化酶 +過氧化氫酶 +溶解能力藤黃球細(xì)菌的PCI1001和 -ATCC9341菌株的活細(xì)胞 +高壓殺死的酵母細(xì)胞 +反應(yīng)牛奶凝固 -牛奶胨化 +Na Cl耐受力生長1.0%或更少的Na Cl不生長2.0%或更多的Na ClpH耐受力生長范圍pH5.5～10.5勉強生長pH5.0不生長pH4.5和11.5生長溫度最佳生長37℃
生長范圍15℃～42℃不生長10℃和45℃氧化或發(fā)酵反應(yīng)氧化的(Hugh和Leigson培養(yǎng)基)抗生素生產(chǎn)Polyangium brachysporum K481-B101的原種培養(yǎng)物于28℃下斜面瓊脂培養(yǎng)基上增殖三滅，培養(yǎng)基組成為0.5%可溶淀粉、0.5%葡萄糖、0.1%肉提取物、0.1%酵母提取物、0.2%Nz-case)、0.2%NaCl、0.1%CaCO3和1.6%瓊脂(pH7.0)。將生長良好的瓊脂斜面用來給營養(yǎng)培養(yǎng)基接種，該培養(yǎng)基組成為2%玉米淀粉、3%大豆粉、0.3%Mg SO4·7H2O和1%Ca CO3(滅菌前pH7.0)。在旋轉(zhuǎn)搖床(250rpm)上于28℃下培養(yǎng)3天后，將5毫升生長物轉(zhuǎn)移至500毫升的Erlenmeyer氏瓶中，該瓶中含有100毫升與營養(yǎng)培養(yǎng)基組成相同的生產(chǎn)培養(yǎng)基。
用盤狀紙片瓊脂擴散法監(jiān)測抗生素的生產(chǎn)，用白色念珠菌(Candidaalbicans)A9540菌株作為測試生物。發(fā)酵在旋轉(zhuǎn)搖床上于28℃下持續(xù)進行四天后，抗生素生產(chǎn)量達到100微克/毫升的最大值。
還使發(fā)酵在攪拌-旋轉(zhuǎn)發(fā)酵罐中進行。將通過玻璃瓶發(fā)酵得到的原種培養(yǎng)物500毫升，用來給容量為20升的容器中的10升生產(chǎn)培養(yǎng)基接種。發(fā)酵在28℃下進行，并伴以250rpm的攪拌和每分鐘10升的通氣。發(fā)酵四十小時后，抗生素生產(chǎn)量達到150微克/毫升的最大值。
抗生素的分離與純化將發(fā)酵肉湯(48升)借助于沙氏離心機進行離心。菌絲沉淀塊與7升甲醇進行勻漿，將混合物攪動一小時。通過過濾去除不溶物后，將甲醇提取液蒸發(fā)成水溶液，將此水溶液與肉湯過濾液合并并用正丁醇(24升)萃取。萃取液濃縮至0.5升，在攪拌下將其傾入正己烷(3.5升)中以沉淀粗制抗生素(41克)。將此固體在硅膠C-200(760毫升)柱上進行層析，用乙酸乙酯和含量逐漸上升的甲醇(0～50%)進行洗脫。用白色念珠菌A9540菌株作為測試生物通過盤狀紙片測試法檢測洗脫物的生物活性。合并活性部分并進行蒸發(fā)直至產(chǎn)生BU-2867T復(fù)合物的淺黃色粉末(13克)。將200毫克此固體在反相柱(C18，100毫升)上進行層析，用乙醇-水(3∶7至5∶5)作為洗脫液。用抗真菌生物測試法和薄層層析法(硅化的，EtoH∶H2O＝55∶45)監(jiān)測洗脫物。將第一活性部分合并并進行減壓蒸發(fā)以產(chǎn)生BU-2867 TA的純白固體(61毫克)，使此固體在含水甲醇中結(jié)晶產(chǎn)生無色針狀晶體(34毫克)。蒸發(fā)第二和第三活性部分分別產(chǎn)生BU-2867 TB(1毫克)和C(11毫克)。BU-2867 TC以細(xì)小針狀從甲醇中結(jié)晶出來。重復(fù)上述反相層析過程總共產(chǎn)生3.9克BU-2867 TA、44毫克BU-2867 TB和342毫克的BU-2867 TC。
抗生素的特征鑒定BU-2867 TA和C以無色針狀結(jié)晶分離出來，而BU-2867 TB是以白色無定形粉末形式得到的。它們易溶于甲醇、乙醇、正丁醇和二甲基亞砜，微溶于氯仿、乙腈和乙酸乙酯，基本上不溶于正己烷和水。它們對于Rydon-Smith測劑呈陽性反應(yīng)，在薄層層析上噴灑碘或硫酸呈染色反應(yīng)。它們對于茚三酮、Sakaguchi、蒽酮和Dragendorff反應(yīng)為陰性。通過質(zhì)譜分析和微量分析，BU-2867 TA、B和C分別確定為C27H44N4O6、C29H46N4O6和C29H48N4O6。這三種成分在甲醇中的紫外光譜在261nm處顯示出單吸收峰，此峰在酸性或堿性溶液中不發(fā)生漂移。BU-2867 TA、B和C的物理化學(xué)數(shù)據(jù)概括于表4中。它們在KBr中的紅外光譜(圖1、2和3)表明在1630和1540cm-1附近有很強的酰胺帶，在3300cm處有OH和/或NH吸收帶。BU-2867 TA的1H-核磁共振譜(圖4)揭示出有六個烯屬質(zhì)子的存在(δ6.16、6.20(2H)、6.28、6.49和7.09ppm)和四個酰胺質(zhì)子的存在(δ7.49、7.82、7.87和8.72ppm)。圖譜中還可觀察到二個甲基基團(δ0.93ppm，t和1.07ppm，d)。BU-2867 TA的13C-核磁共振譜(圖5)顯示出23個以上的碳原子信號，包括四個羰基碳、六個烯屬碳和三個甲基碳。BU-2867 TB和C的13C-核磁共振譜與BU-2867 TA的非常相似，只是BU-2867 TB中比BU-2867 TA中多兩個烯屬碳原子，BU-2867 TC中比BU-2867 TA中多兩個亞甲基碳原子。
