專利名稱：：黃鱔抗菌肽的制備工藝及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從動物中提取抗菌肽的方法，特別是一種黃鱔抗菌肽的制備工藝。本發(fā)明還涉及該制備工藝所得產(chǎn)物的用途。
背景技術：
：抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)，也稱為肽類抗生素(Peptedeantibiotics),是抗菌活性短肽的總稱，具有抗菌力強、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、可以中和細菌內(nèi)毒素、很難產(chǎn)生耐藥性等特點。其研究始于在惜古比天蠶蛹產(chǎn)生的抗菌活性多肽物質(zhì)既天蠶素(Cecr;^w)，隨后人們在動物、植物和微生物中相繼發(fā)現(xiàn)并分離獲得了具有類似性質(zhì)的活性多肽。水產(chǎn)動物的抗菌肽研究始于1988年，日本學者Nakamura等從亞洲鱟(rac/i^/ewWW&"tort")用酸提取法純化出鱟素(rac/^pk^)。后來在貝類、魚類中均有報到。但黃鱔抗菌肽至今尚未見報到。黃鱔，學名^fo"qpfen^a/6w，是我國主要經(jīng)濟水產(chǎn)品之一，營養(yǎng)成分豐富，具有"小暑黃鱔賽人參"之美譽，然而它生存于泥濘污溝卻不會發(fā)病，黃鱔養(yǎng)殖中也很少有發(fā)病的報到，說明其自身能夠產(chǎn)生抵御外源病菌的物質(zhì)，故本研究擬探討從黃鱔中分離純化抗菌肽的工藝流程，并分離純化黃鱔抗菌肽，進而開發(fā)利用黃鱔抗菌肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種新的、具有抑菌活性的黃鱔抗菌肽的制備工藝。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種黃鱔抗菌肽的制備工藝，其特點是，其步驟如下(1)黏液制備黃鱔放入水中排除體內(nèi)雜物后，將黃鱔分別置于標本缸中，撒適量氯化鈉于黃鱔體表刺激黃鱔蠕動，收集黃鱔皮膚黏液；(2)上清液制備將黃鱔皮膚黏液于4°C、12000rpm高速冷凍離心20min，取上清液，然后將上清液以厚度不超過2mm分裝于若干培養(yǎng)皿中，再用保鮮膜封蓋，-401:冷凍保存?zhèn)溆茫?3)干粉制備取-40。C冷凍保存24h以上的上述培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎若干個孔，即時用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲黃鱔皮膚黏液的干粉；(4)一次篩選稱取干粉5-10g，5-10mLPBS緩沖液溶解，-4"離心15min，取上清液為樣品；測定樣品A，；然后選用2.6cmX100cm層析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脫液，按常規(guī)方法用SephadexG-50裝柱后，以6s—滴的速度平衡柱子24h，將總OD為200-300的樣品滴加至SephadexG-50凝膠柱表面，讓樣品自然或6s—滴的速度流入SephadexG-50凝膠柱中；安裝好層析系統(tǒng)，以10s—滴的速度洗脫，自動收集器收集，得每管3mL的按序編號的收集管若干;測定各收集管中A，和A220，以收集管序號為橫坐標、A湖和A22o為縱坐標，制作分離圖譜，獲得4個分離峰，分別命名為MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV;(見圖1);(5)二次篩選采用抑菌圈法進行抑菌實驗篩選；實驗用指示菌為嗜水氣單胞菌(jera"。"ay孫(ira/m7(3)、禾古草芽孢桿菌(5acz7/uss"6"fc)、白色念珠菌(Ca"c/油a/6z'c<ms)、大腸桿菌(^Esc/zer/c//aco//)、金黃色葡萄球菌(Sto//^/ococcwflwrew力、鰻弧菌(F6n'ofl"gwz7arww)禾口魯克氏耳卩爾森菌reefer);將上述7種菌種制備成A6(M)=0.06的菌懸液，取100|aL涂布于LB培養(yǎng)基上，用微量移液器取20^L分離液浸潤濾紙，將濾紙片放于涂布菌懸液的培養(yǎng)基上；篩選得到對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV;(6)MAS-IV溶液透析:12000r/min,4。C離心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋(截留分子量3500)中，用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中間更換緩沖液l-2次；(7)MAS-IV離子交換層析選用12mmX200mm(實裝160mm)層析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.8)進行梯度洗脫，NaCl濃度從0%-100%，洗脫5個柱體積(108mL)，流速l.OOmL/min;根據(jù)BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)配套軟件顯示的分離峰，分別收集7個分離峰，并依次命名為MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV國7;(8)MAS-IV離子交換層析產(chǎn)物的濃縮將MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分別分裝于培養(yǎng)皿中，厚度不超過2mm，并用保鮮膜封蓋，置-40"冰箱冷凍；24h后取出培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎孔，即時用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲各分離峰干粉；(9)三次篩選采用步驟(5)中所述的方法進行再一次的篩選用抑菌實驗;用適量無菌水溶解上述各分離峰干粉制成樣品液；篩選得到MAS-IV-3、MAS-IV-4對嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌活性；最終得到目標產(chǎn)物MAS-IV-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽。