一種硫酸多粘菌素e組分純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及硫酸多粘菌素E組分純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多粘菌素E是一個(gè)由多種組份組成的多肽類抗生素，主要由E2和El組成。在20世紀(jì)50年代，多粘菌素E就應(yīng)用于臨床，主要用于革蘭氏陰性菌引起的感染，特別是由多重耐藥綠膿桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌等引起感染的治療。
[0003]自上世紀(jì)80年代開始因高發(fā)的腎臟毒性和神經(jīng)毒性，多粘菌素E的應(yīng)用受到限制，并幾乎被臨床棄用。但是近年來，由于革蘭氏陰性菌耐藥株尤其是多耐藥菌株感染病例的出現(xiàn)以及新藥開發(fā)有限的情況下多粘菌素E再次引起了全球醫(yī)療界的重視。同樣如何提高多粘菌素E的抗菌活性、降低其毒性從而擴(kuò)大臨床適用人群也成為了藥學(xué)研究者所面臨的技術(shù)難點(diǎn)。
[0004]眾所周知多組份藥物制劑的穩(wěn)定性較難控制，特別是對于注射劑而言多組分藥物的理化穩(wěn)定性、滲透壓、澄明度、酸堿度等方面因易受組分間相互作用，不容易形成穩(wěn)定的藥物制劑，并且由于儲(chǔ)存、溫度、光照等因素多組份藥物制劑更容易出現(xiàn)變色、沉淀、分解等變化。此外，多組分藥物的有效性和潛在的安全性也存在一定的缺陷。另外，多組份藥物由于組份間的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異會(huì)導(dǎo)致它們在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為的差異，增加了藥代動(dòng)力學(xué)研究的難度，從而對設(shè)計(jì)安全的藥物劑量以及合理的給藥方式帶來技術(shù)障礙。因此，發(fā)明一種純化多粘菌素E的方法，獲得El和E2組分純化物是非常必要的。
[0005]凝膠技術(shù)是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。凝膠介質(zhì)是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流下時(shí)路程較長，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，下來的路程短，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，旨在根據(jù)多粘菌素E2和El分子量的不同，利用凝膠技術(shù)得到硫酸多粘菌素E2組分和El組分純化物，純化含量大于等于80%，甚至可以大于等于90%。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0008](a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣于凝膠介質(zhì)；
[0009](b)待步驟(a)完成后用有機(jī)溶劑洗脫，分段收集、合并含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液；
[0010](c)取步驟(b)中合并后的洗脫液，去除有機(jī)溶劑后用硫酸調(diào)節(jié)pH值；
[0011](d)待步驟(C)完成后噴霧干燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。
[0012]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述凝膠介質(zhì)采用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。
[0013]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述凝膠介質(zhì)的載樣量為30g/L-60g/L。
[00Μ]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述凝膠介質(zhì)的載樣量為優(yōu)選為30g/L_40g/L。
[0015]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述有機(jī)溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。
[0016]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述有機(jī)溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。
[0017]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成后用配置好的有機(jī)溶劑，以0.8?1.2BV/h的流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉淀時(shí)開始收集，每I小時(shí)的出樣收集為一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉淀;每組出樣小組均進(jìn)行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大于85 %的出樣小組進(jìn)行合并。
[0018]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述步驟(C)具體步驟為:取步驟(b)中合并后的洗脫液，采用真空薄膜蒸發(fā)法去除有機(jī)溶劑，其溫度為40-60 V ；然后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3.4-4.4。
[0019]進(jìn)一步的技術(shù)方案還在于，步驟(d)中噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度130-190°C，出風(fēng)溫度90-1lOcC0
[0020]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于:本發(fā)明中利用凝膠進(jìn)行操作，由于其屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和El組分不造成任何破壞，所以最大程度的保護(hù)了多粘菌素E2和El組分，其純化物含量可達(dá)90%。
【附圖說明】
[0021]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0022]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中的硫酸多粘菌素E2分析結(jié)果；
[0023]圖2是本發(fā)明實(shí)施例中的硫酸多粘菌素El分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025]在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0026]本發(fā)明包括以下步驟:
[0027](a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣于凝膠介質(zhì)；
[0028](b)待步驟(a)完成后用有機(jī)溶劑洗脫，分段收集、合并含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液；
[0029](c)取步驟(b)中合并后的洗脫液，去除有機(jī)溶劑后用硫酸調(diào)節(jié)pH值；
[0030](d)待步驟(C)完成后噴霧干燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。
[0031]優(yōu)選的，所述凝膠介質(zhì)采用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。
[0032]優(yōu)選的，所述凝膠介質(zhì)的載樣量為30g/L-60g/L。
[0033]優(yōu)選的，所述凝膠介質(zhì)的載樣量為優(yōu)選為30g/L-40g/L。
[0034]優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。
[0035]優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。
[0036]優(yōu)選的，所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成后用配置好的有機(jī)溶劑，以
0.8?1.2BV/h的流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉淀時(shí)開始收集，每I小時(shí)的出樣收集為一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉淀;每組出樣小組均進(jìn)行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大于85%的出樣小組進(jìn)行合并。
[0037]優(yōu)選的，所述步驟(c)具體步驟為:取步驟(b)中合并后的洗脫液，采用真空薄膜蒸發(fā)法去除有機(jī)溶劑，其溫度為40-60°C ;然后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3.4-4.4。
[0038]優(yōu)選的，步驟(d)中噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度130_190°C，出風(fēng)溫度90_110°C。
[0039]實(shí)施例1.