用6NHCl對BU-2867 TA進行回流加熱16小時。通過乙酸乙酯萃取去掉親脂性產(chǎn)物(V)后，將水解物濃縮成油狀殘渣并在Dowex50W×4離子交換樹脂上進行層析，用吡啶-甲酸-乙酸緩沖液(0.1～0.2M，pH3.1～5.1)展層。通過茚三酮試劑監(jiān)測，分離依次洗脫的四種氨基酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ并以鹽酸化物的形式結(jié)晶。氨基酸Ⅰ(在5NHCl中，〔α〕25D-12.7°)通過其物理化學(xué)性質(zhì)鑒定為L-蘇氨酸。氨基酸Ⅱ的1H-核磁共振譜和電子撞擊質(zhì)譜(EI-MS)(M++1m/z 134)表明它是4-氨基-3-羥基-正戊酸的非對映異構(gòu)體的混合物，參見Konishi，M.;K.Saito，K.Numata，T.Tsuno，K.Asama，H.Tsukiura，T.Naito和H.KawaguchiTollysomycin，一種與bleomycin相關(guān)的新的抗生素復(fù)合物Ⅱ.tallysomycin A和B的結(jié)構(gòu)確定J.Antibiotics30∶789～805，1977，通過與真實樣品直接比較證實了對它的鑒定。通過元素分析和電子撞擊質(zhì)譜分析(M+m/z 115)，氨基酸Ⅲ的分子式確定為C5H9NO2。它的H1-核磁共振譜顯示它含有一個甲基(δ1.50ppm，d，J6.0Hz)、一個次甲基(δ4.0～4.2，m)和兩個反式烯屬質(zhì)子(δ6.05ppm，d，J15.0Hz和6.57ppm，d-d，J6.0和15.0Hz)。這些圖譜數(shù)據(jù)清楚表明Ⅲ是4-氨基-2(E)戊烯酸，參見Honore′，T.;H.Hjeds，P.Krogsgaard-Larsen和T.R.Christiansenγ-氨基丁酸(GABA)類似物的合成與結(jié)構(gòu)活性研究Eur.J.Med.Chem.，13429～434，1978。根據(jù)Ⅲ的比旋光度(在5NHCl中，〔α〕22.5D-6°)，它被確定為是2(S)-構(gòu)型。氨基酸Ⅳ根據(jù)其元素分析(C6H14N2O3)、電子撞擊質(zhì)譜(M+1m/z 163)、1H-核磁共振譜(δ1.8～2.1ppm 4H，m，3.18ppm，2H，t和3.6～4.3ppm，2H，m)和用6NHC處理后γ-內(nèi)酯化合物的形成(Vc＝01770cm-1)等確定為4羥基賴氨酸。Izumiya，N.;Y.Fujita，F(xiàn).Irreverre和B.Witkop疊-γ-羥基-L-賴氨酸的合成及其在膠原蛋白中的缺乏Biochemistry42501～2506，1965中報道了4-羥基-賴氨酸的變旋作用及在Ⅳ中觀察到的漂移表明了疊-4-構(gòu)型。因此，氨基酸Ⅳ的結(jié)構(gòu)被確定為疊-4-羥基-L-賴氨酸。
上述酸水解中得到的親脂的酸性部分(Ⅴ)用重氮甲烷處理，經(jīng)過層析純化后產(chǎn)生油狀的甲基酯(Ⅵ)。Ⅵ的紫外光譜(λMe OHmax260nm，ε22，000)、電子撞擊質(zhì)譜(M+m/z 210)和1H-核磁共振譜(四個-CH＝、一個C-CH3和六個-CH2-)表明它是甲基-2，4-十二碳二烯酸酯。偶合常數(shù)的幅度清楚地表明兩個雙鍵都是反式構(gòu)型。因此原來的酸Ⅴ是2(E)，4(E)-十二碳二烯酸，參見Burden，R.S.和L.Crom-bie.蔬菜來源的酰胺第Ⅶ部分來自Anacyclus pyrethrum D.C.(菊科Comopsitac)的烷烴-2，4-二烯酸酪胺-酰胺 J.Chem.Soc.(C)，19692477～2481，1969。
ⅠL-蘇氨酸
Ⅱ4-氨基-3-羥基-正戊酸
Ⅲ4(S)-氨基-2(E)-戊烯酸
Ⅳ疊-4-羥基-L-賴氨酸