本發(fā)明以黃鱔為研究對象，制備其皮膚黏液，經(jīng)SephadexG-50和DEAESepharoseFastFlow等生物化學分離純化技術獲得具有抗菌活性的多肽或蛋白，用抑菌圈法檢測抑菌活性。黃鱔皮膚黏液經(jīng)一次篩選所得到的MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV,抗菌實驗結(jié)果結(jié)果顯示對其中五種菌有抑菌效果。參照圖2-6可知MAS-I、MAS-II、MAS-III、MAS-IV都或多或少的對一種或幾種菌有抑菌效果。對MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV的抑菌效果進行對比，可以看出MAS-IV對圖中五種菌都有抑菌效果。所以對MAS-IV進一步分離篩選。將MAS-W經(jīng)DEAESepharoseFastFlow離子交換層析分離結(jié)果如圖7。共收集7個峰，命名為MAS-IV-l，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV曙5、MAS-IV-6和MAS-IV-7，為簡便起見，圖中分別標注為1、2、3、4、5、6、7。在本發(fā)明中，材料黃鱔購自連云港市水產(chǎn)品市場。實驗用指示菌嗜水氣單胞菌(爿era"o/my場(iro/m7a)、枯草芽孢桿菌(5ac/〃wssw&z7&)、白色念珠菌a/6/c<ms)、大腸桿菌(E^c/zm.c/n.aco//)、金黃色葡萄球菌)、鰻弧菌(J^n'o朋gw7aram)和魯克氏耶爾森菌(Fe^/m'"n^fe"。菌種均是申請人實驗室儲備。采用抑菌圈法進行抑菌實驗時，以無菌水為對照。以下是發(fā)明人以本發(fā)明目標產(chǎn)物MAS-W-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽所做的相關實驗。1、凝血實驗。取0.1mL雞血漿，加入10uL樣品?；靹蚝?，于37。C保溫5min，轉(zhuǎn)至室溫，加入6.25uL、0.4mol/L的CaCl2，觀察記錄凝血時間。結(jié)果表明在MAS-IV-3和MAS-IV-4中未檢測到凝血活性。2、溶血實驗。將新鮮雞血置于裝有檸檬酸鈉(最終濃度為0.38%)的離心管中離心(2000r/min、4°C、5min)。用生理鹽水洗至上清不再出現(xiàn)紅色為止。將洗滌好的紅細胞稀釋成2%的細胞懸浮液備用。取紅細胞懸浮液20yL，分別加MAS-W-3、MAS-IV-4溶液20uL(以無菌水代替樣品為對照)，用生理鹽水補足至1.0mL，于37。C的恒溫水浴鍋中保溫30min;4°C、2000r/min離心5min，上清液于540nm測吸光值。溶血活性與吸光值成正比。結(jié)果表明，MAS-W-3、MAS-W-4均有微弱的溶血活性。下表中的數(shù)值是540nm下的吸光值，從表中可以看出，其具有微弱的溶血活性。表l黃鱔皮膚黏液提取液離子交換層析分離峰溶血活性檢測<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、小白鼠痛覺測定實驗。實驗步驟..把恒溫水浴的水溫調(diào)解至55士0.5。C，取一個大燒杯置于恒溫水浴鍋中(燒杯底部一定要接觸水面)。左手輕輕抓住小白鼠背部，在將小白鼠放入燒杯內(nèi)的同時用秒表記時。記錄小白鼠自放入燒杯至添支撐足所需時間(s)，即該小白鼠的痛閾值。選用痛閾值在3—30s的小白鼠作為痛覺實驗對象。將上述合格的小白鼠分為2組，每組3只，每組分別腹腔注射MAS-IV-3、MAS-IV-4溶解液和生理鹽水各0.5mL。給藥30s后測定各組的痛閾值。若小白鼠在熱板上停留60s仍無疼痛反應，應予取出，其痛閾值以60s計算。將各組每個小白鼠所測的痛閾值按王心如等2003年出版的《毒理學實驗方法與技術》提出的公式計算用藥后痛閾值提高的百分率，并考察樣品對小白鼠痛覺功能的影響。結(jié)果表明MAS-IV-3、MAS-IV-4對小白鼠的痛覺有影響即具有鎮(zhèn)痛作用。表2.注射樣品前9只小白鼠的痛閾值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性檢測。由于MAS-IV-3樣品較少，以后相關實驗只對MAS-IV-4進行研究。在1.5mL比色皿中依次加入Tris-HCl緩沖液(0.05mol/LpH7,8)410、胰蛋白酶(Tripsin)50、MAS-IV-4溶液20^L，迅速用1cm2的封口膜封口并上下顛倒混勻，室溫下靜置5min。再加絲氨酸蛋白酶顯色底物NBLAN(苯甲酰一L-精氨酸硝酸還原酶氫氯化物)40|iL，迅速置入BioTekSynergyHT酶標儀，設置振蕩10s，每30s檢測一次A4。5，總計檢測3min。以Tris-HCl緩沖液替代MAS-IV-4溶液為對照，通過比較AA值檢測絲氨酸酶抑制劑活性。結(jié)果如圖5所示，可見MAS-IV-4趨勢線的斜率略小于對照，表明MAS-IV-4有微弱的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。5、黃鱔抗菌肽MAS-IV-4的純度鑒定。采用2種方法對抗菌肽MAS-IV-4的純度進行鑒定。