[0040](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照30g/L的載樣量上樣于G-1O凝膠介質(zhì)；
[0041 ] (b)用35 %甲醇溶液對其進(jìn)行洗脫，流速0.8BV/h，當(dāng)用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉淀時(shí)開始收集，定時(shí)每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關(guān)于多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進(jìn)行合并；
[0042](c)將上步驟中合并的洗脫液用真空薄膜蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，溫度50°C，再用硫酸調(diào)節(jié)pH值4.0;
[0043 ] (d)噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度190 °C，出風(fēng)溫度110 °C。結(jié)果得到15g硫酸多粘菌素E2和Sg硫酸多粘菌素El，它們的HPLC分析圖見圖1和圖2，含量均在90%以上。
[0044]實(shí)施例2.
[0045](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照60g/L的載樣量上樣于G-25凝膠介質(zhì)；
[0046](b)用20 %氯仿溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時(shí)每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關(guān)于多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進(jìn)行合并；
[0047](c)將上步驟中合并的洗脫液用真空薄膜蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，溫度40°C，再用硫酸調(diào)節(jié)PH值4.2;
[0048](d)噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度130°C，出風(fēng)溫度90°C。結(jié)果得到12g硫酸多粘菌素E2和5g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0049]實(shí)施例3.
[0050](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照40g/L的載樣量上樣于G-15凝膠介質(zhì)；
[0051 ] (b)用45 %乙腈溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時(shí)每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關(guān)于多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進(jìn)行合并；
[0052](c)將上步驟中合并的洗脫液用真空薄膜蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，溫度60°C，再用硫酸調(diào)節(jié)pH值3.8;
[0053](d)噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度180°C，出風(fēng)溫度90°C。結(jié)果得到18g硫酸多粘菌素E2和1g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0054]實(shí)施例4.
[0055](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照35g/L的載樣量上樣于G-1O和G-25混合凝膠介質(zhì)；
[0056](b)用35 %甲醇溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時(shí)每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關(guān)于多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進(jìn)行合并；
[0057](c)將上步驟中合并的洗脫液用真空薄膜蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，溫度50°C，再用硫酸調(diào)節(jié)PH值4.2;
[0058](d)噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度180°C，出風(fēng)溫度90°C。結(jié)果得到20g硫酸多粘菌素E2和9g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0059]本發(fā)明中純化物含量大于等于80%，甚至大于等于90%。本發(fā)明中凝膠技術(shù)工藝，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和El組分不造成任何破壞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:包括以下步驟: (a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣于凝膠介質(zhì)； (b)待步驟(a)完成后用有機(jī)溶劑洗脫，分段收集、合并含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液； (c)取步驟(b)中合并后的洗脫液，去除有機(jī)溶劑后用硫酸調(diào)節(jié)pH值； (d)待步驟(c)完成后噴霧干燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述凝膠介質(zhì)采用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述凝膠介質(zhì)的載樣量為30g/L-60g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述凝膠介質(zhì)的載樣量為優(yōu)選為30g/L-40g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成后用配置好的有機(jī)溶劑，以0.8?1.2BV/h的流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)用0.25%的磷鎢酸滴定有白色沉淀時(shí)開始收集，定時(shí)收集一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉淀;每組出樣小組均進(jìn)行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大于85%的出樣小組進(jìn)行合并。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:所述步驟(c)具體步驟為:取步驟(b)中合并后的洗脫液，采用真空薄膜蒸發(fā)法去除有機(jī)溶劑，其溫度為40-60 0C ；然后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3.4-4.4。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特征在于:步驟(d)中噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度130-190 °C，出風(fēng)溫度90-110 °C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟：(a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣于凝膠介質(zhì)；(b)待步驟(a)完成后用有機(jī)溶劑洗脫，分段收集、合并含硫酸多粘菌素E2和E1的洗脫液；(c)取步驟(b)中合并后的洗脫液，去除有機(jī)溶劑后用硫酸調(diào)節(jié)pH值；(d)待步驟(c)完成后噴霧干燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和E1組分的純化物。本發(fā)明中利用凝膠進(jìn)行操作，由于其屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和E1組分不造成任何破壞，所以最大程度的保護(hù)了多粘菌素E2和E1組分，其純化物含量可達(dá)90％。
【IPC分類】C07K7/62, C07K1/16
【公開號】CN105713074
【申請?zhí)枴緾N201610168114
【發(fā)明人】常國棟
【申請人】河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司