Ⅴ2(E)，4(E)-十二碳二烯酸CH3-(CH2)6-CH＝CH-CH＝CH-COOHBU-2867 TA的分子式為C27H44N4O6，并在13C-核磁共振譜中顯示出具有六個烯屬碳原子和四個酰胺碳原子。因此很明顯，氨基酸Ⅱ是在酸解過程中通過天然氨基酸Ⅲ的水合反應(yīng)產(chǎn)生的后生物。由于抗生素對茚三酮反應(yīng)為陰性，并且在電勢滴定中不表現(xiàn)滴定功能，因此，它可能是一種環(huán)肽。BU-2867 TA在吡啶中進行乙?；蠼o出雙一氧一乙酰基衍生物(電子撞擊質(zhì)譜M+＝m/z604，1H-核磁共振譜2.02ppm，3H和2.08ppm，3H)的事實進一步支撐此推論。乙酸酯的質(zhì)譜也在m/z 179和322處表現(xiàn)出較強的離子碎片，這提示在抗生素中含有Ⅴ→Ⅰ→的序列。
使BU-2867 TA在0.01M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中經(jīng)受無花果蛋白酶的酶解作用。酸化至pH2.2后，用正丁醇萃取反應(yīng)混合物可得到一種酸性化合物(Ⅶ)。在pH10.0時用正丁醇接著萃取水相給出一種茚三酮陽性物質(zhì)(Ⅷ)。化合物Ⅶ通過紅外光譜(Vc＝01720和1650cm-1)、電子撞擊質(zhì)譜(M+-H2Om/z 297和M+-Thrm/z 179)與1H-核磁共振譜表明是2，4-十二碳二烯基-蘇氨酸(Ⅴ→Ⅰ)。Ⅶ在6NHCl中水解后產(chǎn)生Ⅰ和Ⅴ的事實進一步確定了此結(jié)構(gòu)。使化合物Ⅷ在6NHCl中回流后，薄層層析表明它產(chǎn)生氨基酸Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。在Ⅷ的電子撞擊質(zhì)譜中，在m/z 241處發(fā)現(xiàn)的分子離子表示有環(huán)肽結(jié)構(gòu)的存在。1H-核磁共振譜(270 MHz，在DMSO-d6中)在7.43ppm(三連峰)和9.10ppm(寬峰)處顯示出兩個酰胺NH質(zhì)子，這與上述環(huán)式結(jié)構(gòu)是一致的。完全解偶合的實驗揭示，Ⅲ的氨基和Ⅳ的ε-氨基與羰基相連形成酰胺，而Ⅳ的α-氨基是游離的。因此，Ⅶ和Ⅷ的結(jié)構(gòu)確定為如下所示
用木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶使BU-2867 TA進行酶解或水解后也可得到化合物Ⅶ和Ⅷ。使BU-2867 TA(4克)和木瓜蛋白酶(Sigma P-3375，50克)的混合物在20升10%的含水甲醇中于28℃下攪拌22小時。然后，用乙酸將混合物酸化至pH3.3并用乙酸乙酯(10升)萃取。蒸發(fā)萃取液給出一油狀物(6.3克)，用CH2Cl2和甲醇的混合物(9∶1)使其在硅膠(Wakogel C-200，250毫升)上層析產(chǎn)生半純化的油狀化合物Ⅶ(3.3克)。用葡聚糖凝膠LH-20進一步層析油狀物，然后進行結(jié)晶，給出純化Ⅶ的無色針狀結(jié)晶。1.15克(產(chǎn)率50%)。熔點90～91℃?！拨痢?7D+17.4°(C0.5，Me OH)，分析計算得到C16H27NO4·H2OC60.93、H9.27、N4.44。發(fā)現(xiàn)C61.34、H9.03、N4.20。電子撞擊質(zhì)譜m/z 279(M+-H2O)。紫外線光譜λMe OHmaxnm(ε)260(28，000)。紅外光譜Vmax(KBr)cm-13520、3410、3300、1720、1690、1655、1630等。1H-核磁共振譜(80MHz，DMSO-d6)δ0.88(3H，t)、1.06(3H，d)、6.20(3H，m)、7.00(1H，m)、7.84(1H，d，NH)等。
用乙酸乙酯萃取后，使酸性水相溶液濃縮至干燥。將殘渣(36克)溶于50毫升水中，調(diào)整pH9.0并上反相二氧化硅柱(C18，Merck，1.6升)，用水展層。合并含有化合物Ⅷ的洗脫部分進行真空濃縮。殘渣用50%含水甲醇在葡聚糖凝膠LH-20(250毫升)柱上層析，然后用酸性水(pH3.0的稀釋HCl)在反相二氧化硅(C18)柱上層析，這樣可產(chǎn)生純化Ⅷ的鹽酸化物。747毫克(產(chǎn)率35%)。熔點190℃(dec.)?！拨痢?6D-113°(C0.5，H2O)。電子撞擊質(zhì)譜m/z 241(M+)。紫外光譜末端吸收。紅外光譜Vmax(KBr)cm-13400、1660、1620、1530等。1H-核磁共振譜(80MHz，DMSO-d6)δ1.27(3H，d)、1.4～1.8(4H)、2.98(2H，m)、4.52(1H，m)、6.19(1H，d)、6.45(1H，d-d)、7.43(1H，t，NH)、9.46(1H，d，NH)。分析計算得到C11H9N3O3·HCl·H2OC44.67、H7.50、N14.21、Cl 11.99。發(fā)現(xiàn)C45.04、H7.82、N13.81、Cl 12.55。
由于BU-2867 TA對茚三酮陰性并且沒有表現(xiàn)出任何滴定的基團，則可合理地推斷其結(jié)構(gòu)是由Ⅶ和Ⅷ通過肽鍵連接而構(gòu)成的。