一是Trcine-SDS-PAGE電泳，并做了如下改進。1)膠濃度為15%、交聯(lián)度為5%;2)內(nèi)槽加入負極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，形成Trcine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)；3)分離膠中經(jīng)恒流30mA電泳3h，固定1h，染色2h和脫色。結(jié)果表明MAS-W-4有較高純度。二是熔點法測定，用上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)的X-4顯微熔點儀測定，結(jié)果表明MAS-IV-4熔點在208"C2irC，也說明該樣品有較高純度。圖l為一次篩選所得分離圖譜(其中圖譜1為A22。；圖譜2為A，)；圖2為一次篩選所得分離峰的一種抑菌(嗜水氣單胞菌)效果圖3為一次篩選所得分離峰的一種抑菌(枯草芽孢桿菌)效果圖4為一次篩選所得分離峰的一種抑菌(白色念珠菌)效果圖；圖5為一次篩選所得分離峰的一種抑菌(金黃色葡萄球菌)效果圖；圖6為一次篩選所得分離峰的一種抑菌(大腸桿菌)效果圖；圖7為MAS-IV經(jīng)離子交換層析分離圖譜；圖8為MAS-IV離子交換層析分離峰的一種抑菌(嗜水氣單胞菌)效果圖；圖9為MAS-W離子交換層析分離峰的一種抑菌(枯草芽孢桿菌)效果圖；圖10為MAS-IV離子交換層析分離峰的一種抑菌(金黃色葡萄球菌)效果圖11為絲氨酸蛋白酶抑制劑活性檢測結(jié)果圖(注圖中虛線為對照，實線MAS-IV-4)。具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一歩地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實施例l。一種黃鱔抗菌肽的制備工藝，其步驟如下(1)黏液制備黃鱔放入水中排除體內(nèi)雜物后，將黃鱔分別置于標本缸中，撒適量氯化鈉于黃鱔體表刺激黃鰭蠕動，收集黃鱔皮膚黏液；(2)上清液制備將黃鱔皮膚黏液于4°C、12000rpm高速冷凍離心20min，取上清液，然后將上清液以厚度不超過2mm分裝于若干培養(yǎng)皿中，再用保鮮膜封蓋，-4(TC冷凍保存?zhèn)溆茫?3)干粉制備取-4(TC冷凍保存24h以上的上述培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎若干個孔，即時用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲黃鱔皮膚黏液的干粉；(4)一次篩選稱取干粉5-10g，5-10mLPBS緩沖液溶解，-4"離心1.5min，取上清液為樣品；測定樣品A28o;然后選用2.6cmX100cm層析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脫液，按常規(guī)方法用SephadexG-50裝柱后，以6s—滴的速度平衡柱子24h，將總OD為200-300的樣品滴加至SephadexG-50凝膠柱表面，讓樣品自然或6s—滴的速度流入S印hadexG-50凝膠柱中；安裝好層析系統(tǒng)，以10s—滴的速度洗脫，自動收集器收集，得每管3mL的按序編號的收集管若干;測定各收集管中A，和A220，以收集管序號為橫坐標、八280和八22()為縱坐標，制作分離圖譜，獲得4個分離峰，分別命名為MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV;參照圖l;(5)二次篩選采用抑菌圈法進行抑菌實驗篩選；實驗用指示菌為嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和魯克氏耶爾森菌；將上述7種菌種制備成A,=0.06的菌懸液，取100涂布于LB培養(yǎng)基上，用微量移液器取20分離液浸潤濾紙，將濾紙片放于涂布菌懸液的培養(yǎng)基上；篩選得到對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-W;參照圖2-6;(6)MAS-IV溶液透析:12000r/min，4。C離心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋(截留分子量3500)中，用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中間更換緩沖液1-2次；(7)MAS-IV離子交換層析選用12mmX200mm(實裝160mm)層析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.8)進行梯度洗脫，NaCl濃度從0%-100%，洗脫5個柱體積(108mL)，流速1.00mL/min;根據(jù)BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)配套軟件顯示的分離峰，分別收集7個分離峰，并依次命名為MAS-W-1，MAS-W-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7;參照圖7;(8)MAS-IV離子交換層析產(chǎn)物的濃縮將MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分別分裝于培養(yǎng)皿中，厚度不超過2mm，并用保鮮膜封蓋，置-40'C冰箱冷凍；24h后取出培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎孔，即時用真空冷凍千燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲各分離峰干粉；(9)三次篩選采用步驟(5)中所述的方法進行再一次的篩選用抑菌實驗;用適量無菌水溶解上述各分離峰干粉制成樣品液；篩選得到MAS-W-3、MAS-IV-4對嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌活性；最終得到目標產(chǎn)物MAS-IV-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽；參照圖8-10。