用6NHCl加熱時，BU-2867 TB和C二者都產(chǎn)生與從BU-2867 TA中所得相同的氨基酸復(fù)合物。從水解物中萃取出兩種抗生素的脂肪酸部分，用重氮甲烷處理并以甲酯Ⅸ(從BU-2867 TB中)和Ⅹ(從BU-2867 TC中)的形式分離出來。它們保留有在其母體抗生素中觀察到的特性外吸收峰(λMe OHmax260nm)。Ⅸ的電子撞擊質(zhì)譜在m/z 236處產(chǎn)生一個分子離子，提示有一個具有三個雙鍵的C14-酸性酯。紫外光譜和1H-核磁共振譜清楚地表明分離的Ⅸ中有2(E)，4(E)-二烯酸結(jié)構(gòu)和三個雙鍵。Ⅸ的臭氧分解后跟著進行臭氧化物的還原分解產(chǎn)生正己醛，將其分離后被鑒定是2，4-二硝基苯-腙(電子撞擊質(zhì)譜M+m/z 280)。這些證據(jù)確定Ⅸ是甲基2(E)，4(E)，8-十四碳三烯酸酯。發(fā)現(xiàn)酯Ⅹ的分子量(電子撞擊質(zhì)譜M+，m/z 238)比Ⅵ的分子量高28個(C2H4)單位，這反映了在BU-2867 TA和C之間觀察到的分子式差別。這一點與1H-核磁共振譜和紫外光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，則揭示出Ⅹ是甲基2(E)，4(E)-十四碳二烯酸酯。上述實驗結(jié)果表明BU-2867 TA、B和C的結(jié)構(gòu)如下示
BU-2867 TA R＝CH3-(CH2)6-BU-2867 TB R＝CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2-BU-2867 TC R＝CH3-(CH2)8-
用假單孢菌(Pseudomonas)酰基轉(zhuǎn)移酶對BU-2867 T進行酶解，得到與上述用無花果蛋白酶或木瓜蛋白酶水解所得到的不同的產(chǎn)物。使假單孢菌Pa-129菌株在10升含有2%可溶淀粉、0.2%葡萄糖、3%大豆粉、1%CaCO3和0.3%MgSO4·7H2O的培養(yǎng)基中于37℃下發(fā)酵3天，通過離心收集細(xì)胞。用鹽水(1升)洗滌兩次后，將細(xì)胞再懸浮于0.75升的鹽水中。將細(xì)胞懸浮液與預(yù)先用高壓滅菌過的藻酸鈉(75克)和羧甲基纖維素(75克)的懸浮液(1.5升)混合，混合物在攪拌下倒入30升0.1MCaCl2溶液中。包埋在細(xì)胞中的凝膠通過與25%的戊二醛溶液攪拌而硬化，然后裝柱(4.0×175厘米)。使BU-2867 TA(1.5克)的20%含水甲醇(30升)的溶液以0.4～0.8升/小時的流速過柱。然后，將合并的流出液連續(xù)過Amberlite IRC-50(70%NH+4形式，pH6.7，300毫升)和HP-20(300毫升)的柱。用水洗IRC-50的柱，然后用1.5NNH4OH展層。合并茚三酮陽性部分，濃縮和冷凍干燥后產(chǎn)生淡黃色固體(800毫克)，將此固體上反相二氧化硅(C18，250毫升)柱。在中壓下用水使柱展層，合并并濃縮茚三酮陽性洗脫物產(chǎn)生L-蘇氨酰環(huán)胺的白色固體(Ⅺ，612毫克)。產(chǎn)率62%。熔點170℃，〔α〕27D-157℃(C0.5，H2O)。電子撞擊質(zhì)譜m/z 342(M+)。紫外光譜末端吸收。紅外光譜Vmax(KBr)cm-13350、3280、1650、1620、1530等。1H-核磁共振譜(80MHz，DMSO-d6)δ1.05(3H，d)、1.21(3H，d)、1.4～2.2(4H)、4.35(2H，m)、4.47(1H，m，OH)、4.62(1H，d，OH)、6.16(1H，d)、6.42(1H，d-d)、7.36(1H，t，NH)、7.97(1H，d，NH)、8.62(1H，d，NH)。
上述得到的HP-20柱先用水(1升)、然后再用0.1N NaOH和甲醇的混合物(1∶2)展層。合并含有2，4-十二碳二烯酸(Ⅴ)的部分，濃縮至300毫升后酸化至pH2.0。此溶液用乙酸乙酯(300毫升)和正丁醇(100毫升)萃取。蒸發(fā)乙酸乙酯萃取液產(chǎn)生一油狀殘渣，將此殘渣在葡聚糖凝膠LH-20柱(800毫升)上層析。用甲醇洗脫時，測定260nm處的紫外吸收以監(jiān)測洗脫物，使需要部分濃縮產(chǎn)生純化Ⅴ的無色塊狀物(259毫克)。產(chǎn)率53%。熔點48～49℃。紫外光譜λMe OHmaxnm(ε)258(24，000)紅外光譜Vmax(KBr)cm-11680、1630、1605、1410、1300等。1H-核磁共振譜(80MHz，CD3OD)δ0.89(3H，t)、2.0(10H)、2.12(2H，m)、5.75(1H，d)、6.16(2H，m)、7.21(1H，m)。此化合物與從BU-2867 TA的酸解得到的2，4-十二碳二烯酸一致。使正丁醇萃取液進行真空濃縮和冷凍干燥，以回收起始物質(zhì)BU-2867 TA(160毫克，11%)。
從上述討論可以清楚地看出，對于本發(fā)明各種抗生素化合物的制備來說，化合物Ⅷ和Ⅺ是很有價值的中間產(chǎn)物。例如，用一種羧酸和一種烷基酸式碳酸酯(HOCOOR)的混合酸酐進行常規(guī)乙?；尚纬杀匦璧碾逆I，參見《Advanced Organic Chemistry》，F(xiàn)ieser和Fieser，1039～1046頁，Reinbold出版公司，紐約，1965?？捎萌魏魏线m的方法保護羥基，例如，以四氫吡喃基或叔丁基酯類的形式。Ⅷ的胺基與下列羧酸進行乙?；?。
分別產(chǎn)生BU-2867 TA、B和C。例如，通過偶聯(lián)Ⅶ和Ⅷ制備BU-2867TA。使Ⅶ(15毫克)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(10毫克)和1-羥基-1，2，3-苯并三唑基(8毫克)的混合物在2毫升二甲基甲酰胺中于室溫下攪拌兩小時。然后，向混合物中加入化合物Ⅷ(10毫克)，繼續(xù)攪拌過夜。將溶液濃縮成殘渣后上反相二氧化硅(C18，40毫升)柱層析，用80%甲醇洗脫。蒸發(fā)活性洗脫物，殘渣通過制備高效液相層析(柱SSD-ODS-842，移動相90%含水甲醇)純化。蒸發(fā)活性峰部分產(chǎn)生BU-2867 TA(7.4毫克，產(chǎn)率28%)，它在所有方面都與天然抗生素一致。薄層層析(硅化的，Et OH-H2O＝55∶45)Rf值0.45。高效液相層析(Lichrosorb RP-18，Et OH-H2O＝65∶35)保留時間6.43分鐘。
BU-2867 TA也能通過偶聯(lián)Ⅴ和Ⅺ來制備。使Ⅴ(3.4毫克)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(3.7毫克)和1-羥基-1，2，3-苯并三唑(2.8毫克)的二甲基甲酰胺溶液(1毫升)在室溫下攪拌2小時。向溶液中加入Ⅺ(5毫克)，使混合物繼續(xù)保持在攪拌下3小時，然后進行真空濃縮。將殘渣溶于甲醇中，然后通過制備高效液相層析純化，使用的柱和移動相與上述相同。BU-2867 TA4毫克，產(chǎn)率45%。通過直接比較確定了它與天然BU-2867 TA的一致性。
利用常規(guī)方法可從化合物Ⅷ制備化合物Ⅺ。向攪動著的N-t-丁氧基羰基-L-蘇氨酸(44毫克)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(40毫克)和1-羥基-1，2，3-苯并三唑(30毫克)的二甲基甲酰胺混合溶液(4毫升)中于室溫下加入Ⅷ(40毫克)。混合物在真空中濃縮至殘渣，將殘渣上反相二氧化硅(C18，40毫升)柱進行層析，用甲醇和水的混合物(比例1∶9至2∶3)洗脫。合并需要部分，進行真空濃縮和冷凍干燥后產(chǎn)生N-丁氧基羰基-L-蘇氨酰-Ⅷ(二丁氧基羰基-Ⅺ)。51毫克，產(chǎn)率69%。VKBrc＝01690和1640cm-1。1H-核磁共振譜(80MHz，在DMSO-d6中)δppm1.00(3H，d)、1.22(3H，d)、1.35(9H，S)、6.11(1H，d)、6.33(1H，d-d)等。將丁氧基羰基-Ⅺ(36毫克)和甲酸(1毫升)的混合物于室溫下攪拌1小時。將其濃縮，用水(1毫升)稀釋，調(diào)整pH到10.0后上反相二氧化硅(C18，20毫升)柱。用水展層時，以茚三酮測試法監(jiān)測洗脫物，合并需要的洗脫物進行冰凍干燥，產(chǎn)生白色固體Ⅺ。25毫克，產(chǎn)率88%。VKBrc＝01650cm-1。在DMSO-d6中的1H-核磁共振譜δppm1.04(3H，d)、1.22(3H，d)、6.14(1H，d)、6.42(1H，d-d)、7.35(1H，t，NH)、7.98(1H，d，NH)、8.65(1H，d，NH)等。電子撞擊質(zhì)譜M+m/z 342。
因此，有可能使化合物Ⅷ和Ⅺ與合適的羧酸反應(yīng)而制備本發(fā)明的抗生素化合物，不管它們的來源如何。而且，利用化合物Ⅷ和Ⅺ，即根據(jù)本發(fā)明的、尤其是那些通過較高產(chǎn)率產(chǎn)生的化合物，可用來制備本發(fā)明的其它化合物。例如，通過發(fā)酵以較高的產(chǎn)率得到的BU-2867 TA，可用來通過酶促水解作用和與合適羧酸的偶聯(lián)如上述制備BU-2867 TB和BU-2867TC。