權(quán)利要求1、一種黃鱔抗菌肽的制備工藝，其特征在于，其步驟如下(1)黏液制備黃鱔放入水中排除體內(nèi)雜物后，將黃鱔分別置于標本缸中，撒適量氯化鈉于黃鱔體表刺激黃鱔蠕動，收集黃鱔皮膚黏液；(2)上清液制備將黃鱔皮膚黏液于4℃、12000rpm高速冷凍離心20min，取上清液，然后將上清液以厚度不超過2mm分裝于若干培養(yǎng)皿中，再用保鮮膜封蓋，-40℃冷凍保存?zhèn)溆茫?3)干粉制備取-40℃冷凍保存24h以上的上述培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎若干個孔，即時用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲黃鱔皮膚黏液的干粉；(4)一次篩選稱取干粉5-10g，5-10mLPBS緩沖液溶解，-4℃離心15min，取上清液為樣品；測定樣品A280；然后選用2.6cm×100cm層析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脫液，按常規(guī)方法用SephadexG-50裝柱后，以6s一滴的速度平衡柱子24h，將總OD為200-300的樣品滴加至SephadexG-50凝膠柱表面，讓樣品自然或6s一滴的速度流入SephadexG-50凝膠柱中；安裝好層析系統(tǒng)，以10s一滴的速度洗脫，自動收集器收集，得每管3mL的按序編號的收集管若干；測定各收集管中A280和A220，以收集管序號為橫坐標、A280和A220為縱坐標，制作分離圖譜，獲得4個分離峰，分別命名為MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV；(5)二次篩選采用抑菌圈法進行抑菌實驗篩選；實驗用指示菌為嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和魯克氏耶爾森菌；將上述7種菌種制備成A600＝0.06的菌懸液，取100μL涂布于LB培養(yǎng)基上，用微量移液器取20μL分離液浸潤濾紙，將濾紙片放于涂布菌懸液的培養(yǎng)基上；篩選得到對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV(6)MAS-IV溶液透析12000r/min，4℃離心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋中，用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中間更換緩沖液1-2次；(7)MAS-IV離子交換層析選用12mm×200mm層析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，NaCl濃度從0％-100％，洗脫5個柱體積，流速1.00mL/min；根據(jù)BiologicDuoflow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)配套軟件顯示的分離峰，分別收集7個分離峰，并依次命名為MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7；(8)MAS-IV離子交換層析產(chǎn)物的濃縮將MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分別分裝于培養(yǎng)皿中，厚度不超過2mm，并用保鮮膜封蓋，置-40℃冰箱冷凍；24h后取出培養(yǎng)皿，在封蓋保鮮膜上扎孔，即時用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥濃縮，獲各分離峰干粉；(9)三次篩選采用步驟(5)中所述的方法進行再一次的篩選用抑菌實驗；用適量無菌水溶解上述各分離峰干粉制成樣品液；篩選得到MAS-IV-3、MAS-IV-4對嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌活性；最終得到目標產(chǎn)物MAS-IV-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽。全文摘要本發(fā)明是一種黃鱔抗菌肽的制備工藝，其特點是，其步驟如下黏液制備黃鱔放入水中排除體內(nèi)雜物后，將黃鱔分別置于標本缸中，撒適量氯化鈉于黃鱔體表刺激黃鱔蠕動，收集黃鱔皮膚黏液；將黃鱔皮膚黏液制備上清液、干粉，再進行一次篩選，獲得4個分離峰；然后再進行二次篩選，篩選得到對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV；然后對MAS-IV進行三次篩選，篩選得到最終得到目標產(chǎn)物MAS-IV-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽；MAS-IV-3、MAS-IV-4黃鱔抗菌肽對嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑菌活性。文檔編號C07K1/18GK101348519SQ20081019586公開日2009年1月21日申請日期2008年9月5日優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日發(fā)明者安賢惠,李聯(lián)泰,浦寅芳申請人:淮海工學院