如上述通過發(fā)酵得到的BU-2867 T的產(chǎn)率及A、B和C的分布，可通過向正在培養(yǎng)Polyangium brachysporum K481-B101的培養(yǎng)基中加入各種油脂和某種表面活性劑加以改變。例如，加入大豆油、玉米油、橄欖油、氫化植物油、豬脂和牛脂可提高所獲BU-2867 T的總產(chǎn)率，牛脂的提高程度稍小一些。亞油酸(C18∶2)含量較高的油脂，如大豆油、玉米油和豬脂，提高BU-2867 TB的生成比例。油酸(C18∶1)含量較高的油如橄欖油，提高BU-2867 TC的生成比例。氫化植物油富含硬脂酸(C18∶0)，它僅提高BU-2867 TA的生成量。
抗微生物活性通過一系列瓊脂稀釋的方法，確定了BU-2867 TA、B和C對于各種微生物的最小抑菌濃度(MICs)。細(xì)菌使用營養(yǎng)瓊脂(Eiken)，真菌使用Sabouraud葡萄糖瓊脂(Difco)。細(xì)菌接種物的濃度調(diào)整至104CFU/毫升，真菌的則調(diào)整至105～107CFU/毫升。
表5給出了BU-2867 TA、B和C的離體抗菌活性。組分A和C在50微克/毫升時不抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的生長，而組分B對于某些革蘭氏陽性細(xì)菌顯示出適中的抑制活性。
BU-2867 T各組分的抗真菌活性示于表6中。組分C對于具有臨床重要性的病原真菌表現(xiàn)出很強的抗真菌活性，如白色念珠菌、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、須發(fā)癬菌(Trichophyton mentagrophytes)和刺囊毛霉(Mucor spin-osus)。組分A和B比組分C的活性稍低，但它們的抗真菌譜與組分C的相似。
表5.BU-2867 T各組分的抗菌譜MIC(微克/毫升)BU-2867 TA BU-2867 TB BU-2867 C革蘭氏陽性生物
209P ＞50 25 ＞50金黃色釀膿葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)″ ″ Smith ＞50 3.1 ＞50″ ″ Bx-1633 ＞50 50 ＞50表皮葡萄球菌 D153 ＞50 6.3 ＞50(Staphylococcus epidermidis)″ ″ A22152 ＞50 50 ＞50糞鏈球菌 A9612 ＞50 ＞50 ＞50(Staphylococcus faecalis)藤黃細(xì)球菌 PCI-1001 ＞50 50 ＞50枯草桿菌 PCI-219 ＞50 50 ＞50(Bacillus subtilis)革蘭氏陰性生物大腸埃希氏桿菌 HIHJ ＞50 ＞50 ＞50(Escherichia coli)肺炎桿菌 D-11 ＞50 ＞50 ＞50(Klebsiella pneumoniae)奇異變形桿菌 A9554 ＞50 ＞50 ＞50(Proteus mirabilis)普通變形桿菌 A94336 ＞50 ＞50 ＞50(Proteus vulgaris)Morganella morganii A9553 ＞50 ＞50 ＞50
粘質(zhì)沙雷氏菌 A20222 ＞50 ＞50 ＞50(Serratia marcescens)Enterobacter cloacae A9659 ＞50 ＞50 ＞50綠膿假單孢菌 A9930 ＞50 ＞50 ＞50(Pseudomonas aeruginosa)培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂表6.BU-2867 T各組分的抗真菌譜MIC(微克/毫升)測試生物 BU-2867 A BU-2867
BU-2867白色念珠菌 IAM4888 3.1 3.1 1.6白色念珠菌 A9540 1.6 1.6 0.8新型隱球菌 D49 25 25 3.1新型隱球菌 IAM4514 25 25 3.1煙曲霉 IAM2530 1.6 3.1 0.8煙曲霉 IAM2034 1.6 3.1 0.8黃曲霉 FA21436 25 25 50(Aspergillus flavus)串珠鐮孢 A2284 ＞50 ＞50 ＞50(Fusarium mopiligorme)稻梨孢 D91 ＞50 ＞50 ＞50(Piricularia oryzae)須發(fā)癬菌 D155 25 12.5 1.6須發(fā)癬菌 ＃4329 25 12.5 6.3皮炎牙生菌 IFO8144 50 50 ＞50(Blastomyces dermaditis)申克氏孢子絲菌 IFO8158 ＞50 ＞50 ＞50(Sporothrix schenckii)Petriellidium boydii IFO8073 ＞50 ＞50 50刺囊毛霉 IFO5317 1.6 0.8 0.2培養(yǎng)基Sabouraud葡萄糖瓊脂抗腫瘤活性利用雌性CDF1和雄性BDF1小屬確定了BU-2867 TA、B和C的抗腫瘤活性。通過分別給每只小鼠腹膜內(nèi)注射0.8毫升含有106和105個細(xì)胞的稀釋腹水，給小鼠接種淋巴細(xì)胞性白血病P388(CDF1和BDF1小鼠)和淋巴性白血病L1210(BDF小鼠)。在腹膜內(nèi)植入0.5毫升10%的黑素瘤B16腫瘤漿液(BDF小鼠)。測試物質(zhì)溶于含有10%二甲基亞砜的0.9%的鹽水中，在植入腫瘤24小時后給小鼠腹膜內(nèi)施用劑量依次變化的測試物質(zhì)。在實驗中用橄欖霉素(NSC38270)或絲裂霉素C作為參照化合物進行比較測試。
進行第一方案處理(在第1、4和7天每天一次)時，BU2867TA和C對P388白血病都表現(xiàn)出抗腫瘤活性。表7給出了所得到的結(jié)果，以百分比值的形式表示了試驗(T)和對照(C)動物對于各種攝取劑量的存活期中值(MST)的上升。125或更高的百分比值表明具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。
表7.BU-2867 T各組分對于P388白血病的抗腫瘤活性MST的T/C%劑量為毫克/公斤/天，腹膜內(nèi)施用3 1 0.3 0.1BU-2867 TA 140 130 120BU-2867 TB 165 140 120BU-2867 TC 155 130橄欖霉素 A 140 135 100進行第二方案處理(從第一至第九天每天一次)時，BU-2867 TA和C對于抗P388白血病具有很高的活性;BU-2867 TA對于抗L1210白血病和B16黑素瘤活性較低。表8給出了所得到的結(jié)果，也是以百分比值的形式表示了對于各種攝取劑量的存活期中值的上升，125或更高的數(shù)值表示具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。
表8.BU-2867 TA和C的抗腫瘤活性MST的T/C%劑量為毫克/公斤/天，腹膜內(nèi)施用2 1 0.5 0.25 0.13 0.063 0.031P388白血病BU-2867 TA 67 228 186 156 147 136 109BU-2867 TC 234 189 175 159 153 123 100絲裂霉素 C 290 240 170 150 130 115L1210白血病BU-2867 TA 129 118 118 106絲裂霉素 C 140 141 129 129 106B16黑素瘤BU-2867 TA 毒性 125 116 113 100絲裂霉素 C 63 181 163 141 131通過對雄性ddY小鼠腹膜內(nèi)一次性注射BU-2867 TA和C，測定了它們的急性毒性。LD50的數(shù)值分別為8.1毫克/公斤和25毫克/公斤。
本發(fā)明具有藥理效應(yīng)的化合物可通過常規(guī)的草本藥劑學(xué)方法加工成藥物制劑，以用于口服或非腸道施用，例如用于包括人類在內(nèi)的哺乳動物。常規(guī)賦形劑包括作為藥物接受的有機或無機載體物質(zhì)，它們適于非腸道的、腸道的或局部的應(yīng)用，而且不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)?？勺鳛樗幬锝邮艿暮线m的載體包括(但不限于此)水、鹽溶液、醇類、阿拉伯樹膠、植物油類、聚乙烯二醇、白明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、凡士林、芳香油、脂肪酸單酸甘油酯和二酸甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。可以對藥物制劑進行滅菌，而且，如果需要，可與下列佐劑混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖劑、著色、調(diào)味和/或芳香物質(zhì)及其類似物，它們不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)。
對于非腸道應(yīng)用來說，特別適用的是可注射的滅菌溶液，最好是油狀液或水溶液，也可是懸浮液、乳化液，或植入物，包括栓劑。安瓿瓶是合適的單位劑量。
對于腸道應(yīng)用來說，特別適用的是藥片、糖衣藥丸、栓劑或具有滑石和/或碳水化合物載體或粘合劑或其類似物的膠囊，載體最好是乳糖和/或玉米淀粉和/或土豆淀粉。在制備糖化藥用混合物時可使用糖漿、劑或其類似物?？梢耘渲瞥掷m(xù)釋放的組合物，包括那些其中的活性化合物用降解度不同的包膜如微型膠囊、多層包膜等保護的組合物。
一般地說，本發(fā)明的化合物以單位劑量的形式配制于包含必需劑量的可作為藥物接受的載體中。用藥于例如重75公斤的病人時，根據(jù)本發(fā)明的化合物的劑量一般為5～250毫克/天。對于一給定的受體來說，可以利用常規(guī)方法確定合適的劑量和攝取方式，例如，通過有關(guān)化合物和已知抗生素或抗腫瘤藥物的不同活性的慣常比較，例如，借助于合適的、常規(guī)藥理學(xué)規(guī)范的手段。
從前面的描述中，一個本領(lǐng)域的普通專業(yè)人員可以很輕易地確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且，不偏離這些本質(zhì)特征的要領(lǐng)和范圍，他就能對本發(fā)明作出各種變化和修飾，使其適應(yīng)于各種應(yīng)用和條件。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式為
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)8。
5.一種制備結(jié)構(gòu)式為
的化合物的方法，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，該方法包括在好氧條件下，在含有可同化碳源和氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Ployangium brachysporum sp.nov.，分離生成的菌絲體和從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中Polyangium brachysporum sp.v.是K481-B101菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中K481-B101菌株進一步以ATCC53080號菌株為特征。
8.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入一種脂或油。
9.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中在回收化合物之前用一種有機溶劑萃取分離的菌絲體，然后將萃取液與營養(yǎng)培養(yǎng)基合并。
10.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中通過用一種有機溶劑萃取營養(yǎng)培養(yǎng)基而從中回收化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中利用白色念珠菌(Candida albicans)作為測試生物監(jiān)測化合物的生產(chǎn)。
12.微生物Polyangium brachysporum sp.nov.。
13.Polyangium brachysporum K481-B101菌株。
14.微生物Polyangium brachysporum sp.nov.的生物純的培養(yǎng)物。
15.結(jié)構(gòu)式為
的化合物。
16.一種制備結(jié)構(gòu)式為
的化合物的方法，其中該方法包括在無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶的存在下水解結(jié)構(gòu)式為
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2、或CH3-(CH2)8。
17.結(jié)構(gòu)式為
的化合物。
18.一種制備結(jié)構(gòu)式為
的化合物的方法，其中該方法包括在假單孢菌(Pseudomonas)酰基轉(zhuǎn)移酶的存在下水解結(jié)構(gòu)式為
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8。
19.一種抗真菌組合物，它至少包含一種所含劑量對于抗真菌來說是有效的結(jié)構(gòu)式為
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，還含有一種可作為藥物的載體。
20.一種抗腫瘤組合物，它至少包含一種一定數(shù)量的結(jié)構(gòu)式為
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，該化合物作為有效的抗腫瘤藥劑包含在一種可作為藥物的載體中。
專利摘要
通過培養(yǎng)新微生物Dolyangium brachyspor-um，制備了具有抗生素和抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)式為
文檔編號C07K5/00GK86105469SQ86105469
公開日1987年6月10日 申請日期1986年8月29日
發(fā)明者小西正隆, 富田康二, 岡正久, 沼田蕙一 申請人:布里斯托爾-米爾斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan